生物制品的制備

關(guān)于生物制品的制備（1）原料選擇

原料的選擇原則：

①有效成分含量高，新鮮；②原料來(lái)源豐富，產(chǎn)地較近；③原料中雜質(zhì)含量少；④原料成本低等。第2頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天原料的選擇注意事項(xiàng)：

①植物原料生長(zhǎng)的季節(jié)性；②微生物原料的對(duì)數(shù)期；③動(dòng)物原料的年齡與性別。第3頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）原料的預(yù)處理與保存：

①動(dòng)物原料：采集后要立即處理，去除結(jié)締組織、脂肪組織等，并迅速冷凍貯存。②植物原料：要擇時(shí)采集并就地去除不用的部分，保鮮處理；③微生物原料：要及時(shí)將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分開(kāi)，進(jìn)行保鮮處理。

第4頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天原料的保存方法主要有：①冷凍法。該方法適用于所有生物原料。常用-40℃速凍。②有機(jī)溶劑脫水法。常用的有機(jī)溶劑是丙酮。該法適用于原料少而價(jià)值高、有機(jī)溶劑對(duì)活性物質(zhì)沒(méi)有破壞作用的原料，如腦垂體等。③防腐劑保鮮。常用乙醇、苯酚等。該法適用于液體原料，如發(fā)酵液、提取液等。

第5頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、生物制品的提?。╡xtraction）

(1)生物組織與細(xì)胞的破碎（obtrudeoftissueandcell）：生物制品大部分存在于生物組織或細(xì)胞中，要提高提取率，破碎過(guò)程是非常重要的。常用的破碎方法：①磨切法，該法屬于機(jī)械破碎方法，設(shè)備有組織搗碎機(jī)、膠體磨、勻漿器、勻質(zhì)機(jī)、球磨機(jī)、乳缽等。②壓力法，有加壓與減壓兩種，常用的法蘭西壓釜使用效果良好。第6頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天③反復(fù)凍融法，設(shè)備簡(jiǎn)便，活性保持好，但用時(shí)較長(zhǎng)。④超聲波振蕩破碎法，該方法破碎效果較好，但由于局部發(fā)熱，對(duì)活性有損失。⑤自溶法或酶解法，用得較少。第7頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）提?。╡xtraction）

生物組織與細(xì)胞破碎后要立即進(jìn)行提取。提取時(shí)，首先要根據(jù)活性物質(zhì)的性質(zhì)，

①選擇提取試劑。提取試劑主要有：水、緩沖溶液、鹽溶液、乙醇、其他有機(jī)溶劑（如氯仿、丙酮等）。

②考慮提取溶劑的用量及提取次數(shù)、提取時(shí)間。

③注意提取的溫度、pH、變性劑等因素。第8頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、分離純化的基本過(guò)程第9頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、分離純化的基本技術(shù)

(1)分離純化技術(shù)應(yīng)滿(mǎn)足的要求①技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；

②選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，達(dá)到較高純化倍數(shù)；

③收率要高；

④兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理或調(diào)整；

⑤分離純化過(guò)程要快，能夠滿(mǎn)足高生產(chǎn)率的需求。

第10頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.細(xì)胞破碎與固液分離

（1）細(xì)胞收集常用離心分離的方法；膜過(guò)濾法也逐漸得到廣泛應(yīng)用。（2）細(xì)胞破碎有機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法。（3）固液分離分離細(xì)胞碎片是比較困難的，可以用離心、膜過(guò)濾或雙水相分配的方法，使細(xì)胞碎片分配在一相（通常為下相）而分離，同時(shí)也起部分純化作用。第11頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.目的產(chǎn)物的分離純化

分離純化主要依賴(lài)色譜分離方法。色譜技術(shù)是下游精制階段的常用手段，該法優(yōu)點(diǎn)是具有多種多樣的分離機(jī)制，設(shè)備簡(jiǎn)單，便于自動(dòng)化控制和分離過(guò)程中無(wú)發(fā)熱等有害效應(yīng)。色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過(guò)濾色譜、高壓液相色譜等。

第12頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)各類(lèi)生物制品的分離純化方法蛋白質(zhì)核酸糖類(lèi)脂類(lèi)氨基酸第13頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、蛋白質(zhì)類(lèi)制品的分離純化方法（Isolationanddepurationofproteinproduction）

包括蛋白質(zhì)、多肽和酶類(lèi)等藥物。分離純化方法有：

(1)沉淀法（precipitation）：蛋白質(zhì)、酶的初步純化往往用沉淀法。原理是使蛋白質(zhì)膠體顆粒破壞，從而沉淀蛋白質(zhì)。常用的有鹽析法（saltingout）、有機(jī)溶劑沉淀法（organicsolventprecipitation）、等電點(diǎn)沉淀法（isoelectricprecipitation）、與靶物質(zhì)結(jié)合沉淀法（如抗體—抗原）（targetbandingprecipitation）等。第14頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)按分子大小分離的方法：有超濾法（ultrafiltration）和透折法（dialysis）（即膜分離方法）、凝膠層析法（gelchromatography）、超速離心法（ultracentrifugation）等。其中膜分離法可用于生物大分子物質(zhì)的濃縮、分級(jí)和脫鹽。

第15頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)按分子所帶電荷進(jìn)行分離的方法氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶均為兩性電解質(zhì)。它們具有等電點(diǎn)，在離開(kāi)等電點(diǎn)的pH時(shí)便會(huì)帶正或負(fù)電荷。例如某蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為7.0，當(dāng)溶液pH為4.0時(shí)，分子則帶有正電荷。由于具有該性質(zhì)，利用帶電性質(zhì)進(jìn)行分離是極其有效的方法。利用電學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分離的方法有離子交換柱層析法（ion-exchangechromatography）、電泳法（electrophoresis）、等電聚焦法（isoelectricfocusing）等。第16頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）親和層析法（affinitychromatography）大部分生物活性物質(zhì)都有其作用的靶物質(zhì)，如酶與底物（或抑制劑）、抗原與抗體、激素與受體等，它們之間有特異的親合作用，利用該性質(zhì)設(shè)計(jì)的特異層析分離技術(shù)稱(chēng)為親和層析。親和層析分離專(zhuān)一性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，是當(dāng)前應(yīng)用很廣泛的分離方法之一。另外，最近出現(xiàn)的新方法還有疏水層析（hydrophobicinteractionchromatography）等。

第17頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、核酸類(lèi)制品的分離純化方法（Isolationanddepurationofnucleicacid

）核酸類(lèi)藥物生產(chǎn)方法主要有提取法和發(fā)酵法。提取法生產(chǎn)DNA和RNA，先提取核酸和蛋白質(zhì)復(fù)合物，再解離核酸與蛋白質(zhì)，然后分離RNA與DNA。發(fā)酵法主要用于生產(chǎn)單核苷酸。第18頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、糖類(lèi)制品的分離純化方法（Isolationanddepurationofsugar

）

由于各種糖類(lèi)制品的性質(zhì)和原料來(lái)源不同，沒(méi)有統(tǒng)一規(guī)范的提取和純化工藝。這里只介紹多糖和粘多糖的一般分離純化方法。第19頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）提取方法（extraction）

非降解法適用于從含一種粘多糖的動(dòng)物組織中提取粘多糖，提取采用的溶劑是水或鹽溶液。

降解法（degradation）適用于從組織中提取結(jié)合比較牢固的粘多糖（mucoitin）。如從軟骨中分離提取硫酸軟骨素（chondroitinsulfate），就是用堿處理進(jìn)行降解。又如用酶處理法可提取與蛋白質(zhì)結(jié)合的多糖。第20頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（2）分離方法（isolation）

常用的分離方法是沉淀法和離子交換層析法。乙醇沉淀法（alcoholprecipitation）：是從提取液中沉淀多糖的最簡(jiǎn)易方法，也適用于分級(jí)分離。4-5倍體積的乙醇可以使任何結(jié)締組織中的粘多糖完全沉淀。用季銨化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚陰離子能與某些陽(yáng)離子表面活性劑結(jié)合成不溶于水的鹽，如十六烷基三甲基銨（CTA）等。

第21頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天

離子交換層析法（ionexchangechromatagraphy)：粘多糖的聚陰離子能夠很好地被陰離子交換劑吸附和分離，如DowexI-X2（商品名）離子交換樹(shù)脂、DEAE-離子交換纖維素（二乙胺乙基）等。洗脫可用NaC1溶液進(jìn)行梯度洗脫。第22頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、脂類(lèi)制品的分離純化方法（isolationanddepurationoflipoid）（1）提取方法（extraction）脂類(lèi)自然狀態(tài)下是以結(jié)合形式存在的。非極性脂是與其他脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合的。提取脂質(zhì)就是要選擇適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)破壞這種結(jié)合鍵，將脂質(zhì)溶解出來(lái)。常用的溶劑有組合溶劑，醇是其中的主要成分，此外還有氯仿、甲醇、水等。第23頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）純化方法（depuration）

沉淀法(precipitation)：由于不同脂質(zhì)在丙酮中溶解度不同，故常用它進(jìn)行沉淀。吸附層析法(adsorptionchromatography)：常用吸附劑有硅膠、氧化鋁等。它是通過(guò)極性和離子力等把各種化合物結(jié)合到固體吸附劑上。洗脫一般是采用極性逐漸增大的洗脫液來(lái)進(jìn)行，非極性的先流出，極性的后流出。第24頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換層析法（Ionexchangechromatography）:脂質(zhì)分子的存在有非解離、兩性離子和酸式解離三種狀態(tài)。根據(jù)它們?cè)谝欢╬H條件下的解離情況，選擇適當(dāng)?shù)碾x子交換劑可將它們提純。如TEAE—纖維素對(duì)分離脂肪酸和膽汁酸等特別有效。第25頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、氨基酸類(lèi)制品的分離純化方法

（isolationanddepurationofAa）（1）氨基酸的生產(chǎn)方法（productionofAa）蛋白質(zhì)水解法（proteinhydrolysis）：水解法有酸水解（acidhydrolysis）、堿水解（basehydrolysis）和酶水解（enzymehydrolysis）三種。

第26頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天

①用鹽酸水解為常用方法，其優(yōu)點(diǎn)是水解迅速、完全，產(chǎn)物全部是L—型氨基酸，缺點(diǎn)是色氨酸全部被破壞，絲氨酸等部分被破壞。②堿水解法易產(chǎn)生消旋作用，較少應(yīng)用。③酶水解法水解不夠完全。第27頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天發(fā)酵法（fermentation）：菌株經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，從培養(yǎng)液中提純氨基酸。化學(xué)合成與酶促合成法化學(xué)合成法一般得到的是DL—型氨基酸，尚需要對(duì)異構(gòu)體拆分；酶促合成法也是酶工程在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用，優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)工藝簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少和易提純等。第28頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）氨基酸的分離方法（isolationofAa）

有沉淀法（percipitation）、吸附法（adsorption）和離子交換法（ion-exchange)

。沉淀法(percipitation)：根據(jù)形成沉淀的原理不同分為兩種：①是依據(jù)不同氨基酸在水中或其他溶劑中的溶解度差異進(jìn)行沉淀分離。②是用特殊試劑沉淀某種氨基酸，如用鄰二甲苯-4-磺酸與亮氨酸形成不溶性鹽沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游離出來(lái)。第29頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天

吸附法(adsorption)：這是利用吸附劑根據(jù)氨基酸吸附力的差異進(jìn)行氨基酸分離的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分離就是利用活性炭對(duì)其吸附的原理。

離子交換法（ion-exchange)：氨基酸是兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下，不同氨基酸帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)是不相同的，因此在離子交換劑上被吸附的強(qiáng)度不同。常用的離子交換劑為強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，洗脫主要用pH梯度洗脫。第30頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)人體來(lái)源生物制品制備實(shí)例

（Exampleofbio-preparationapplicationtohuman）一、人血漿白蛋白制劑的制備（preparationofhumanbloodplasmaalbumin）（1）結(jié)構(gòu)和性質(zhì)（structureandcharacter）人血是一種紅色混濁的、具有一定腥味與粘滯性的液體。用適當(dāng)?shù)目鼓齽┏テ渲械挠行纬煞郑ㄈ缂t血球）而得到淡黃色、半透明的液體叫血漿。第31頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天血漿中除含有大量的水分以外，還含有血漿蛋白等溶質(zhì)。白蛋白（albumin）又稱(chēng)清蛋白，白蛋白是血漿蛋白中含量最高（3.8～4.8%）、分子量最小、分子數(shù)最多的一類(lèi)蛋白質(zhì)。白蛋白對(duì)治療因失血、創(chuàng)傷、燒傷等引起的休克，腦水腫和大腦損傷性所致的腦壓增高，防止低蛋白血癥，肝硬化或者由腎病引起的水腫與腹水等嚴(yán)重疾病具有良好療效。第32頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天白蛋白為單鏈分子，由584個(gè)氨基酸殘基組成，N端為天門(mén)冬氨酸，C端為亮氨酸，分子量為6.6×104，在離子強(qiáng)度為0.15時(shí)，pI為4.7，易溶于水，在60%硫酸銨飽和度以上沉淀。對(duì)酸較穩(wěn)定，受熱變性。從人體中分離的白蛋白有兩種：一種是從健康人血漿中分離制得的人血清白蛋白，另一種是從健康產(chǎn)婦胎盤(pán)中分離制得的胎盤(pán)白蛋白。第33頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天

血（無(wú)抗凝劑）→自然凝固→分離出血清（無(wú)纖維蛋白酶原、凝血因子等）血+混合抗凝劑草酸銨草酸鉀離心上清血漿總蛋白：6.2-7.9%白蛋白：3.8-4.8%水：90-92%（現(xiàn)常用肝素、檸檬酸鈉）第34頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）工藝路線(xiàn)（圖3-1）

圖3-1白蛋白生產(chǎn)工藝路線(xiàn)利凡諾,NaHCO3pH8.6,離心分離絡(luò)合物蒸餾水，NaCl，HCl弱酸性，40℃，離心離心液濃縮超濾濃縮液滅活病毒

65℃，1h；60℃，10h熱處理液除菌除菌過(guò)濾白蛋白液干燥冷凍干燥白蛋白去雜蛋白人血漿（%）第35頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）工藝要點(diǎn)

①絡(luò)合對(duì)于絡(luò)合所要求的pH值，可以略高些，這樣，白蛋白絡(luò)合完全，絡(luò)合物形成一個(gè)相當(dāng)硬的塊，傾倒上清液方便，損失少。但不能太高，以防絡(luò)合血漿中的其它蛋白，影響解離與白蛋白制劑的純度。若pH值偏低，絡(luò)合不完全，絡(luò)合物松軟，甚至成湯狀，不利于傾去上清液。血漿攪拌用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至8.5-8.7之間，緩慢加入與血漿等體積的2.3%利凡諾溶液，邊加邊攪拌，充分絡(luò)合后。靜置2~4h，分離上清與絡(luò)合物沉淀。第36頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天加入2.3%利凡諾溶液比加入5%利凡諾溶液的效果好？因?yàn)榧?%利凡諾溶液常造成滅活時(shí)白蛋白部分變性或者分裝困難。加入2.3%利凡諾溶液的體積一般不超過(guò)血漿體積的一半。這可能是加入利凡諾溶液除去了解離物中過(guò)多的Cl-而澄清，或者是加入的利凡諾（過(guò)量）使白蛋白與利凡諾的絡(luò)合物反溶，從而使造成混濁的物質(zhì)消失，達(dá)到澄清的目的。第37頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天②解離生產(chǎn)中要嚴(yán)格控制溶液的溫度。25℃左右室溫，絡(luò)合物形成一個(gè)硬塊，利于去上清和解離。溫度太低，雖然不影響絡(luò)合，但絡(luò)合物呈稀糊狀，傾倒上清液時(shí)常會(huì)丟失部分絡(luò)合物，而且絡(luò)合物內(nèi)殘存較多的利凡諾的水溶液。解離溫度要維持在40℃左右，是解離反應(yīng)的最適溫度。第38頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天解離液的pH值在1.28~1.45之間，解離效果良好。絡(luò)合物中加入解離液并攪拌均勻后，將解離后混合溶液pH值控制在6.0左右較理想。以解離后解離混合溶液pH值決定加入解離液的體積。解離后解離混合液的pH值高于6.5時(shí)，表明加入的解離液少了，有部分絡(luò)合物未被解離開(kāi)；低于5.85，表明加入的解離液多了，解離過(guò)度。這兩種情況下，解離效果均不佳。第39頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天在沉淀中加約二分之一血漿體積的滅菌蒸餾水解離所得到的絡(luò)合物沉淀，將解離混合物溶液用0.5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至5.5-6.0，加NaCl至0.15%～0.2%，充分?jǐn)嚢琛?0℃過(guò)夜解離（8-10h）。第40頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天在生產(chǎn)過(guò)程中常發(fā)現(xiàn)，由于解離效果差，從而不能使生產(chǎn)過(guò)程順利進(jìn)行。方法：（1）加入活性炭法：在解離效果略差，即能夠較順利地離心，得到部分或全部稍混濁的濾液，但不能正常進(jìn)行壓濾時(shí)，加入適當(dāng)?shù)幕钚蕴坑跒V液中，攪攔均勻后，立即離心，由于活性炭吸附溶液中粘稠物質(zhì)，形成大顆粒，經(jīng)離心可以除去雜質(zhì)，起到澄清的作用。第41頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）加入利凡諾法：在解離時(shí)，在由加入的鹽酸或（和）鹽過(guò)多而造成解離物的濾液混濁的情況下，變性前后，向解離物中加入適量的利凡諾溶液均會(huì)起到澄清的作用，而回收率卻不會(huì)降低太多。變性前加利凡諾溶液比變性后加利凡諾溶液的效果顯著。由于前者在變性過(guò)程中反應(yīng)溫度升高了，反應(yīng)時(shí)間增加了。第42頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）多次絡(luò)合法如果解離效果極差，用以上兩種方法處理都難以達(dá)到澄清的目的，那只有采取多次絡(luò)合法，即在盡量除去解離物中粘稠物質(zhì)后，將其pH值調(diào)至9.0~9.2，加入適量的5%利凡諾溶液，進(jìn)行重絡(luò)合，繼爾重解離，一般都會(huì)得到很理想結(jié)果。如果仍然出現(xiàn)解離不良的現(xiàn)象，重復(fù)以上處理過(guò)程，直到得到滿(mǎn)意的結(jié)果。這種方法使產(chǎn)品純度高，外觀變黃（棕），同時(shí)也使成本提高，回收率降低。第43頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天③去雜蛋白：白蛋白具有生物活性，凡是使蛋白質(zhì)變性的溫度都會(huì)使白蛋白變性。65℃條件下變性1h，離心分離出上清液。④熱處理：在60±0.5℃條件下處理10h，滅活病毒。

⑤檢驗(yàn)方法：凍干品白色疏松物體。白蛋白含量占95%以上，水分<1%，水溶后pH為6.6-7.2，硫酸銨殘量<0.01%，細(xì)菌學(xué)和熱原質(zhì)檢測(cè)合格。第44頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、尿激酶（urokinase）的制備（1）天然尿激酶是由兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成。是絲氨酸蛋白酶，絲氨酸、組氨酸是活性中心必需的氨基酸。該酶底物專(zhuān)一性很強(qiáng)，血纖維蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白質(zhì)底物，作用于Arg-Val鍵上，使纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶。（2）尿激酶的pI為8-9。溶液狀態(tài)不穩(wěn)定。用于治療各種新血栓形成或血栓梗塞疾病。

第45頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）工藝流程（圖3-2）男性尿

沉淀10℃下，pH8.5上清尿液酸化pH5.0-5.5酸化尿吸附硅藻土，5℃硅藻土吸附物洗滌5℃，水硅藻土柱洗脫0.02%氨水，0.1mol/LNaCl洗脫液去熱源、色素DEAE-SephadexA50柱，pH8.0,（二乙氨乙基葡聚糖）流出液（活性部分）濃縮羧甲基纖維素（CMC柱，pH4.2)CMC柱洗脫（HAC-NaAC)NH3+NaCl,pH11.5-11.8洗脫液透析H2O,4℃透析液凍干成品圖3-2尿激酶生產(chǎn)工藝路線(xiàn)第46頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）工藝要點(diǎn)①收尿：男性尿，8h內(nèi)處理。調(diào)尿液pH6.5以下。②硅藻土吸附：加入1%的硅藻土，5℃下攪拌吸附1h。③洗脫：硅藻土吸附物用5℃冷水洗滌后裝柱，當(dāng)洗脫液由清變渾時(shí)開(kāi)始收集。④除熱原、色素：收集液用飽和NaH2PO4，調(diào)pH8.0，加NaCl調(diào)電導(dǎo)至22M/Ω，過(guò)DEAE-SephadexA50層析柱，收集流出活性部分。第47頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑤CMC濃縮：流出液用1mol/LHAc調(diào)至pH4.2，用蒸餾水調(diào)電導(dǎo)至16-17M/Ω，通過(guò)CM-C層析柱。用10倍體積的pH4.2的HAC-NaAc緩沖液洗滌柱床。洗后用0.1%氨水0.1mol/LNaCl溶液洗脫尿激酶。收集活性組分，雜質(zhì)被吸附。⑥產(chǎn)品質(zhì)量：無(wú)色澄清液或白色凍干粉末。酶活力>15000IU/mg蛋白質(zhì)。第48頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、絨膜促性激素（HCG）的制備（1）HCG的性質(zhì)（characterofHCG）HCG是一種糖蛋白，由α、β兩亞基組成，易溶于水，pI為3.2-3.3。HCG由胎盤(pán)滋養(yǎng)層合體細(xì)胞所分泌。婦女妊娠45-70天，尿中HCG含量可達(dá)30.000-50.000IU/24h。治療女性不育癥，神經(jīng)性皮炎。男性性功能過(guò)低癥和隱睪癥，子宮出血和習(xí)慣性流產(chǎn)。第49頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天

圖3-3HCG生產(chǎn)工藝路線(xiàn)孕婦尿[粗制]尿：苯甲酸：乙醇/1：0.075：5）用HCl調(diào)pH4-5HCG(粗品）提取NaACpH4.8提取液透析水，5℃以下透析內(nèi)液吸附（CMSepharoseCI-6B）羧甲基瓊脂糖凝膠吸附后交換劑洗滌Ⅰ，Ⅱ峰NaAC,pH4.8,pH5.9洗滌后交換劑洗脫NaAC,pH8.5洗脫液冷凍干燥

—30℃HCG精品

溶解蒸餾水，10℃以下HCG溶液透析pH6.8,5℃以下透析內(nèi)液吸附羥基磷灰石，pH6.8吸附物解吸0.5mmol/L,1.0mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS),pH6.8解吸液干燥—30℃HCG純品（2）HCG生產(chǎn)工藝路線(xiàn)第50頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）工藝要點(diǎn)①吸附粗品：HCl調(diào)孕婦尿至pH4-5，加苯甲酸—乙醇飽和液（孕婦尿：苯甲酸乙醇飽和液：乙醇=1:0.075:5）攪拌1h靜置2-3h，過(guò)濾，棄濾液，得吸附物。在攪拌下加入95%乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮狀沉淀產(chǎn)生，靜置過(guò)夜，離心，沉淀用95%乙醇和丙酮洗滌，干燥得粗制品。第51頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天②提?。杭?0倍量的4℃1/15mol/L、pH4.8醋酸鹽緩沖液，攪拌4h，離心，取上清液。沉淀再提取2h。合并兩次提取液，棄去沉淀。③離子交換層析：CM-Sepharose柱用0.01mol/L的醋酸鹽緩沖液平衡后樣品上柱。依次用pH4.8、0.01mol/L的醋酸鹽緩沖液和pH5.9、0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌出兩個(gè)峰（雜質(zhì)）。再用pH8.5、0.2mol/L的醋酸鹽緩沖液洗脫，得到的第3峰即為HCG。第52頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天④羥基磷灰石柱層析：柱用pH6.8、0.5mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡。樣品用pH6.8、0.5mmol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行層析上柱。洗脫先用pH6.8、0.5mmol/L再用pH6.81.0mmol/L的磷酸鹽緩沖液。得到I、II活性峰。然后冷凍干燥。HCG純品的比活性為10,000-12,000IU/mg蛋白質(zhì)。

第53頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、白細(xì)胞介素-2（IL-2）的制備

（1）性質(zhì)：由活化的淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的，糖蛋白有一個(gè)鏈內(nèi)二硫橋（58位，105位）。等電點(diǎn)為pH6.5。（2）工藝路線(xiàn)（圖3-4）

誘生白細(xì)胞培養(yǎng)液0.4mol/LNaCl,PBS,pH6.5UltrogelACA44柱，pH7.6圖3-4為IL-2生產(chǎn)工藝路線(xiàn)人血白細(xì)胞誘生雞瘟病毒，絲裂原培養(yǎng)液，37℃，CO2,孵育[滅活病毒]HCl,pH2.0-2.5；NaOH,pH7.2-7.4上清液硫酸胺分級(jí)（0.35飽和度）離心[去變性雜蛋白]上清液硫酸胺沉淀（0.85飽和度）離心沉淀除鹽10mmol/L磷酸鈉緩沖液，PBS透析，pH6.5透析內(nèi)液瓊脂糖Sepharose4B,pH6.5親和層析親和層析載體Ⅰ洗滌親和層析載體Ⅱ解吸1.0mol/LNaCl,PBS,pH6.5IL-2組分凝膠層析凝膠載體0.2mol/LTris-HCl,含0.1%PEG,2%正丁醇，0.5mol/L甘氨酸，pH7.6洗脫IL-2[去變性雜蛋白]第54頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）工藝要點(diǎn)

①誘生：刺激人外周血白細(xì)胞，37℃培養(yǎng)。②病毒滅活和固液分離：HCl調(diào)節(jié)pH再用NaOH調(diào),除去變性雜蛋白。③分級(jí)沉淀：加飽和硫酸銨溶液至0.35飽和度，4℃靜置24h，離心，收集沉淀。④除鹽：除沉淀溶于pH6.5、10mmol/L的磷酸鈉緩沖液（PBS）中（內(nèi)含2%（g/100mL）正丁醇,0.15mol/LNaCl）。用pH6.5的10mmol/LPBS透析24h（更換5次透析外液）。第55頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑤藍(lán)色瓊脂糖層析：透析內(nèi)液通過(guò)Sepharose4B層析柱，用200mL平衡柱緩沖液洗去不吸附蛋白，再用含0.4mol/LNaCl的PBS液洗滌親和柱，最后用含1.0mol/LNaCl的PBS液解吸IL-2活性組分。⑥凝膠層析：活性組分經(jīng)超濾濃縮，上UltrogelACA44層析柱，柱用含0.1%聚乙二醇MW6000的2%正丁醇和pH7.6的0.5mol/L甘氨酸的0.2mol/LTris-HCl洗脫，得IL-2。

第56頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、人體來(lái)源藥物的研究前景（prospect）人體來(lái)源的原料雖只限于血液、胎盤(pán)、尿液、毛發(fā)等有限幾種，但利用前景很廣闊。1、可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品

exploitationofnewproductio）（1）血液的利用，血漿蛋白可分離為I-V5個(gè)成分。目前僅利用了其中的I（纖維蛋白原）、II（免疫球蛋白）和V（白蛋白）3個(gè)組分，III和IV，目前基本未加以利用。第57頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天組分III中含有IgA、IgM、凝血因子II、VII、IX、X、蛋白C、纖溶酶原、α2-巨球蛋白、β-微球蛋白、補(bǔ)體成分C3、C4、C5和C8，以及許多其他α和β球蛋白。組分IV中含有抗凝血酶III、αI抗胰蛋白酶、銅藍(lán)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白、補(bǔ)體Ci脂酶抑制物、前白蛋白等。主要問(wèn)題是含量較低，提純難度大，產(chǎn)量小而不被重視。

第58頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）對(duì)其他原料的利用，胎盤(pán)是重要的人類(lèi)原料之一，較好利用的只有胎盤(pán)球蛋白、胎盤(pán)白蛋白等少數(shù)品種。尿液利用也只限于尿激酶、激肽釋放酶、CSF等少數(shù)品種。第59頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)人類(lèi)活性物質(zhì)（productionforHumanactivesubstance）基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等技術(shù)在生物藥物研制方面發(fā)揮了重要作用。例如基因重組的組織型纖溶酶原激活劑（已于1987年獲準(zhǔn)正式生產(chǎn)，凝血因子VII、IX和白蛋白等亦在研究中?；蚬こ谈蓴_素、白細(xì)胞介素、紅細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EPO）等研究亦取得成功，并投放市場(chǎng)。

第60頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)動(dòng)物來(lái)源生物制品的制備一、動(dòng)物來(lái)源藥物的特點(diǎn)我國(guó)應(yīng)用動(dòng)物藥物歷史悠久，4000年前就已經(jīng)使用40多種動(dòng)物藥。本草綱目中收集了440種，中國(guó)藥用動(dòng)物志收載了1500多種。到20世紀(jì)50年代開(kāi)始，我國(guó)陸續(xù)開(kāi)展了動(dòng)物藥物的研究與生產(chǎn)，其中取得的重大成果是關(guān)于胰島素的研究，1965年得到結(jié)晶牛胰島素。生物藥物在治療和預(yù)防疾病方面有其他藥物不可取代的特點(diǎn)，所以越來(lái)越引起人們的注意。第61頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天動(dòng)物來(lái)源藥物的特點(diǎn)：原料來(lái)源豐富，牛、豬、羊的器官、組織、腺體、血液、毛角等都可做為原料，來(lái)源豐富且健康、新鮮，品種繁多，可以制備出人體所需要的各種活性物質(zhì)；要重視安全性，動(dòng)物與人體種屬差異大，活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有一定的差異，蛋白質(zhì)是抗原，不同來(lái)源的蛋白質(zhì)注射于人體內(nèi)要產(chǎn)生抗原反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)有生命危險(xiǎn)。第62頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、動(dòng)物來(lái)源藥物的種類(lèi)與用途1、動(dòng)物多肽與蛋白質(zhì)類(lèi)藥物（1）、動(dòng)物多肽藥物的重要性與種類(lèi)1）重要性：腦垂體所分泌的多肽激素，藥效顯著，且毒副作用小，細(xì)胞因子已有近百種，通過(guò)對(duì)這些活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的研究，有助于我們?cè)O(shè)計(jì)和研制新型藥物。第63頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天2）種類(lèi)：多肽類(lèi)激素：垂體多肽激素（促腎上腺皮質(zhì)激素、促黑激素、脂肪水解激素、催產(chǎn)素、加壓素）；下丘腦激素（促甲狀腺激素釋放激素、生長(zhǎng)素抑制激素、促性腺激素釋放激素）；甲狀腺激素（甲狀旁腺素、降鈣素）；胰島激素（胰高血糖素、胰解痙多肽）；胃腸道激素（胃泌素、膽囊收縮素-促胰酶素、腸泌素、腸血管活性肽、抑胃肽、緩激肽、P物質(zhì)）；胸腺激素（胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子）。多肽類(lèi)細(xì)胞因子：腦氨肽、蛇毒、胎盤(pán)提取物、脾水解物、肝水解物、心臟激素、轉(zhuǎn)移因子、抗癌肽等。第64頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）、動(dòng)物蛋白類(lèi)藥物蛋白質(zhì)激素（生長(zhǎng)素、催乳激素、促甲狀腺素、促黃體生成激素、促卵泡激素）；血漿蛋白質(zhì)，動(dòng)物血漿制品不能用于人類(lèi)；蛋白質(zhì)類(lèi)細(xì)胞因子；粘蛋白（胃膜素、硫酸糖肽、內(nèi)在因子、血型物質(zhì)）；膠原蛋白（明膠、阿膠、氧化聚合明膠）；其他：硫酸魚(yú)精蛋白、胰蛋白酶抑制劑。第65頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、動(dòng)物酶與輔酶類(lèi)藥物種類(lèi)：促消化酶類(lèi)（胃酶可口服，蛋白酶，胰酶）；消炎酶類(lèi)（溶菌酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等可提高毛細(xì)血管通透性，消退浮腫）；治療心血管疾病（纖溶酶、尿激酶、凝血酶）；抗腫瘤的酶（天冬氨酰酶、谷氨酰胺酶、半胱氨酸酶、組氨酸酶）；與氧化還原電子傳遞有關(guān)的治療酶（細(xì)胞色素c、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶）；其他藥用酶（有機(jī)磷解毒酶、青霉素酶）。動(dòng)物輔酶類(lèi)藥物：大多數(shù)屬于核苷酸類(lèi)藥物。第66頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、動(dòng)物核酸類(lèi)藥物（1）、組成與作用

核酸由核苷酸、核苷酸、核苷、堿基及其衍生物?？捎迷诎┌Y、肝炎、抗放射性、心臟病等方面的治療。（2）、主要種類(lèi)和用途DNA：能改善機(jī)體虛弱疲勞、與細(xì)胞毒藥物合用可提高細(xì)胞毒藥物對(duì)癌細(xì)胞的選擇性作用，與紅霉素合用，可降低毒性、提高療效；RNA：口服可用于精神遲緩、記憶衰退、動(dòng)脈硬化性癡呆、靜注用于刺激造血和促進(jìn)白細(xì)胞生成、治療慢性肝炎、肝硬化和初期癌癥；輔酶A用于動(dòng)脈硬化、白細(xì)胞、血小板減少，肝、腎病等；ATP用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、腦動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈硬化、急性脊髓灰質(zhì)炎、肌肉萎縮、慢性肝炎等。

第67頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、動(dòng)物糖類(lèi)藥物單糖、寡糖、多糖。多糖以粘多糖為主，是一類(lèi)胞外生物大分子物質(zhì)，是動(dòng)物體內(nèi)蛋白多糖分子中的糖鏈部分，可抗凝血、降血脂、抗病毒、抗腫瘤和抗放射性。第68頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）、粘多糖的種類(lèi)與分布粘多糖（中性和酸性）、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等。粘多糖主要分布在動(dòng)物骨、軟骨、皮、角、血管、腸、滑膜液、腦、角膜、肺、肝、心、尿等原料中。甲殼質(zhì)：蝦、蟹、昆蟲(chóng)等甲殼動(dòng)物外殼，高等植物細(xì)胞壁，人造皮膚、血管、手術(shù)線(xiàn)；消炎、降低膽固醇和血脂。肝素：腸黏膜、肺、肝、心、腎等部位，抗凝血藥物，外科手術(shù)后防止形成血栓，可預(yù)防血栓形成。第69頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）、制備方法原料處理，提取有效成分，去除非粘多糖，脫色，脫蛋白，純化，用乙醇分級(jí)沉淀，季銨鹽絡(luò)合沉淀，離子交換柱層析，分子篩分離，親和層析等。第70頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、動(dòng)物脂類(lèi)藥物溶于氯仿、苯、石油醚等非極性溶劑，而不溶于或微溶于水中，可分為脂肪、類(lèi)脂和衍生物，又可分為復(fù)合脂和簡(jiǎn)單脂。（1）、脂類(lèi)藥物的種類(lèi)與分布脂肪酸及其衍生物、磷脂類(lèi)、膽酸類(lèi)、卟啉和衍生物。主要為脂肪酸和磷脂，分布在腦、脊髓等神經(jīng)組織中，脂肪組織、趕等含量也較豐富，膽酸分布在膽汁中，卟啉以血液為主。脂類(lèi)藥物的一個(gè)特點(diǎn)是，從生物組織中制得的藥物再經(jīng)過(guò)分子改造可以得到更高療效的產(chǎn)品。腦磷脂可止血、防動(dòng)脈硬化以及神經(jīng)衰弱；卵磷脂防治動(dòng)脈硬化、神經(jīng)衰弱和肝病。第71頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）、制備方法提取法：將原料粉碎后用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑進(jìn)行直接提取，再經(jīng)純化即得到。水解法：將目的產(chǎn)物與其他不需要的成分進(jìn)行水解分離，提取純化；生物轉(zhuǎn)化法：利用酶、微生物發(fā)酵、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)藥物；化學(xué)合成或半合成。6、動(dòng)物細(xì)胞因子

動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。

第72頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、動(dòng)物來(lái)源生物制品制備的實(shí)例1、胰島素的制備（productionofinsulin）（1）胰島素的性質(zhì)：pI=5.3-5.4，由A鏈、B鏈通過(guò)兩個(gè)二硫鍵連接；A鏈含21個(gè)氨基酸，B鏈含30個(gè)氨基酸；是所有蛋白質(zhì)中研究得最多，也是研究得最清楚的蛋白。

第73頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）工藝路線(xiàn)（圖3-5）

豬胰臟提取乙醇，草酸，10-15℃提取液堿化氨水，pH8-8.4堿化液酸化硫酸，pH3.6-3.8,5℃酸化液濃縮30℃以下，減壓濃縮液去脂速熱速冷去脂溶液鹽析NaCl,pH2-2.5鹽析物水、丙酮、氨水（pH4.2~4.3）除酸性蛋白濾液鋅沉淀氨水，Zn（Ac）2，pH6.0沉淀除堿性蛋白，結(jié)晶Zn（Ac）2，丙酮、氨水，pH8.0，5℃以下，檸檬酸調(diào)pH6.0結(jié)晶洗滌，干燥水、丙酮、乙醚胰島素精品圖3—1豬胰島素生產(chǎn)的工藝路線(xiàn)

第74頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）工藝要點(diǎn)①提取：絞碎胰臟，加2.3-2.6倍的86%-88%乙醇和5%的草酸，提取3h。②濃縮：30℃減壓濃縮至比重為1.04-1.06為止。③除酸性蛋白：加入7倍量的蒸餾水溶解，再加3倍量冷丙酮，用氨水調(diào)pH至4.2-4.3，補(bǔ)加丙酮，離心去除酸性質(zhì)白沉淀。④鋅沉淀：用氨水調(diào)pH為6.2-6.4，加入3.6%醋酸鋅溶液（20%濃度），再用氨水調(diào)pH至6.0，4℃放置過(guò)夜；收集沉淀。第75頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑤除堿性蛋白、結(jié)晶：每克加冰冷的2%檸檬酸溶液50mL，6.5%醋酸鋅溶液2mL，丙酮16mL，用冰水稀釋至100mL，使充分溶解；冷至5℃以下，用氨水調(diào)至pH至8.0，過(guò)濾；濾液用10%檸檬酸溶液調(diào)pH6.0，補(bǔ)加丙酮，慢速攪拌3-5h使結(jié)晶析出；再轉(zhuǎn)入5℃左右放置3-4d，使結(jié)晶完全；收集結(jié)晶，用丙酮、乙醚脫水后，真空干燥，即得結(jié)晶胰島素。第76頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、超氧化物歧化酶（SOD）的制備超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）與機(jī)體抗衰老、腫瘤發(fā)生、自身免疫疾病和輻射防護(hù)等有關(guān)。用于炎癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及放射治療后的炎癥等。SOD存在于動(dòng)物、植物、微生物中，有Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等。牛紅細(xì)胞SOD為Cu-Zn-SOD，由兩個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基含1個(gè)Cu和1個(gè)Zn。在pH7.6-9.0時(shí)穩(wěn)定。它催化超氧負(fù)離子歧化為H2O2。第77頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天新鮮豬血去血漿，離心紅細(xì)胞0.9%NaCl,反復(fù)洗滌3次收集（1）工藝路線(xiàn)（圖3-2）浮洗凈紅細(xì)胞溶血血去離子水，5℃,30min溶血物去血紅蛋白乙醇，氯仿,15min上清液沉淀丙酮，0℃沉淀物去離子水55-65℃，10-15min黃綠色澄清液沉去不溶蛋白，透析丙酮，去離子水，0℃，6-8h透析液吸附、吸脫、超濾、濃縮、干燥DEAE-SephadexA50,磷酸緩沖液（K3PO4），pH7.6SOD成品圖3-6豬血SOD生產(chǎn)工藝路線(xiàn)第78頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）工藝要點(diǎn)①收集：離心去黃色血漿，紅細(xì)胞用0.9%NaCI溶液離心浮洗3次。②溶血、去血紅蛋白：加去離子水，5℃下攪拌30min后加入乙醇和氯仿，攪拌15min；離心去血紅蛋白，收集上清液。第79頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天③沉淀、熱處理：0℃下將上清液加入1.2-1.5倍體積的丙酮，產(chǎn)生絮狀沉淀；離心去上清液，得沉淀物；沉淀物加適量蒸餾水溶解，上清在55-65℃下熱處理10-15min，除去熱變性蛋白，收集黃綠色澄清液。④沉淀、去不溶蛋白：澄清液在0℃下加入適量丙酮，使其產(chǎn)生大量絮狀沉淀；離心去上清液；沉淀用去離子水溶解，除不溶性蛋白；上清液置透析袋中得透析液。第80頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑤吸附、洗脫、超濾、凍干：透析液加到用磷酸緩沖液平衡好的DEAE-SephadexA50柱上吸附，用磷酸鉀緩沖液梯度洗脫，收集SOD活力洗脫液，超濾濃縮后，冷凍干燥得SOD成品。⑥電泳鑒定條件：0.5%瓊脂糖凝膠平板電泳法，用聚丙稀酰胺凝膠電泳方法鑒定更靈敏。第81頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、用肝臟生產(chǎn)核糖核酸（RNA）

用肝臟生產(chǎn)的動(dòng)物RNA具有其他生物來(lái)源RNA所不具有的藥物功能。提純難度較大。（1）工藝路線(xiàn)圖(圖3-7肝RNA生產(chǎn)工藝路線(xiàn))勻漿健康豬/牛肝0.1mol/LNaCl,0.05mol/L檸檬酸鈉，PVS(聚乙烯硫酸脂），Triton×100(表面化性劑）清液提取三乙醇胺，SDS,EDTA,苯酚，震蕩，離心清液除蛋白氯仿，震蕩，離心，反復(fù)三次清液沉淀醋酸鉀，－20℃乙醇，0℃，1h離心沉淀除糖原0.001mol/LEDTA,NaAc,K2HPO4,乙二醇甲醚，0℃離心清液精制制0.2mol/LNaAc,CTAB,0℃,離心0.5h沉淀洗滌0.1mol/LNaAc,EDTA,70%乙醇，反復(fù)洗5次，離心沉淀溶解0.001mol/L,EDTA,0.14mol/LNaAc,溶解，過(guò)濾除菌無(wú)菌RNA溶液制劑裝灌，凍干RNA成品第82頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）工藝要點(diǎn)①勻漿：肝用生理鹽水洗凈，切成小塊，加入1-2倍量檸檬酸鈉、聚乙烯硫酸脂（PVS）TritonX100（pH7.0）溶液，用組織搗碎機(jī)搗成勻漿，離心。②提取：加入等體積三乙醇胺、十二烷基磺酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA，pH9.0）溶液，攪拌均勻后，加等體積苯酚（含0.2%8-羥基喹啉）及等體積氯仿；室溫振蕩30min，離心20min。第83頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天③除蛋白：離心清液中加入等量氯仿振蕩，反復(fù)2-3次，至中間界面無(wú)明顯蛋白層為止。④乙醇沉淀：清液中加入1/10體積KAC和兩倍體積－20℃乙醇；0℃放置1h，離心得白色沉淀。⑤除糖原：將沉淀溶于含EDTA-0.01mol/LNaAc溶液中，加入等體積K2HPO4,攪拌下再加入等體積乙二醇甲醚，0℃放0.5h，離心得清液。第84頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑥絡(luò)合：清液在0℃下攪拌加入等體積0.2mol/LNaAc溶液和1/4體積1%十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）；0℃放0.5h；離心取沉淀。⑦洗滌：沉淀用NaAc，70%乙醇溶液反復(fù)洗滌5次，至無(wú)泡沫為止。第85頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第四節(jié)基因工程生物制品的制備（BiopreparatePreparationofGeneEngineering）一、建立分離純化工藝的根據(jù)（referenceoftechniqueofisolationanddepuration）1、含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)（speciality）各種因素均對(duì)分離純化技術(shù)和工藝有直接影響。這些因素包括：①菌種類(lèi)型及其代謝特性。包括菌種的各種生物學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類(lèi)、產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)所處的位置，表達(dá)方式，代謝物種類(lèi)，產(chǎn)物類(lèi)似物、毒物和能降解產(chǎn)物的酶類(lèi)等；第86頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天②原材料和培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量；③生產(chǎn)工藝和條件。包括滅菌方法和條件，生產(chǎn)方式（連續(xù)、批式、半連續(xù)），生產(chǎn)周期，生產(chǎn)能力，工藝控制條件、因素及方式等；④初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。包括產(chǎn)物濃度、主要雜質(zhì)種類(lèi)和濃度、鹽的種類(lèi)和濃度、溶解度、pH、粘度、流體力學(xué)性質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)等。第87頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、物料中雜質(zhì)的種類(lèi)和性質(zhì)（Varietyandcharacteristicofimpurity）雜質(zhì)種類(lèi)和性質(zhì)包括相關(guān)性和非相關(guān)性雜質(zhì)的含量、化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子量、電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學(xué)特性、穩(wěn)定性、溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性、吸附性能等。第88頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、目的產(chǎn)物特性（specialityofproduction）產(chǎn)物特性主要有化學(xué)、物理和生物學(xué)特性，包括化學(xué)組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性、疏水性、擴(kuò)散性、擴(kuò)散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物學(xué)活性、親和性、配基種類(lèi)、表面活性等。第89頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求（requirementsforqualityofproduction）產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和用途對(duì)產(chǎn)品純度、生物活性、比活的要求。包括允許的雜質(zhì)種類(lèi)和最大允許含量，特殊雜質(zhì)的種類(lèi)和最大允許量，以及雜質(zhì)對(duì)使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性等。第90頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、分離純化的基本過(guò)程（basicprocessofisolationanddepuration）分離純化是極其重要的一環(huán)，這是由于工程菌經(jīng)過(guò)大規(guī)模培養(yǎng)后，產(chǎn)生的有效成分含量很低，雜質(zhì)含量卻很高；另外由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的，對(duì)產(chǎn)品的純度要求也高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。分離純化要比傳統(tǒng)產(chǎn)品困難得多。第91頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天分離純化一般不應(yīng)超過(guò)4～5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。流程如下圖所示。第92頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包涵體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化制劑

產(chǎn)品圖3-8基因工程制品分離純化的一般流程第93頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、分離純化的技術(shù)（techniqueofisolationanddepuration）分離純化技術(shù)應(yīng)滿(mǎn)足下列要求：①技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；②選擇性要好，達(dá)到較高純化倍數(shù)；③收率要高；④要能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理或調(diào)整；⑤整個(gè)分離純化過(guò)程要快，能夠滿(mǎn)足高生產(chǎn)率的要求。第94頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、細(xì)胞破碎與固液分離（cellcrashingandsolidandliquidisolation）以大腸桿菌為宿主藥物多為胞內(nèi)產(chǎn)物，分離需經(jīng)細(xì)胞收集、細(xì)胞破碎和細(xì)胞碎片分離等步驟。（1）細(xì)胞收集（cellcollection）：常用離心分離，膜過(guò)濾法（2）細(xì)胞破碎（cellcrashing）：細(xì)胞破碎方法有機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法。第95頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天機(jī)械破碎法速度快，處理量較大，不會(huì)帶入其它化學(xué)物質(zhì)；但要產(chǎn)生熱量，要采取冷卻措施，防止失活?，F(xiàn)常用方法有：高壓勻漿法、超聲波破碎法、高速珠磨法、高壓擠壓法。高壓勻漿器，利用高速造成的剪切、碰撞以及高壓到常壓的變化，使細(xì)胞破碎。超聲波破碎法是小量細(xì)胞破碎普遍使用的方法，用聲頻高于15～20KHz，其破碎機(jī)制可能與空化引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。

第96頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天

高速珠磨法設(shè)備是珠磨機(jī)，原理是細(xì)胞懸液與極細(xì)的玻璃小球、瓷球、石英砂等研磨劑快速攪拌研磨，利用珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，促使細(xì)胞壁破裂，釋放出內(nèi)含物。X-Press擠壓機(jī)，把濃縮的細(xì)胞懸液冷卻至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥孔中擠出，冰晶體磨損和包埋在冰中的細(xì)胞變形引起細(xì)胞破碎。其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞碎片粉碎程度低，生物活性保持較好。第97頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天

非機(jī)械破碎法包括酶溶法、化學(xué)滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法等。酶溶法就是利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鏈內(nèi)切酶、殼多糖酶等。酶溶法必須選擇合適的酶，控制好溫度、pH和酶用量。化學(xué)滲透法得用一些有機(jī)溶劑（苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑（SDS、Triton）、金屬螯合劑（EDTA）、變性劑（脲、鹽酸胍）等。第98頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）固液分離（solidandliquidisolation）分離細(xì)胞碎片是比較困難的，可以用離心、膜過(guò)濾或雙水相分配的方法，使細(xì)胞碎片分配在一相（通常為下相）而分離，也起部分純化作用。包括高速離心和超速離心。膜過(guò)濾技術(shù)有微濾、超濾和反滲透等，微濾用于分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包含體和蛋白質(zhì)沉淀物等固體顆粒；超濾用于濃縮蛋白質(zhì)、多糖和核酸等大分子物質(zhì)；反滲透用于脫去抗生素、氨基酸等小分子中的水分。第99頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天雙水相萃取系統(tǒng)是由兩種水溶性高聚物或一種高聚物與無(wú)機(jī)鹽在水溶液中混合而成，常用的雙水相系統(tǒng)有聚乙二醇-葡聚糖和聚乙二醇-無(wú)機(jī)鹽。聚乙二醇-無(wú)機(jī)鹽應(yīng)用廣泛。聚乙二醇富集的上相一般會(huì)有目的產(chǎn)物和其他雜蛋白，下相含有細(xì)胞碎片、核酸、多糖等。需要綜合考慮聚乙二醇濃度、無(wú)機(jī)鹽濃度、PH等諸多因素。第100頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、目的產(chǎn)物的分離純化（isolationanddepurationofproduction）固液分離之后，目的產(chǎn)物仍與大量的雜質(zhì)混合在一起，這類(lèi)雜質(zhì)可能有病毒、熱原質(zhì)、氧化產(chǎn)物、核酸、多聚體、雜蛋白、與目的物類(lèi)似的異構(gòu)體等。第101頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天分離純化主要依賴(lài)色譜分離方法。該法是設(shè)備簡(jiǎn)單，便于自動(dòng)化控制和分離過(guò)程中無(wú)發(fā)熱等有害效應(yīng)。色譜技術(shù)分為①離子交換色譜、②疏水色譜、③反相色譜、④親和色譜、⑤凝膠過(guò)濾色譜、⑥高壓液相色譜等。選擇純化方法尤其重要的根據(jù)是表面性質(zhì)的差異。第102頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）離子交換色譜（ionexchangechromatography，IEC）A、原理原理是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離目的。分辨率高、容量大、操作容易，該法已成為多肽、蛋白質(zhì)、核酸和許多發(fā)酵產(chǎn)物分離純化的一種重要方法。第103頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子交換劑是一類(lèi)具有離子交換功能的高分子材料，功能基是由固定在骨架上的帶電基團(tuán)與可進(jìn)行交換的能移動(dòng)的離子兩部分組成。二者所帶電荷相反，可進(jìn)行交換的離子稱(chēng)為反離子。反離子可與溶液中帶同種電荷的離子進(jìn)行交換，這種交換反應(yīng)是可逆的，在一定條件下被交換的離子可能解吸，交換劑又恢復(fù)到原來(lái)的形式，離子交換劑通過(guò)交換和再生可以反復(fù)使用。第104頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天純化生物可以采用兩種方式：一是將目的產(chǎn)物離子化，然后被交換到介質(zhì)上，雜質(zhì)不被吸附而從柱中流出，稱(chēng)之為“正吸附”，其優(yōu)點(diǎn)是目的產(chǎn)物純度高，起到濃縮作用，適于產(chǎn)物濃度低、工作液量大的溶液；二是將雜質(zhì)離子化后交換，目的產(chǎn)物不被交換而直接流出，稱(chēng)之為“負(fù)吸附”，適用于目的產(chǎn)物濃度高的工作液，只可除去50%～70%的雜質(zhì)，產(chǎn)物的純度不高。第105頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天B、影響因素①蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和表面電荷的分布影響其離子交換的性能②交換基團(tuán)和交換介質(zhì)的種類(lèi)、吸附和洗脫的條件（pH、離子強(qiáng)度、反離子）等。③等電點(diǎn)處于極端位置（pI＜5或pI＞8）的基因工程產(chǎn)物應(yīng)首選離子交換色譜方法，往往一步即可除去幾乎全部的雜質(zhì)。第106頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天A、B、C3種蛋白質(zhì)的電荷與pH的關(guān)系如圖3-8所示，分離時(shí)應(yīng)選擇在電荷相差最大的pH下進(jìn)行操作，圖中蛋白質(zhì)A和B有相同的等電點(diǎn)，但pH向兩側(cè)改變時(shí)，其電荷相差增大。選擇pH3～4，使B從A和C中分出，然后選pH＞8，將A和C分開(kāi)。BAC

電荷+0-357911圖3-8蛋白質(zhì)A、B、C的滴定曲線(xiàn)第107頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2）反相色譜（reversedphasechromatography，RPC）和疏水色譜（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）A原理根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來(lái)分離純化。反相色譜是利用溶質(zhì)分子中非極性基團(tuán)與非極性固定相之間相互作用力的大小，以及溶質(zhì)分子中極性基團(tuán)與流動(dòng)相中極性分子之間在相反方向作用力的大小的差異進(jìn)行分離。第108頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天進(jìn)行生物大分子反相色譜分離時(shí)，常用的固定相為硅膠烷基鍵合相；流動(dòng)相多采用低離子強(qiáng)度的酸性水溶液，并加入一定比例的能與水互溶的乙腈、甲醇、異丙醇等有機(jī)溶劑。由于固定相骨架的疏水性強(qiáng)，吸附的蛋白質(zhì)需要用有機(jī)溶劑才能洗脫下來(lái)。第109頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天疏水色譜的原理與反相色譜相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域（非極性氨基酸的側(cè)鏈）和介質(zhì)的疏水基團(tuán)（苯基或辛基）之間的相互作用，無(wú)機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。所用介質(zhì)表面的疏水性比反相色譜所用介質(zhì)的弱，為有機(jī)聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相，流動(dòng)相一般為pH6～8的鹽水溶液。第110頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子中疏水性部分與介質(zhì)的疏水基團(tuán)產(chǎn)生疏水性作用而被吸附；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)的疏水作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來(lái)，蛋白質(zhì)的疏水性越強(qiáng)，洗脫時(shí)間越長(zhǎng)。與反相色譜相比，疏水色譜回收率較高，蛋白質(zhì)變性的可能性小。

第111頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天B、二者比較反相色譜和疏水色譜的差異在于前者在有機(jī)相中進(jìn)行，蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)反相流動(dòng)相與固定相作用有時(shí)會(huì)發(fā)生部分變性，而且后者通常在水溶液中進(jìn)行，蛋白質(zhì)在分離過(guò)程中一般仍保持其天然構(gòu)象。第112頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）親和色譜（affinitychromatography）

1）基本概念（basicconcept）親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配基之間特異性的親和力進(jìn)行分離的一類(lèi)特殊的層析技術(shù)。

Typicallyofferspurities>95%inonestep。配基（ligand）：被固定在基質(zhì)上的分子稱(chēng)為配基，配基和基質(zhì)是以共價(jià)鍵結(jié)合的。基質(zhì)（matrix）：亦稱(chēng)為載體（vector），是構(gòu)成固定相的骨架。第113頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天2）親和層析有如下特點(diǎn)（Characteristicsof

AffinityChromatography）純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速；分離效率高；產(chǎn)物純度高；必須針對(duì)某一分離對(duì)象制備專(zhuān)一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件。因此應(yīng)用范圍受到一定的限制。第114頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天3）親和層析的基本原理（MechanismofAffinityChromatography）①親和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑。②當(dāng)含有混合組份的樣品（流動(dòng)相）通過(guò)此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒(méi)有親和力的無(wú)關(guān)組份就隨流動(dòng)相流出。③然后改變流動(dòng)相成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來(lái)。（見(jiàn)Fig1、Fig2）。第115頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（Fig1.MechanismofAC）第116頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天（Fig2.MechanismofAC）第117頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天具有特異性親和作用的生物分子4）配基的種類(lèi)(sortsofligand)抗原與抗體。DNA與互補(bǔ)DNA或RNA（cDNA、mRNA)。酶與其底物。激素與其受體。維生素與結(jié)合蛋白。糖蛋白與植物凝集素。第118頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天5）親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析載體的選擇（selectionofvectors）多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過(guò)。顆粒均勻，具有良好的流速。具有惰性，盡量減少非專(zhuān)一性吸附。在溫和的條件下能與配基共價(jià)偶聯(lián)。第119頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天6）常用的親和層析載體

（VectorsofAffinityChromatography）纖維素（cellulose）葡聚糖凝膠（Sephadex）瓊脂糖凝膠（Sepharose）聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel）多孔玻璃珠（Bio-Glass）其它新型載體（Othergels）第120頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天7）親和層析配基的選擇（Selectionofligand）1.純化對(duì)象和配基之間必須有較強(qiáng)的親和力。2.但親和力太高也是有害的，因?yàn)樵诮怆x配基復(fù)合物時(shí)所需的條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使生物分子變性。3.配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，可用于和載體相連，同時(shí)又不影響配基與生物分子之間的親和力。第121頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天8）載體、配基、目的物的連接

（Conjunctionofvector、ligandandtargetmaterial）載體（VectorsorMatrix）

+配基（Ligand）

+目的物（targetmaterial）第122頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天FigACreliesuponareversiblehighly

specificbindingreaction.

第123頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天FigSpacerarmprinciple

Aspacerissometimesusedtoensurefullaccessibilityoftheaffinityligand.第124頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天FigPrincipleofpreparingACmedia

第125頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天9）親和層析的基本操作方法：①平衡（Equilibration）

用平衡Buffer沖洗柱體，至基線(xiàn)平穩(wěn).第126頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天②樣品上柱和沖洗（Sampleapplicationandwash）樣品中的目的物與層析介質(zhì)選擇性的吸附，雜質(zhì)不被吸附。用上樣Buffer沖洗柱體，雜質(zhì)被沖洗下來(lái)。形成雜質(zhì)峰（見(jiàn)下圖）。第127頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天第128頁(yè),共152頁(yè)，2024年2月25日，星期天③洗脫（Elution）

選擇適當(dāng)?shù)臈l件，將吸附在親和介質(zhì)上的目的物解吸下來(lái)（見(jiàn)下圖）。第129頁(yè),共152頁(yè)，2024年2