二代測(cè)序技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)

二代測(cè)序技術(shù)在血液腫瘤中的應(yīng)用中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)〔〕血液腫瘤是一類(lèi)具有高度異質(zhì)性的疾病，其診療需要結(jié)合形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)展綜合分析。二代測(cè)序〔Next-generationsequencing,NGS〕作為的分子生物學(xué)技術(shù)，具有通量高、靈敏度高、本錢(qián)低等優(yōu)勢(shì)，是探究血液腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制并指導(dǎo)臨床診療的重要手段。為推動(dòng)NGS在血液腫瘤診療中的應(yīng)用，提高診療水平，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)血液腫瘤專(zhuān)業(yè)委員會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)組織國(guó)內(nèi)相關(guān)的血液、病理和檢驗(yàn)專(zhuān)家，結(jié)合國(guó)外權(quán)威資料和已積存的大NGS血液腫瘤中常見(jiàn)的分子生物學(xué)特別主要包括基因突變、融合基因及基因特別表達(dá)。目前NGS在基因突變的檢測(cè)方面應(yīng)用最為廣泛和成熟，本共識(shí)僅涉及基因突變的檢測(cè)。一、NGS1．診斷分型：1．診斷分型：2．預(yù)后判定：基因突變的檢測(cè)在急性髓系白血病〔AML〕伴重現(xiàn)性遺傳學(xué)特別、遺傳易感性髓系腫瘤、骨髓增殖性腫瘤〔MPN〕、骨髓增生特別綜合征伴環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞〔MDS-RS〕、毛細(xì)胞白血病〔HCL〕和淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥〔LPL/WM〕的診斷中具有關(guān)鍵性的作用，對(duì)于其他血液腫瘤則起到關(guān)心診斷的作用[1,2,3,4,5,6,7,8]。2．預(yù)后判定：基因突變是各類(lèi)血液腫瘤預(yù)后推斷的重要依據(jù)，目前NCCN指南已提3．指導(dǎo)治療：出了基于基因突變的 AML預(yù)后分層體系[1]。此外，MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴細(xì)胞白血病〔ALL〕、慢性淋巴細(xì)胞白血/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤〔CLL/SLL〕LPL/WM、大顆粒淋巴細(xì)胞白血病〔LGLL〕中，已經(jīng)證明白一些具有明確預(yù)后意義的突變基因[2,3,4,5,6,7,8]其他血液腫瘤中突變基因的預(yù)后意義尚有待于進(jìn)一步爭(zhēng)論。3．指導(dǎo)治療：4．微小殘留病〔MRD〕監(jiān)測(cè)：一方面，基因突變檢測(cè)可供給分子治療靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)靶向藥物進(jìn)展治療，目前已有基于突變基因的靶向藥物應(yīng)用于臨床或處于臨床試驗(yàn)階段，其中FLT3、IDH1/2、BRAF及JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)的突變基因已有靶向藥物上市[1,4,5]；另一方面，基因突變可以導(dǎo)致對(duì)某些藥物的敏感或者耐受，準(zhǔn)時(shí)檢測(cè)有助于治療方案的調(diào)整。例如，TP53CLL/SLL患者對(duì)常規(guī)化療反響差，MYD88和CXCR4基因突變可影響伊布替尼在〔CML〕和PhALL〔TKI〕耐受的主要機(jī)制之一[4,7,8]。4．微小殘留病〔MRD〕監(jiān)測(cè)：5．克隆演化：MRD9PCR和流式細(xì)胞學(xué)是目前主流的MRD監(jiān)測(cè)方法，但是由于NGS靈敏度隨測(cè)MRD5．克隆演化：血液腫瘤在進(jìn)展過(guò)程中會(huì)伴隨動(dòng)態(tài)的克隆演化，或是基因突變負(fù)荷的轉(zhuǎn)變，或是的突變基因的消滅，準(zhǔn)時(shí)監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)變，有助于了解疾病進(jìn)展并調(diào)整治療方案[10]。二、根本流程〔一〕檢測(cè)的基因種類(lèi)列表設(shè)計(jì)1．檢測(cè)的基因：〔一〕檢測(cè)的基因種類(lèi)列表設(shè)計(jì)1．檢測(cè)的基因：2．檢測(cè)區(qū)域：血液腫瘤相關(guān)檢測(cè)基因由臨床血液腫瘤專(zhuān)家和試驗(yàn)室專(zhuān)家共同制定，主要依據(jù)中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)、WHO、NCCN等機(jī)構(gòu)公布的血液系統(tǒng)疾病診療指南或者專(zhuān)家共識(shí)。對(duì)于其他權(quán)威文獻(xiàn)報(bào)道的重要基因，可在驗(yàn)證之后納入基因列表。血液腫瘤易感的胚系突變基因，依據(jù)檢測(cè)需求可以納入，例如CEBPA、DDX41、RUNX1、ETV6、GATA2等基因除了可發(fā)生體細(xì)胞突變外，發(fā)生胚系突變可導(dǎo)致髓系腫瘤的易感[2,4]。檢測(cè)基因的數(shù)量應(yīng)在滿足臨床需求的根底上，綜合疾病類(lèi)型、試驗(yàn)技術(shù)、樣本數(shù)量以及檢測(cè)本錢(qián)到達(dá)最優(yōu)化的設(shè)計(jì)[11,12入，檢測(cè)的基因種類(lèi)亦需隨之更。2．檢測(cè)區(qū)域：被檢測(cè)的基因所掩蓋區(qū)域可參考臨床診療指南、權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)、文獻(xiàn)及試驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)等。首先應(yīng)納入基因熱點(diǎn)突變區(qū)域或重要構(gòu)造域的編碼區(qū)域，例如NPM1c.860_863NOTCH1最多見(jiàn)于HD構(gòu)造域及ΔPEST構(gòu)造域[13]；無(wú)明確熱點(diǎn)突變區(qū)域或突變位點(diǎn)分布比較分散的基因，應(yīng)檢測(cè)全部外顯子，例如TP53、RUNX1等；剪接位點(diǎn)突變有可能導(dǎo)致外顯子跳動(dòng)，影響蛋白功能，建議依據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)記錄和文獻(xiàn)報(bào)道將剪接位點(diǎn)±5bp的區(qū)域納入檢測(cè)范圍；對(duì)于存在非翻譯區(qū)〔二〕試驗(yàn)流程1．樣本采集：〔UTR〕突變的基因，例如BCL6，則應(yīng)納入相應(yīng)區(qū)域檢測(cè)[14]。需要留意的是，對(duì)于不能掩蓋的熱點(diǎn)突變類(lèi)型或重要區(qū)域可通過(guò)其他檢測(cè)方法進(jìn)行補(bǔ)充，并在檢測(cè)報(bào)告中明確說(shuō)明?！捕吃囼?yàn)流程1．樣本采集：2．DNA疑診為血液腫瘤的患者，初診時(shí)應(yīng)留存穎骨髓、外周血或組織樣本，以備進(jìn)展NGS檢測(cè)，未留存者可使用初診時(shí)的骨髓涂片進(jìn)展檢測(cè)。骨髓1~3ml3~5ml為宜，假設(shè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高或偏低，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整采集量，使單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)到達(dá)1×107以上?？鼓齽┦走xEDTA抗凝劑或枸櫞酸鈉抗凝劑，制止使用肝素抗凝，推舉24h48~10μm，5~8NGS2．DNA3．文庫(kù)制備：DNANGS不同組織切片應(yīng)分別單獨(dú)進(jìn)展DNA提取，并對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)展評(píng)估，包括濃度、純度和完整性分析。由于FFPE組織標(biāo)本以及骨髓涂片所提取的DNADNA片段化的程度參差不齊，因此各試驗(yàn)室應(yīng)具有相應(yīng)的方法檢測(cè)DNA度，并設(shè)立明確的合格樣本標(biāo)準(zhǔn)[11]。3．文庫(kù)制備：文庫(kù)制備用于目標(biāo)區(qū)域的富集，主要有雜交捕獲法和擴(kuò)增子建庫(kù)法，4．上機(jī)檢測(cè)：無(wú)論承受何種方法制備文庫(kù)，均需使用已驗(yàn)證過(guò)的建庫(kù)試劑[15]。多標(biāo)本同時(shí)測(cè)序應(yīng)有相應(yīng)的分子標(biāo)簽用于區(qū)分不同的測(cè)序標(biāo)本，明確不同的檢測(cè)標(biāo)本和分子標(biāo)簽的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系；必要時(shí)，可對(duì)加標(biāo)簽的方法及試劑進(jìn)展說(shuō)明[16PCR或其他方法對(duì)文庫(kù)進(jìn)展定量，將文庫(kù)濃度調(diào)整至適宜的水平。每個(gè)檢測(cè)工程應(yīng)設(shè)定其文庫(kù)質(zhì)量的要求，并設(shè)立明確的合格文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)。4．上機(jī)檢測(cè)：〔三〕生物信息學(xué)分析流程1．質(zhì)控分析：DNA合成過(guò)程中釋放的氫離子或熒光信號(hào)。為保證測(cè)序質(zhì)量、檢測(cè)區(qū)域掩蓋深度及報(bào)告時(shí)效性，需要依據(jù)樣本數(shù)量和質(zhì)量選取適當(dāng)?shù)臏y(cè)序平臺(tái)和芯片?！踩成镄畔W(xué)分析流程1．質(zhì)控分析：2．?dāng)?shù)據(jù)過(guò)濾：由測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)通常會(huì)存在堿基召回錯(cuò)誤、插入刪除錯(cuò)誤、低質(zhì)量讀段〔reads〕及接頭污染等問(wèn)題，會(huì)在肯定程度上影響下游的分析過(guò)程。因此，在對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)展具體的生物信息學(xué)分析之前，要先對(duì)下Q20、目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度、均一性等評(píng)價(jià)參數(shù)。血液腫瘤的基因突變檢測(cè)，測(cè)序深度應(yīng)≥500×，平均測(cè)序掩蓋度、均一性以及在靶率均≥90%。2．?dāng)?shù)據(jù)過(guò)濾：低質(zhì)量讀段會(huì)影響下游的序列處理和分析，因此需要對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)展3．序列比對(duì)：過(guò)濾處理。數(shù)據(jù)過(guò)濾所針對(duì)的讀段主要有四種：測(cè)序質(zhì)量低的讀段〔lowqualityreads〕，重復(fù)讀段〔duplicatereads〕，含有核苷酸的插入、和帶有人工污染的讀段〔adaptor等〕。常用的數(shù)據(jù)過(guò)濾軟件有Trimmomatic、Fastx_toolkit、NGSQCToolkit3．序列比對(duì)：4．突變位點(diǎn)注釋?zhuān)寒?dāng)讀段經(jīng)過(guò)質(zhì)控與過(guò)濾等步驟到達(dá)肯定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之后，需要將其比對(duì)到參考基因組上。目前普遍參考的人類(lèi)基因組參考序列為Humanhg19SOAP/SOAP2mrFAST和Stampy等，試驗(yàn)室應(yīng)中選取適宜的比對(duì)軟件，建立完善的試驗(yàn)室比對(duì)流程。4．突變位點(diǎn)注釋?zhuān)?．突變位點(diǎn)篩選：注釋內(nèi)容包括功能信息、頻率信息、軟件推測(cè)結(jié)果信息以及疾病數(shù)據(jù)庫(kù)信EnsemblRefSeqGENCODEdbSNP1000genomes、ESP、ExAC、COSMIC、HGMD、Clinvar、polyphenSIFT5．突變位點(diǎn)篩選：篩選與鑒別疾病相關(guān)突變位點(diǎn)需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選流程，至少需要排解〔SNV〕及安康人群中的基因多態(tài)性位點(diǎn)?！菜摹硤?bào)告內(nèi)容〔四〕報(bào)告內(nèi)容1．根本信息：1．根本信息：2．突變位點(diǎn)的描述：報(bào)告中除患者信息、標(biāo)本信息、送檢日期、報(bào)告署名及日期等一般資目標(biāo)區(qū)域的富集方法、平均測(cè)序深度、數(shù)據(jù)分析軟件名稱及版本號(hào)；對(duì)相關(guān)專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)進(jìn)展解釋說(shuō)明；本試驗(yàn)室報(bào)告突變位點(diǎn)的規(guī)章、檢測(cè)方法的局限性、檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度等；注明是否通過(guò)其他方法補(bǔ)充了NGS未掩蓋或掩蓋不佳的檢測(cè)區(qū)域等[11,16]。2．突變位點(diǎn)的描述：3．突變位點(diǎn)分級(jí)報(bào)告：突變位點(diǎn)信息應(yīng)當(dāng)包括基因名稱、突變的物理坐標(biāo)、cDNA的轉(zhuǎn)錄本號(hào)、外顯子位置、符合人類(lèi)基因組變異協(xié)會(huì)〔HGVS〕書(shū)寫(xiě)標(biāo)準(zhǔn)的突變類(lèi)型、氨基酸突變類(lèi)型、變異等位基因頻率以及該突變位點(diǎn)的測(cè)序深度等[17]〔NationalCenterof〔canonicalsequence〕[18]。3．突變位點(diǎn)分級(jí)報(bào)告：不推舉將良性或可能良性突變?cè)趫?bào)告中報(bào)道。建議突變位點(diǎn)依據(jù)臨床意義的明確性進(jìn)展分級(jí)報(bào)告：①一級(jí)變異：具有明確臨床意義的突變，包括：國(guó)家食品藥品監(jiān)視治理總局〔CFDA〕、美國(guó)食品藥品治理局〔FDA〕等機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的用藥治療靶點(diǎn)；血液腫瘤診療指南或?qū)＜夜沧R(shí)中有明確診斷、治療、預(yù)后意義的突變；尚未進(jìn)入診療指南或?qū)＜夜沧R(shí)，但有權(quán)威文獻(xiàn)或大規(guī)模報(bào)道在血液腫瘤中具有診療意義的突變。②二級(jí)變異：具有潛在臨床意義的突變，包括：基于多個(gè)小規(guī)模爭(zhēng)論報(bào)道在血液腫瘤中具有診斷、治療或預(yù)后意義，但尚未達(dá)成共識(shí)的突變；覺(jué)察的疾病相關(guān)基因重要構(gòu)造域的體細(xì)胞突變。4．報(bào)告解讀：③三級(jí)變異：臨床意義未明的突變，對(duì)于尚有爭(zhēng)議的突變位點(diǎn)，試驗(yàn)室必需制定相關(guān)規(guī)章，可以覺(jué)察突變即報(bào)告，并附上說(shuō)明和意義；也可以不報(bào)告或只報(bào)告小局部突變結(jié)果，并附上說(shuō)明、參考文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)。4．報(bào)告解讀：突變位點(diǎn)的臨床意義解讀要平實(shí)客觀、清楚易懂。推舉寫(xiě)明突變位點(diǎn)的人群突變頻率、蛋白功能危害性推測(cè)和疾病數(shù)據(jù)庫(kù)的記錄，依據(jù)疾病診療指南、專(zhuān)家共識(shí)和既往爭(zhēng)論說(shuō)明突變位點(diǎn)在臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中的意義，注明其相關(guān)藥物及正在開(kāi)展的狀態(tài)信息，并附上數(shù)據(jù)庫(kù)和參考文獻(xiàn)來(lái)源。對(duì)于胚系突變，除了疾病診療指南及重要參考文獻(xiàn)外，推舉參OMIMHGMDACMG導(dǎo)注釋臨床意義，并附上數(shù)據(jù)庫(kù)和參考文獻(xiàn)來(lái)源。陰性結(jié)果并不能完全排除患者不存在基因突變，可能是由于檢出靈敏度或檢測(cè)區(qū)域局限性所致，報(bào)告中應(yīng)當(dāng)以醫(yī)師可以理解的方式對(duì)此予以說(shuō)明[19]。三、質(zhì)量掌握與治理1．試驗(yàn)室要求：1．試驗(yàn)室要求：NGS檢測(cè)試驗(yàn)室的總體設(shè)計(jì)與要求應(yīng)參考《分子病理診斷試驗(yàn)室建設(shè)指南〔試行〕》、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室工作導(dǎo)則》等行業(yè)文獻(xiàn)和要求。檢測(cè)人員、生物信息分析人員、報(bào)告分析人員和供給詢問(wèn)人2．質(zhì)量掌握：?jiǎn)T應(yīng)具備相應(yīng)專(zhuān)業(yè)背景且經(jīng)過(guò)相應(yīng)培訓(xùn)取得上崗資質(zhì)[20]。試驗(yàn)室區(qū)域設(shè)NGS檢測(cè)試劑及測(cè)序平臺(tái)應(yīng)首選CFDA認(rèn)可的產(chǎn)品。涉及試驗(yàn)室自配試劑、探針等，應(yīng)當(dāng)有嚴(yán)格的試劑制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程〔SOP〕，并經(jīng)過(guò)臨床試驗(yàn)室自建工程〔LDT〕驗(yàn)證合格前方可使用[11,18,21,22]。2．質(zhì)量掌握：NGS試驗(yàn)室應(yīng)建立質(zhì)量治理體系，對(duì)于標(biāo)本采集和處理、試驗(yàn)操作、生物信息分析和報(bào)告分析各個(gè)環(huán)節(jié)均需要建立SOP文件，試驗(yàn)操作程序和生物信息分析須經(jīng)過(guò)性能驗(yàn)證或確認(rèn)[15]。1血液腫瘤相關(guān)突變基因的種類(lèi)列表[1,2,3,4,5,6,7,8]試驗(yàn)環(huán)節(jié)需要設(shè)置陰/陽(yáng)性比照[11,18變信息的混合樣本作為質(zhì)控材料，并且其中應(yīng)當(dāng)包含最低檢測(cè)限的突變位點(diǎn)，試驗(yàn)時(shí)同時(shí)進(jìn)展檢測(cè)，以確保其檢出力量。陰性比照一般承受明確無(wú)突變或無(wú)核酸的樣本作為質(zhì)控材料，試驗(yàn)時(shí)同時(shí)進(jìn)展檢測(cè)，以確保試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)污染及無(wú)非特異性。試驗(yàn)室應(yīng)定期參與相應(yīng)檢測(cè)工程的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)或力量驗(yàn)證；假設(shè)無(wú)法〔如使用一樣檢測(cè)系統(tǒng)的試驗(yàn)室比對(duì)的方式，推斷檢驗(yàn)結(jié)果的可承受性。3．信息系統(tǒng)：都可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果中存在假陽(yáng)性或者假陰性。試驗(yàn)室需要確定適宜的cutoffcutoff疑似單堿基插入或缺失的未知突變，建議進(jìn)展人工核對(duì)，并承受Sanger測(cè)序、ARMS-PCR、數(shù)字PCR等方法進(jìn)展驗(yàn)證。而對(duì)于cutoff值以下的ARMS-PCRPCR建庫(kù)/測(cè)序方法進(jìn)展驗(yàn)證[18NGS肯定數(shù)量的“試驗(yàn)室特異性“的突變，此類(lèi)突變是該檢測(cè)系統(tǒng)特有的假陽(yáng)性突變，應(yīng)在報(bào)告時(shí)予以剔除。3．信息系統(tǒng)：信息系統(tǒng)的功能應(yīng)滿足臨床需要，包括數(shù)據(jù)分析、存儲(chǔ)、傳輸及安全性等。生物信息分析流程應(yīng)包括全部的算法、軟件、腳本、參考序列和數(shù)據(jù)庫(kù)，可以是內(nèi)部的、供給商開(kāi)發(fā)的或開(kāi)源的。試驗(yàn)室應(yīng)有記錄NGS生物信息分析步驟的書(shū)面程序用來(lái)分析、解釋、報(bào)告NGS檢測(cè)結(jié)果，且針對(duì)每份NGS病例數(shù)據(jù)分析報(bào)告，需要設(shè)立追溯機(jī)制，確保檢測(cè)中涉及的生物信息數(shù)據(jù)分析流程能夠追溯[11,15的保存期限，并在醫(yī)