定量PCR中-ct值的含義

實(shí)時熒光定量PCR實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。一.

實(shí)時熒光定量PCR原理

所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。1.

Ct值的定義

在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。圖1.Ct值的確定2.

熒光域值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-153.

Ct值與起始模板的關(guān)系

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系〔1〕，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值（如圖2所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖2.熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線4.

熒光化學(xué)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料〔2〕。現(xiàn)將其原理簡述如下：TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如圖3所示。板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著〔7,8〕。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。

美國Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方〔9〕。

AppliedBiosystems公司的7700型實(shí)時熒光定量PCR儀是全球公認(rèn)的熒光定量PCR的金標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，而不用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。

綜上所述，利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域〔10,11,12,13〕。參考文獻(xiàn)1.

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基線（Baseline）：是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線。

熒光域值（threshold）的設(shè)定：一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR第3—15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。

CT值：表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)。縱坐標(biāo)代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。擴(kuò)增曲線PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過程中實(shí)時熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所做的曲線

判斷擴(kuò)增曲線是否良好的指標(biāo)主要有幾個方面：

1、曲線拐點(diǎn)清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)象，低濃度樣本擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯。

2、曲線指數(shù)期斜率與擴(kuò)增效