第十章-基因工程菌發(fā)酵

第十章基因工程菌的發(fā)酵

基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用與工程設計十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代?；蚬こ袒蚬こ痰暮诵募夹g是DNA的重組技術。除DNA重組技術外，基因工程還應包括基因的表達技術，基因的突變技術，基因的導入技術等。基因工程一般分為4個步驟：取得符合人們要求的DNA片段，這種DNA片段被稱為“目的基因”；將目的基因與質(zhì)?；虿《綝NA連接成重組DNA；把重組DNA引人某種細胞；把目的基因能表達的受體細胞挑選出來。工程菌的獲得確定目的產(chǎn)物，找出產(chǎn)該產(chǎn)物的細胞。將細胞破碎后提純出全部信使RNA。這些信使中包含了該細胞內(nèi)表達的所有蛋白質(zhì)的合成信息。利用基因擴增技術（PCR），找出所需的目的基因。將目的基因連接到設計好的質(zhì)粒載體，形成了重組DNA分子。將重組后DNA分子引入到受體細胞內(nèi)，然后選擇合適的培養(yǎng)條件使細胞繁殖。根據(jù)選擇性標記，從菌落中篩選出目的基因的重組(工程)菌。工程菌具備的條件發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，同時是分泌型菌株。菌株能利用常用的碳源，并可進行連續(xù)發(fā)酵。菌株不是致病株，也不產(chǎn)內(nèi)毒素。代謝控制容易進行。能進行適當?shù)腄NA重組，并且穩(wěn)定，重組的DNA不易脫落?；蚬こ叹l(fā)酵動力學基因工程菌發(fā)酵設備基因工程菌的高密度發(fā)酵和控制基因工程菌發(fā)酵的后處理技術基因工程菌的不穩(wěn)定性及對策應用案例與分析基因工程菌發(fā)酵動力學

基因工程菌發(fā)酵動力學模型分類基因工程菌培養(yǎng)過程的動力學模型理想情況：把細胞群體處理為一種溶質(zhì)不考慮細胞結構，但各種細胞均一細胞之間不均一細胞內(nèi)部多組分細胞之間無差異細胞內(nèi)部多組分均衡生長均衡生長非結構模型結構模型平均細胞近似平均細胞近似非離散模型離散模型

非離散、非結構模型（均衡生長模型）假設培養(yǎng)體系是均一的，忽略細胞間的差異和不同時期組成及代謝特性的差異適于研究細胞群體代謝生長代謝規(guī)律離散非結構模型

培養(yǎng)體系中的細胞被區(qū)分成許多不同的狀態(tài)和功能類型，對培養(yǎng)過程中細胞存在明顯差異的系統(tǒng)是適合的。結構非離散模型

細胞被分散成多個不同功能的部分，各部分相互協(xié)調(diào)作用，對分析胞內(nèi)代謝調(diào)控有應用價值。離散結構模型

細胞培養(yǎng)過程的實際情況，模擬單個細胞內(nèi)的生化反應體系，通過單細胞模型的不同組合建立高層次的離散結構模型外源基因的表達和控制機制質(zhì)粒的行為規(guī)律外界環(huán)境對工程菌生長和產(chǎn)物表達的綜合影響研究內(nèi)容外源基因的表達和控制機制

外源基因的表達由組成型基因或構建質(zhì)粒時加入的Lac、Trp、Pl、Pr等啟動子控制質(zhì)粒的行為規(guī)律與宿主、質(zhì)粒本身外界環(huán)境等密切相關工程菌培養(yǎng)過程中會發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，嚴重影響外源基因產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量質(zhì)粒的行為規(guī)律原

因分配的不穩(wěn)定性結構不穩(wěn)定性質(zhì)粒不同拷貝狀態(tài)分配不穩(wěn)定：這是由于在細胞分裂過程中質(zhì)粒缺失分配到子細胞中而導致整個質(zhì)粒丟失。結構性不穩(wěn)定：由于重組質(zhì)粒DNA發(fā)生缺失、插入或重排引起的質(zhì)粒結構變化。質(zhì)粒保持率

為考察質(zhì)粒穩(wěn)定性，在此引入質(zhì)粒保持率Fn的概念，F(xiàn)n表示分批培養(yǎng)中細胞分裂n次后，培養(yǎng)液中基因工程細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值，即表達效率及質(zhì)?？截悢?shù)控制

在工程菌培養(yǎng)過程中，表達效率與質(zhì)?？截悢?shù)有關。在質(zhì)粒穩(wěn)定基礎上，應盡可能提高細胞內(nèi)質(zhì)?？截悢?shù)。在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細胞負荷，此時拷貝數(shù)較低，而比生長速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質(zhì)?？截悢?shù)增加，目的基因產(chǎn)量提高。質(zhì)粒行為動力學模型的建立意義

控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性確定質(zhì)粒的復制速率表達產(chǎn)物合成條件外界環(huán)境對工程菌生長及產(chǎn)物表達的綜合影響工藝：多采用二階段培養(yǎng)在一定時間內(nèi)提高菌體濃度改變外界條件促使目的產(chǎn)物表達添加誘導物后基因工程菌的反應分類基本不變比生長速率受到?jīng)_擊，適應一段時間后恢復到適當水平比生長速率單調(diào)下降基因工程菌發(fā)酵設備

機械攪拌發(fā)酵罐氣升式發(fā)酵罐利用機械攪拌作用，使空氣和攪拌液充分混合，促進氧的溶解和傳遞，滿足微生物生長代謝對溶氧的需求原理：無菌壓縮空氣作為液體的提升力，使發(fā)酵液上下翻動實現(xiàn)混合和傳質(zhì)傳熱過程。優(yōu)點：無機械攪拌機構最大限度的減少了染菌率，減少了機械剪切力，對長菌絲的各種真菌尤為適宜氣體提升充分的氣液混合使氧氣的傳遞利用極大提高，特別適合高粘度培養(yǎng)基和對于溶氧要求高的產(chǎn)品。基因工程菌的高密度發(fā)酵和控制

培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)方式的選擇溶解氧的控制溫度的影響及控制PH的影響及控制基因工程菌的發(fā)酵工藝中菌體的增殖和產(chǎn)物的表達均在對數(shù)期完成改進：延長對數(shù)期的生長時間、縮短衰亡時間高密度發(fā)酵工藝培養(yǎng)基的選擇

發(fā)酵特點：工程菌在短時間內(nèi)迅速分裂增殖，菌體密度迅速升高培養(yǎng)基影響：高濃度的碳源、氮源和無機鹽造成溶液的滲透壓過高，導致細胞脫水，抑制菌體生長，目的產(chǎn)物得率下降大量產(chǎn)生乙醇，抑制菌體濃度的進一步升高多采用分批補料培養(yǎng)，各種培養(yǎng)基濃度低于抑制濃度成分的選擇選擇容易被工程菌利用的營養(yǎng)物質(zhì)濃度的選擇濃度比普通培養(yǎng)基高2-3倍，但不能太高，會使發(fā)酵液滲透壓增加，不利于工程菌的生長培養(yǎng)方式的選擇

補料分批培養(yǎng)方法葡萄糖濃度反饋控制流加恒速流加指數(shù)流加溶解氧的控制

措施：增大攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量方法：提高通氣中氧的分壓在菌體中克隆具有提高氧傳質(zhì)能力VHb蛋白溫度的影響及控制

生長和產(chǎn)物表達兩個方面，分別維持不同的溫度PH的影響及控制菌體生長和產(chǎn)物合成的PH控制在6.8-7.6較高的PH對產(chǎn)物的產(chǎn)量有促進作用基因工程菌發(fā)酵的后處理技術

細胞破碎蛋白質(zhì)的濃縮與分離純化核酸的分離純化酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醇=25：24：1）。

1）使用注意酚通常是透明無色的結晶，如果酚結晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。

2）安全操作酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。使用酚時應注意基因工程菌的不穩(wěn)定性及對策

不穩(wěn)定的表現(xiàn)不穩(wěn)定的原因及對策質(zhì)粒不穩(wěn)定性表達產(chǎn)物的不穩(wěn)定性原因培養(yǎng)基的組成組分通過各種途徑影響穩(wěn)定遺傳培養(yǎng)溫度低溫有利于穩(wěn)定