基因組序列詮釋強(qiáng)伯勤

關(guān)于基因組序列詮釋強(qiáng)伯勤問題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個(gè)整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因，研究基因地功能呢？第2頁,共71頁，2024年2月25日，星期天1.尋找基因1.1根據(jù)開放讀框預(yù)測基因⑴起始密碼子ATG第一個(gè)ATG的確定(依據(jù)Kozak規(guī)則);Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果.

所謂Kozak規(guī)則，即第一個(gè)ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律.第3頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Kozak規(guī)則:

若將第一個(gè)ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1)第4位的偏好堿基為G；(2)ATG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。第4頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

信號(hào)肽分析軟件(SignalPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/signalP)

把預(yù)測過程中證實(shí)含完整mRNA5’端的序列翻譯為蛋白序列;

然后用SignalP軟件對前50個(gè)氨基酸序列(從第一個(gè)ATG對應(yīng)的甲硫氨酸Met開始)進(jìn)行評估，如果SignalP分析給出正面結(jié)果，則測試序列有可能為信號(hào)肽;⑵

信號(hào)肽分析第5頁,共71頁，2024年2月25日，星期天⑶

終止密碼子

終止密碼子:TAA，TAG，TGAGC%=50%終止密碼子每64bp出現(xiàn)一次；

GC%>50%終止密碼子每100－200bp出現(xiàn)一次；由于多數(shù)基因ORF均多于50個(gè)密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是ORF不少于100個(gè)密碼子。第6頁,共71頁，2024年2月25日，星期天⑷3’端的確認(rèn)

3’端的確認(rèn)主要根據(jù)Poly(A)尾序列,若測試DNA片段不含Poly(A)序列，則根據(jù)加尾信號(hào)序列“AATAAA”和BLAST同源性比較結(jié)果共同判斷。第7頁,共71頁，2024年2月25日，星期天⑸非編碼序列、內(nèi)含子高等真核生物ORF閱讀的復(fù)雜性：基因間存在大量的非編碼序列（人類基因組中是70%）絕大多數(shù)基因含有非編碼的內(nèi)含子。

高等真核生物多數(shù)外顯子長度少于100個(gè)密碼子，有的不到50個(gè)密碼子甚至更少；不能根據(jù)ORF長度判斷讀框的準(zhǔn)確性。第8頁,共71頁，2024年2月25日，星期天編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異：如人類基因中，

丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA,GCC或GCT,而GCG很少蘇氨酸（Thr）密碼子多為ACA,ACC或ACT,而ACG很少⑹

密碼子偏愛性第9頁,共71頁，2024年2月25日，星期天⑺

密碼子偏愛性

高等植物207個(gè)基因單子葉植物53個(gè)，6個(gè)單子葉種群，18種氨基酸有16種氨基酸的密碼子搖擺堿基為G+C雙子葉植物154個(gè)，35個(gè)雙子葉種群，只有7種氨基酸的搖擺堿基是G+C，其余均為A+T密碼子偏倚codonbias，原因不明。第10頁,共71頁，2024年2月25日，星期天⑻

外顯子－內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征：如:內(nèi)含子的5‘端或稱供體位（donorsite）常見的順序?yàn)?’－AG↓GTAAGT-3’；3’端又稱受體位（acceptorsite),多為5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；但是由于邊界序列常有例外，僅適用于一定范圍。第11頁,共71頁，2024年2月25日，星期天⑼上游控制序列

幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達(dá)。

通過同源性比較來預(yù)測mRNA的5’端，最常用的與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫是真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(TheTRADATProject,EukaryoticPromoterDatabase,EPD.http://www.epd.unil.ch/)。

另外個(gè)別生物基因組的特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動(dòng)物基因組許多基因的上游都有CpG島。第12頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

⑽

內(nèi)含子和外顯子序列差異內(nèi)含子受選擇壓力小，突變多。由于堿基C到A，內(nèi)含子A/T比例高內(nèi)含子A/T比例高，所以終止密碼子出現(xiàn)的頻率高。第13頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

⑾

軟件預(yù)測采用NCBI的ORF預(yù)測軟件(ORFfinder:/gorf/orfig.cgi)判斷ORF的可能范圍。第14頁,共71頁，2024年2月25日，星期天基因注釋軟件Genscan——重于信號(hào)指令：起始密碼、終止密碼、剪接受體位和供體位序列等FgeneSH——重于內(nèi)容指令：密碼子使用偏好、內(nèi)含子外顯子的差異等TWINSCAN和SGP2——根據(jù)相似性和一致性第15頁,共71頁，2024年2月25日，星期天基因注釋軟件缺點(diǎn)外顯子注釋的準(zhǔn)確率<80%。誤拼和誤拆錯(cuò)誤較多。容易忽略結(jié)構(gòu)較小的基因，特別是基因內(nèi)基因。

線蟲基因的注釋19477個(gè)軟件預(yù)測

11984個(gè)克隆驗(yàn)證，未能預(yù)測到的cDNA和EST為4365個(gè)第16頁,共71頁，2024年2月25日，星期天1.2同源查詢途徑

通過已存入數(shù)據(jù)庫中的基因順序與待查的基因組序列進(jìn)行比較，從中查找可與之匹配的堿基順序及其比例，用于界定基因的方法稱為同源查詢。

第17頁,共71頁，2024年2月25日，星期天相似性有如下幾種情況：

ADNA序列某些片段完全相同；B開放讀碼框（ORF）排列類似，如有長外顯子；C開放讀碼框翻譯成氨基酸序列的相似性；D模擬多肽高級(jí)結(jié)構(gòu)相似同源基因：氨基酸的一致性和相似性>25%第18頁,共71頁，2024年2月25日，星期天同源性：homology起源于同一祖先但序列已經(jīng)發(fā)生變異的序列，分布在不同物種間的同源基因，只有是與非的區(qū)別。一致性：identity同源DNA序列的同一堿基位置上相同的堿基成員，或者蛋白質(zhì)中同一氨基酸位置相同的氨基酸成員的比例，用%表示。相似性：similarity同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例。比較氨基酸和基因的同源性？第19頁,共71頁，2024年2月25日，星期天分子雜交可確定DNA片段是否含有表達(dá)順序Northernblot：指將待測DNA樣品標(biāo)記后與RNA雜交，以判斷RNA中是否含有DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。但在操作中存在一些問題1.3試驗(yàn)確認(rèn)基因第20頁,共71頁，2024年2月25日，星期天1977年J.C.Alwin首創(chuàng)Northernblotting

第21頁,共71頁，2024年2月25日，星期天問題解決方案A某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行可變剪接或該基因?yàn)槟骋欢嗷蚣易宓某蓡T時(shí)，會(huì)出現(xiàn)多個(gè)雜交帶設(shè)計(jì)其他實(shí)驗(yàn)區(qū)分第22頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共71頁，2024年2月25日，星期天心肌特異性蛋白第24頁,共71頁，2024年2月25日，星期天問題解決方案B基因的表達(dá)具有組織特異性及發(fā)育階段的差別，而選擇的RNA樣品中不一定含有該基因產(chǎn)物盡可能多地收集各種不同發(fā)育時(shí)期及不同組織器官的RNA第25頁,共71頁，2024年2月25日，星期天問題解決方案C某些基因產(chǎn)物豐度極低或不易提取適當(dāng)提高RNA上樣量，或先以已知的DNA序列設(shè)計(jì)引物從mRNA中擴(kuò)增基因產(chǎn)物第26頁,共71頁，2024年2月25日，星期天C基因表達(dá)產(chǎn)物豐度的問題擬Northern雜交——根據(jù)已知的DNA順序設(shè)計(jì)引物，從mRNA群體中擴(kuò)增基因產(chǎn)物，再以DNA為探針與之雜交。動(dòng)物園雜交——根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低的原理。第27頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共71頁，2024年2月25日，星期天DNA順序中基因位置的確定

cDNA測序受兩個(gè)方面的影響：一是相關(guān)cDNA在cDNA文庫中出現(xiàn)的頻率；二是cDNA的完整性第29頁,共71頁，2024年2月25日，星期天如何獲取基因全長cDNA序列？AcDNA文庫構(gòu)建BRACE技術(shù)第30頁,共71頁，2024年2月25日，星期天干擾cDNA篩選基因的因素：目標(biāo)cDNA所占比例很低分成亞群進(jìn)行篩選cDNA均一化

影響cDNA測序的因素與mRNA的反轉(zhuǎn)錄有關(guān)第31頁,共71頁，2024年2月25日，星期天cDNA文庫構(gòu)建(CLONTECH)第32頁,共71頁，2024年2月25日，星期天cDNA文庫構(gòu)建(CLONTECH)第33頁,共71頁，2024年2月25日，星期天5’RACE(CLONTECH)第34頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3’RACE(CLONTECH)第35頁,共71頁，2024年2月25日，星期天確定DNA順序中基因的位置A通過對全長cDNA序列的測序、對比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；B通過物種已建立遺傳圖和物理圖來確定基因的位置；第36頁,共71頁，2024年2月25日，星期天利用計(jì)算機(jī)分析基因功能2、基因功能的預(yù)測2.1同源性確定基因功能2.2同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用第37頁,共71頁，2024年2月25日，星期天2.1同源性確定基因功能

種間同源基因或直系基因（orthologousgene）：指不同物種之間的同源基因，它們來自物種分化以前的共同祖先

種內(nèi)同源基因或平行基因（paralogousgene）同一物種內(nèi)的同源基因，它們常常是多基因家族的不同成員第38頁,共71頁，2024年2月25日，星期天同源基因一般不會(huì)有完全一致的核苷酸序列，因?yàn)椴煌幕蚧虿煌纳锒紩?huì)獨(dú)立地發(fā)生隨機(jī)突變，但它們有相似的序列，大部分未突變的核苷酸位置是相同的

同源性分析可以給出整個(gè)基因或其中某一區(qū)段功能的有關(guān)信息第39頁,共71頁，2024年2月25日，星期天2.2同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用酵母基因組大約含有6000個(gè)基因30％是通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析得到的另外70％是用同源性分析獲得第40頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3.1基因失活在基因功能分析的作用3.2基因的超表達(dá)用于功能檢測3、實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能第41頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3.1.1基因剔除(knock-out)

最簡便的基因失活的方法.

主要原理:

在一段無關(guān)DNA片段的兩側(cè)連接與代換基因兩側(cè)相同的順序，將這一構(gòu)建導(dǎo)入目的細(xì)胞，由于同源片段之間的重組，可使無關(guān)片段取代靶基因,整合到染色體中。為了便于篩選，用于取代的外源DNA中含有報(bào)告基因。3.1基因失活在基因功能分析的作用第42頁,共71頁，2024年2月25日，星期天tk胸苷激酶標(biāo)記基因←gangcyclovirneor新霉素抗性基因→G418第43頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3.1.2反義RNA

反義RNA是由基因的負(fù)鏈編碼，可與正義RNA(senseRNA)或DNA編碼順序結(jié)合，干擾mRNA的轉(zhuǎn)錄，加工和轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控基因的表達(dá)。第45頁,共71頁，2024年2月25日，星期天構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體:

將全目的基因或部分目的基因反向插入表達(dá)載體→轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物→獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體或品系→分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異→判別目的基因的功能第46頁,共71頁，2024年2月25日，星期天正義表達(dá)載體反義表達(dá)載體第47頁,共71頁，2024年2月25日，星期天反義RNA作用機(jī)理：

A干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細(xì)胞降解。

B與mRNA的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無法啟動(dòng)。

C反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板，轉(zhuǎn)錄終止。第48頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3.1.3RNA干涉

RNAi是通過雙鏈RNA的介導(dǎo),特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制.第49頁,共71頁，2024年2月25日，星期天RNAi作用機(jī)理AdsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活，它把dsRNA加工成21~25個(gè)核苷酸長的RNA鏈；B這些小片段RNA(siRNA)作為另一個(gè)核糖核酸復(fù)合體RISC(RNA-inducesilencingcomplex,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的指引物，結(jié)合到RISC上，使之識(shí)別并降解mRNA，從而導(dǎo)致與雙鏈RNA同源的基因沉默；第50頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第51頁,共71頁，2024年2月25日，星期天RNAi設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用AFraser合成與開放讀碼框相對應(yīng)的雙鏈RNA或利用細(xì)菌克隆表達(dá)這些雙鏈RNA→微量注射和喂食→干擾同源基因的表達(dá)BChuang等設(shè)計(jì)出嵌合體結(jié)構(gòu)→連接強(qiáng)啟動(dòng)子大量表達(dá)雙鏈mRNA→干擾同源基因的表達(dá)第52頁,共71頁，2024年2月25日，星期天HbF基因的RNAi載體構(gòu)建第53頁,共71頁，2024年2月25日，星期天RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)RNAi最根本的特點(diǎn)是特異性RNAi具有特殊的穿越能力，而且干擾作用會(huì)傳給后代；RNAi對一些低水平表達(dá)的基因的RNAi現(xiàn)象并不明顯，而且?guī)讉€(gè)有相同或相似序列的基因，RNAi也會(huì)同時(shí)作用與它們。第54頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3.2基因超表達(dá)增加基因的拷貝數(shù)采用強(qiáng)啟動(dòng)子促使基因超表達(dá)第55頁,共71頁，2024年2月25日，星期天構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變庫酵母雙雜交（yeasttwo-hybridization）3.3 其他方法第56頁,共71頁，2024年2月25日，星期天3.3.1轉(zhuǎn)座子插入突變第57頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

上世紀(jì)三十年代，玉米遺傳學(xué)家

BarbaraMcClintock在研究中發(fā)現(xiàn)了玉米籽粒色斑不穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象，可能是一種可轉(zhuǎn)移的遺傳因子。第58頁,共71頁，2024年2月25日，星期天1944：美國國家科學(xué)院院士1945：美國遺傳學(xué)會(huì)主席1983：NobelPrize，35年后將轉(zhuǎn)位因子的重大發(fā)現(xiàn)歸功于她McClintock（1902-1992）第59頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

Ac和Ds這兩個(gè)因子都位于玉米的第九號(hào)染色體短臂，在色素基因C的附近。

Ac因子全長4.5kb，有5個(gè)外顯子，其產(chǎn)物是轉(zhuǎn)座酶。Ac因子兩端是長11bp的反向重復(fù)序列(IR)；

Ds因子長0.4-4kb，它的中間(在轉(zhuǎn)座酶基因中)有許多種長度不等的缺失,Ds的兩端也都有11bp的反向重復(fù)序列。第60頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

Ac-Ds轉(zhuǎn)座元件結(jié)構(gòu)示意圖。右邊示Ac及Ds元件的單鏈DNA末端反向重復(fù)配對所形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可能對轉(zhuǎn)座有意義第61頁,共71頁，2024年2月25日，星期天玉米轉(zhuǎn)座因子對胚乳顏色的影響

第62頁,共71頁，2024年2月25日，星期天35SAc轉(zhuǎn)座酶NPTIIIAAHAcTATA

GUS

NPTIIIAAHDsEIAAHDsGIA

GUS

NPTIIIAAH吲哚乙酸水解酶，NAM（萘乙酰胺）敏感第63頁,共71頁，2024年2月25日，星期天35SAc轉(zhuǎn)座酶NPTIIIAAHAcTATA

GUS

NPTIIIAAHDsEIAAHDsGIA

GUS

NPTII增強(qiáng)子捕獲TATA

GUS

NPTIIEEE外顯子IA

GUS

NPTII內(nèi)含子基因捕獲外顯子IA

GUS

NPTII外顯子外顯子突變體庫構(gòu)建載體策略第64頁,共71頁，2024年2月25日，星期天A、插入突變隱性突變體庫構(gòu)建