基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)

關(guān)于基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第2頁,共102頁，2024年2月25日，星期天工具酶在生物技術(shù)中能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄及其它修飾等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)稱為工具酶。酶是DNA重組技術(shù)中必不可少的工具。第3頁,共102頁，2024年2月25日，星期天核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶DNA連接酶RNA聚合酶磷酸酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶核苷酸激酶甲基化酶第4頁,共102頁，2024年2月25日，星期天主要工具酶第5頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第四節(jié)DNA修飾酶第7頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶核酸酶：核糖核酸酶RNase：脫氧核糖核酸酶DNase：核酸外切酶exonuclease：核酸內(nèi)切酶endonuclease：通過切割兩相鄰核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵，使核酸分子的多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。專門水解斷裂RNA分子特異水解斷裂DNA分子

從核酸分子末端開始，一個一個核苷酸地消化降解多核苷酸鏈從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔研纬尚∑蔚?頁,共102頁，2024年2月25日，星期天限制性內(nèi)切酶Restrictionenzymes(分子手術(shù)刀)在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈打開。識別DNA上特定堿基組成的序列并在這些序列位點上切斷DNA分子水解磷酸二酯鍵的一種內(nèi)切核酸酶。第9頁,共102頁，2024年2月25日，星期天主要來源于原核生物自我保護(hù)作用功能來源據(jù)1994年美國出版的《分子生物學(xué)百科全書》統(tǒng)計，僅Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶就已從各種不同的微生物中分離出了2300種以上，可識別230種不同的DNA序列。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌能將外來DNA片段在某些專一位點上切斷，而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護(hù)，一起構(gòu)成限制-修飾系統(tǒng)。第10頁,共102頁，2024年2月25日，星期天早在上世紀(jì)60年代Linn和Arber在研究噬菌體的寄主范圍時發(fā)現(xiàn)如下的現(xiàn)象：分別在E.coli的K菌株和B菌株上生長的λ噬菌體（稱λK和λ

B）能高效感染各自的宿主;但用λK感染B菌株或用λ

B去感染K菌株則感染率會大大降低，這就是限制。如果一旦λK感染B菌株成功則在B菌株中形成的后代也就能高效感染B菌株，再也沒有限制現(xiàn)象，這個現(xiàn)象稱為修飾。限制和修飾是由宿主控制的，故稱為宿主控制的限制和修飾作用。限制-修飾系統(tǒng)第11頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共102頁，2024年2月25日，星期天限制限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。修飾Dam甲基化酶：GATC腺嘌呤N6位置引入甲基Dcm甲基化酶：CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置引入甲基第13頁,共102頁，2024年2月25日，星期天現(xiàn)已從各種微生物中發(fā)現(xiàn)與鑒定出3800余種限制-修飾系統(tǒng)，其中有限制性內(nèi)切核酸酶3819個、甲基轉(zhuǎn)移酶844個?，F(xiàn)已商品化的限制酶624個，甲基轉(zhuǎn)移酶32個。1.限制性內(nèi)切核酸酶的類型Ⅰ型限制性內(nèi)切酶（90個）

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶（3714個）

Ⅲ型限制性內(nèi)切酶（12個）

第14頁,共102頁，2024年2月25日，星期天

I型限制性內(nèi)切酶1968年首先由M.Meselson和R.Yuan在從大腸桿菌B株和K株分離（1）識別位點序列未甲基化修飾的特異序列

EcoB：TGA(N)8TGCT

EcoK：AAC(N)6GTGC（2）切割位點在距離特異性識別位點約1000—1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈（3）作用條件需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）第15頁,共102頁，2024年2月25日，星期天首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離第一個酶是HindⅡ，其次是

HindIII。II類限制性內(nèi)切酶（1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）,與DNA的來源無關(guān)。（2）切割位點識別位點處切開雙鏈DNA。形成粘性末端或平齊末端（3）粘性末端EcoRI5’-G

A

A

T

T

C-3’5’端凸出

3’-C

T

T

A

A

G-5’

EcoRV5’-G

A

T

A

T

C-3’

3’-C

T

A

T

A

G-5’PstI

5’-C

T

G

C

A

G-3’

3’-G

A

C

G

T

C-5’

3’端凸出

第16頁,共102頁，2024年2月25日，星期天III類限制性內(nèi)切酶在完全肯定的位點切割DNA（一般在識別位點24-26bp），但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸）。EcoP1:AGACC——EcoP15:CAGCAG——在基因工程操作中用途不大第17頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共102頁，2024年2月25日，星期天2.限制性內(nèi)切核酸酶的命名1）用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母，構(gòu)成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。2）將該菌株名的第一個字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則用一個大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗藥性R質(zhì)粒3）如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。4）還要冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)命名為R，甲基化酶為M。如R.HindⅢ表示限制性內(nèi)切酶M.HindⅢ表示相應(yīng)的甲基化酶。實際應(yīng)用中，R常被省略。（EcoRI、HindⅢ）第19頁,共102頁，2024年2月25日，星期天1）識別序列的特異性未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（4-6bp，多數(shù)是呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型的回文結(jié)構(gòu)）。與DNA的來源無關(guān)，即沒有種的特異性。3.Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的基本特性第20頁,共102頁，2024年2月25日，星期天稀有切割限制性內(nèi)切核酸酶（rarecutter）可以識別6個以上的核苷酸序列的少數(shù)的限制內(nèi)切酶。如Not

I

（GCGGCCGC）某些限制性內(nèi)切酶的識別序列中，某一個或兩個堿基并非嚴(yán)格專一。如HindⅡ可識別不止一種核苷酸序列：

Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-HindⅡ可識別幾種核苷酸序列？GTCGAC和GTTAAC第21頁,共102頁，2024年2月25日，星期天2）Ⅱ型限制性內(nèi)切酶不具有甲基化功能Ⅱ型酶的甲基化修飾活性由相應(yīng)的甲基化酶承擔(dān)。它們識別相同的DNA序列，但功能不同。如EcoRI限制性內(nèi)切酶和EcoRI甲基化酶前者：5’-G

AATTC-3’

3’-CTTAA

G-5’后者：5’-GAA*TTC-3’

3’-CTT*AAG-5作用的位點也不相同兩者命名如何區(qū)分？功能有何不同？第22頁,共102頁，2024年2月25日，星期天3）切割位點的特異性形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易得多。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。粘性末端的意義①連接便利末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。②末端標(biāo)記③補(bǔ)平成平齊末端第23頁,共102頁，2024年2月25日，星期天粘性末端與平齊末端連接的處理方法?。┨硌a(bǔ)法：利用DNA聚合酶Ⅰ(klenowfragment）將堿基添補(bǔ)到目的基因的粘性末端上。ⅱ）削除(平)法利用S1和Bal31等核酸酶將目的基因粘性末端的單鏈突出部分削去，使其成為平齊末端第24頁,共102頁，2024年2月25日，星期天平齊末端的特點連接困難，連接效率低，只有粘性末端連接效率的1%，這種連接常出現(xiàn)多聯(lián)體連接。在識別序列的對稱軸上同時切割EcoRV5’-G

A

T

A

T

C-3’

3’-C

T

A

T

A

G-5’第25頁,共102頁，2024年2月25日，星期天不同來源的酶，識別相同的序列，切割方式相同或不同。識別位點和切點完全相同如HindⅢ

和HsuIHindⅢ

5’-A

A

G

C

T

T-3’3’-T

T

C

G

A

A-5’HsuI5’-A

A

G

C

T

T-3’3’-T

T

C

G

A

A-5’4.同切點酶（Isoschizomer)1）原型酶的同切點酶（同裂酶）：第26頁,共102頁，2024年2月25日，星期天識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。2）新裂酶：第27頁,共102頁，2024年2月25日，星期天識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、BclI、XhoⅡ等5’-G

G

A

T

C

C-3’3’-C

C

T

A

G

G-5’BamHIBclI5’-T

G

A

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A-3’3’-A

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T

A

G

A-5’BglⅡ5’-U

G

A

T

C

Y-3’3’-Y

C

T

A

G

U-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。5.同尾酶(Isocaudamers）基因工程載體構(gòu)建過程常用的同尾酶有：BamHI/BglII,EcoRI/MunI,SalI/XhoI,XbaI/SpeI。第28頁,共102頁，2024年2月25日，星期天同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。5’-G3’-C

C

T

A

GG

A

T

C

T-3’A-5’BamHIBgl

Ⅱ5’-G

G

A

T

C

T-3’3’-C

C

T

A

G

A-5’5’-G

G

A

T

C

C-3’3’-C

C

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A

G

G-5’5’-A

G

A

T

C

T-3’3’-T

C

T

A

G

A-5’BamHIBgl

ⅡG

G

A

T

CCA

G

A

T

C

T第29頁,共102頁，2024年2月25日，星期天6、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1）.DNA樣品的純度加大酶的用量，1ugDNA用10U酶擴(kuò)大反應(yīng)體積（>20l）延長保溫時間添加陽離子亞精胺一般采取在DNA樣品中若含有蛋白質(zhì)，或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子，均會降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。

DNA的濃度不宜過高，高濃度的DNA會使溶液的粘度增加從而抑制酶分子的擴(kuò)散導(dǎo)致酶切反應(yīng)不徹底。常為50ul內(nèi)含1ugDNA。第30頁,共102頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2）DNA的甲基化程度DNA腺嘌呤甲基化酶（DNAadeninemethylas,dam)（修飾GATC中的A）；DNA胞嘧啶甲基化酶（DNAcytosineethylas,dcm)（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木辍２溉閯游锏腄NA通常在鳥嘌呤核苷殘基的5'側(cè)也發(fā)生甲基化。甲基化程度與DNA來源的細(xì)胞類型、環(huán)境等有密切的關(guān)系?？梢愿鶕?jù)各種同裂酶所具有的不同的甲基化的敏感性對真核基因組DNA的甲基化作用模式進(jìn)行研究。例如，當(dāng)CCGG序列中內(nèi)部胞嘧啶殘基被甲基化之后，MspI仍會將它切割，而HpaII(正常情況下能切割CCGG序列)對此類的甲基化作用則十分敏感。第31頁,共102頁，2024年2月25日，星期天不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。3）酶切反應(yīng)的溫度第32頁,共102頁，2024年2月25日，星期天4）DNA分子的構(gòu)型構(gòu)型：對超螺旋的質(zhì)?；虿《綝NA酶切時，所需酶量大于線性狀態(tài)。位點偏愛性：EcoRⅠ酶切割

噬菌體中的5個位點時，近左端的位點比分子中間的位點切割快10倍。對只含識別序列不具催化活性：必須在兩側(cè)各延長一個或幾個核苷酸。（設(shè)計引物帶酶切位點必須考慮保護(hù)堿基）第33頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共102頁，2024年2月25日，星期天是影響限制酶活性的重要因素5）緩沖液(Buffer)緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/AcK

：提供Mg2+和離子強(qiáng)度Tris-HCl：維持pH,大多數(shù)為7-7.6二硫蘇糖醇（DTT）：防止酶氧化,保持酶穩(wěn)定性牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白質(zhì),防止酶在低濃度的蛋白質(zhì)溶液中變性商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液第35頁,共102頁，2024年2月25日，星期天如果改變反應(yīng)條件就會影響酶的專一性和切割效率，稱為星號（*）活性。7、酶的星號活性特異性的限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的DNA裂解，可以從這些酶的最適合的不同的反應(yīng)條件下發(fā)生的松弛或改動的。其結(jié)果通常是在非規(guī)范的識別位點裂解，或有時完全喪失的特異性。在低鹽、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：第36頁,共102頁，2024年2月25日，星期天誘發(fā)星（*）活性的原因酶量不宜過多，盡量遵循生產(chǎn)商推薦的反應(yīng)條件高濃度甘油AvaI、AvaⅡ、PstI、XbaI堿性PH值A(chǔ)viⅡ、MstI低離子強(qiáng)度ApeI低鹽濃度

Bst707I低PH值PshBI其他二價離子代替mg2+(Mn,Cu,Co,Zn等)HindⅢ、SfiIβ-巰基乙醇+低離子強(qiáng)度AvaⅢ有機(jī)溶劑(DMSO、乙醇等)酶與底物DNA比例過高第37頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共102頁，2024年2月25日，星期天8、限制性內(nèi)切酶對DNA的消化內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式

1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。第39頁,共102頁，2024年2月25日，星期天1）DNA分子的單酶切環(huán)狀DNA：完全酶切時，產(chǎn)生與識別序列數(shù)(n)相同的DNA片斷數(shù)，且DNA片斷的兩末端相同；線性DNA：n+1片斷數(shù)。EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI第40頁,共102頁，2024年2月25日，星期天2)DNA分子的雙酶切消化在相同的緩沖液中反應(yīng)同時進(jìn)行若需要不同的緩沖液,采用3種方法ⅰ)先用要求低離子強(qiáng)度的酶切割（低鹽酶）,再加NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度,并用第二種酶切割（高鹽酶）；ⅱ)先用最適反應(yīng)溫度較低的酶，升溫后再加入第二種酶；ⅲ)反應(yīng)體系相差大的，第一種酶切反應(yīng)后回收，再切割。第41頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共102頁，2024年2月25日，星期天基因工程中一般使用雙酶切？BamHIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIEcoRIBamHI單酶切陽性克隆比例非常低；單酶切無方向性。第43頁,共102頁，2024年2月25日，星期天3）完全酶切消化與不完全酶切10kb1kb3kb6kbEcoRIEcoRI6kb3kb1kb10kb9kb1kb6kb4kb3kb完全酶切不完全酶切通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度、增大反應(yīng)體積或減少酶量可達(dá)到局部消化的目的。第44頁,共102頁，2024年2月25日，星期天9、酶切反應(yīng)的終止65℃保溫20min，或70℃10min。加入終止反應(yīng)液，多為電泳上樣緩沖液，主要成分為50%甘油，100mMEDTA（pH=8.0），1%SDS和0.1%溴酚藍(lán)。用飽和酚、氯仿抽提DNA方法純化。第45頁,共102頁，2024年2月25日，星期天10、酶切反應(yīng)的操作過程配酶解體系混勻反應(yīng)終止酶解結(jié)果鑒定ddH2O+buffer+DNA+酶一般20μl，酶體積不超過總體積的10%，盡量降低反應(yīng)總體積。DNA量大的情況下，可適當(dāng)放大反應(yīng)體系。移液槍吹打或手指輕彈管壁應(yīng)避免強(qiáng)烈振蕩。離心機(jī)短暫離心，使管壁液體全部下沉。瓊脂糖凝膠電泳200010007505002501001：pBS-T空載體（EcoRⅠ+HindⅢ）；2,3：重組質(zhì)粒（EcoRⅠ+HindⅢ）；4：目的基因；第46頁,共102頁，2024年2月25日，星期天10.Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的主要用途第47頁,共102頁，2024年2月25日，星期天BamHIEcoRIBamHI思考題1載體基因1500bp2000bp如何將該基因完整片段整合到載體上？第48頁,共102頁，2024年2月25日，星期天方法1：單酶切BamHI載體基因1500bp2000bpBamHIEcoRI載體EcoRIEcoRI缺點？第49頁,共102頁，2024年2月25日，星期天如何鑒定單酶切連接產(chǎn)物方向BamHIEcoRIBamHI載體基因1500bp2000bp第50頁,共102頁，2024年2月25日，星期天方法2：部分酶切（雙酶切）BamHI載體基因1500bp2000bpBamHIEcoRI載體EcoRI缺點？BamHIEcoRIBamHIBamHI第51頁,共102頁，2024年2月25日，星期天EcoRIBamHIBamHI1.EcoRI完全酶切EcoRIBamHIBamHI2.BamHI部分酶切EcoRIBamHIBamHI部分酶切的方法？部分酶切的結(jié)果多少條帶？1500bp2000bp13510min第52頁,共102頁，2024年2月25日，星期天方法3：同尾酶（雙酶切）BamHI載體基因1500bp2000bpBamHIEcoRI載體EcoRI缺點？BamHIEcoRIBgl

IIBamHIBglII?MunI?第53頁,共102頁，2024年2月25日，星期天GCCTAG

AATTCGGATCCGGCTTAA

GATCCGGCTTAA

BamHIEcoRIBamHIEcoRI第54頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)DNA連接酶1、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)1967年，世界上數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。

定義：一種能夠催化雙鏈DNA片段靠在一起的3′羥基末端與5′磷酸基團(tuán)末端，通過磷酸二酯鍵連接在一起的核酸酶第55頁,共102頁，2024年2月25日，星期天2、DNA連接酶的性質(zhì)修復(fù)DNA-DNA雙鏈上的單鏈缺口；連接RNA-DNA雜交雙鏈上的DNA單鏈缺口；連接兩個完全斷開的平末端雙鏈DNA分子。X第56頁,共102頁，2024年2月25日，星期天DNA連接酶催化的連接反應(yīng)特點：需要在一條DNA鏈的3’-末端具有一個游離的羥基(-OH)，和在另一條DNA鏈的5’-末端具有一個磷酸基團(tuán)(-P)。利用NAD或ATP作能源。不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分。只封閉缺口，不封閉裂口。第57頁,共102頁，2024年2月25日，星期天3、常用的DNA連接酶對RNA-DNA分子無效活性低，不常用第58頁,共102頁，2024年2月25日，星期天4、DNA連接酶作用機(jī)理ATP（NAD+)提供激活的AMP。ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。AMP與連接酶的賴氨酸

-氨基相連。AMP隨后從連接酶的賴氨酸

-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。第59頁,共102頁，2024年2月25日，星期天5、影響連接反應(yīng)的因素1）反應(yīng)溫度連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。實用溫度粘性末端：一般采用4-16C。平末端：一般采用10-20C。但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。第60頁,共102頁，2024年2月25日，星期天

T4DNA連接酶的活性一般用Weiss單位來衡量，即37℃條件下20min內(nèi)可使1nmol/L32P在有機(jī)焦磷酸與ATP之間產(chǎn)生交換的酶量為1個活性單位。黏性末端連接酶濃度0.1單位以上即可，而平末端連接可能需要1-2個活性單位。

反應(yīng)時間，在16℃時，4h即可，而在4℃時則需連接過夜。2）連接酶濃度第61頁,共102頁，2024年2月25日，星期天3）ATP濃度一般，濃度范圍在10μmol-1mmol/L，ATP最適的終濃度為0.5mmol/L。ATP濃度高至5mmol/L，影響平頭末端的連接。ATP濃度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平頭末端的連接。第62頁,共102頁，2024年2月25日，星期天

相同的分子末端間存在競爭，形成不同構(gòu)型的DNA分子（自身環(huán)化、線形多聚體、環(huán)化多聚體以及重組質(zhì)粒）。分子越小、濃度越低越容易形成自身環(huán)化；另要注意載體與目的DNA濃度之比。4.DNA片段末端類型與濃度插入片段：載體=3:1增加插入片段與載體的接觸機(jī)會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。單酶切產(chǎn)物連接比例需要更高。第63頁,共102頁，2024年2月25日，星期天從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多。6、平頭雙鏈DNA片段的連接操作提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM第64頁,共102頁，2024年2月25日，星期天7、DNA連接的反應(yīng)體系DNA+vector3:1ligase0.5-1UH2Oupto10-20ulligasebuffer第65頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)DNA聚合酶1、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow聚合酶、TaqDNA聚合酶T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶第66頁,共102頁，2024年2月25日，星期天1）共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端，催化核苷酸聚合，合成與模板互補(bǔ)的DNA序列2）主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。2、常用DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。第67頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第68頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第69頁,共102頁，2024年2月25日，星期天3'→5'外切酶活性──校對作用：這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中沒有反應(yīng)底物dNTP時，由于沒有聚合作用而出現(xiàn)暫時的游離現(xiàn)象，從而被3'→5'外切酶活性所降解。當(dāng)向反應(yīng)體系加入dNTP，而且只加放與模板互補(bǔ)的上述核苷酸才會使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進(jìn)行DNA的合成。由此推論，3'→5'外切酶活性的主要功能是校對作用，當(dāng)加入的核苷酸與模板不互補(bǔ)而游離時則被3'→5'外切酶切除，以便重新在這個位置上聚合對應(yīng)的核苷酸。第70頁,共102頁，2024年2月25日，星期天5'→3'外切酶活性──切除修復(fù)作用：5'→3'外切酶活性就是從5'→3'方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部分（雙鏈）磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力達(dá)10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對岡崎片段5'末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。第71頁,共102頁，2024年2月25日，星期天3、常用DNA聚合酶的用途1）大腸桿菌DNA聚合酶I(PolI)活性:5`→3`聚合活性,5`→3`外切和3`→5`外切活性發(fā)揮生物學(xué)活性的條件：（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3`-端游離羥基(3'-OH)的引物鏈（3）底物和激活劑應(yīng)用:缺口平移法(nicktranslation)標(biāo)記DNA探針注:對雙鏈DNA，當(dāng)有dNTPs存在時，3`→5`降解活性會

被5`→3`方向的聚合活性所抑制。第72頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第73頁,共102頁，2024年2月25日，星期天缺口DNaseIDNA聚合酶IDNA聚合酶IdNTP*缺口缺口平移法制備DNA分子探針第74頁,共102頁，2024年2月25日，星期天2.Klenow聚合酶Klenow聚合酶即大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（klenowfragment)活性:具有5'

3’聚合酶活性和3'

5’外切酶活性.

(失去了5'

3'外切酶活性）用途：第75頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第76頁,共102頁，2024年2月25日，星期天從棲熱水生菌（Thermusaquaticus）分離，最適溫度75℃-80℃。特點：熱穩(wěn)定性70℃反應(yīng)2h殘留活性為原來的90%；93℃反應(yīng)2h殘留活性為原來的60%；94℃反應(yīng)2h殘留活性為原來的40%。活性：具有5'

3’聚合酶活性和5'

3'外切酶活性.

(無3'

5’外切酶活性）應(yīng)用：（1）DNA序列測定（2）PCR：對DNA的特定片段進(jìn)行體外擴(kuò)增3.TaqDNA聚合酶第77頁,共102頁，2024年2月25日，星期天4.T4DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：與klenow聚合酶一樣，但是3`→5`

的核酸外切酶活性要強(qiáng)200倍。有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性在無dNTP時，可以從任何3`-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補(bǔ)核苷酸在四種dNTP均存在時，聚合酶活性占主導(dǎo)地位第78頁,共102頁，2024年2月25日，星期天切割3'凸出末端補(bǔ)平5'凸出末端DNA3'端標(biāo)記第79頁,共102頁，2024年2月25日，星期天5.T7DNA聚合酶活性:5`→3`聚合酶活性；3`→5`外切酶活性，無5`→3`外切酶活性特點:與T4DNA聚合酶相似，3`→5`外切酶活性更強(qiáng)，為klenow聚合酶的1000倍，并具有極佳的連續(xù)合成能力,不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響。應(yīng)用：（1）用于長模板DNA的引物延伸反應(yīng)；（2）通過單純的延伸或取代合成途徑標(biāo)記DNA的3`末端；（3）使雙鏈DNA的5`或3`突出末端變成平末端測序酶：化學(xué)方法修飾的T7DNA聚合酶，無外切酶活性，修飾后聚合酶活性增加3倍。更適合序列分析。第80頁,共102頁，2024年2月25日，星期天逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)：又稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶?；钚裕壕?`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3`-OH的RNA或DNA。6.逆轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄酶(禽類骨髓細(xì)胞瘤病毒)：具反轉(zhuǎn)錄酶活性，強(qiáng)RNaseH活性。反應(yīng)溫度42℃，最適pH8.3。小片段cDNA的反轉(zhuǎn)錄；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(小鼠白血病病毒)：具反轉(zhuǎn)錄酶活性，弱RNaseH活性，以RNA-DNA為底物的5’-3’外切酶活性。反應(yīng)溫度37℃，42℃時迅速失活，最適pH7.6。反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段可達(dá)5kb。第81頁,共102頁，2024年2月25日，星期天反轉(zhuǎn)錄實驗：去除DNA（DNase消化）RNA變性（65℃5min立即冰?。┮锝Y(jié)合（polyA\隨機(jī)引物\特異引物）cDNA合成（42℃）bufferdNTP反轉(zhuǎn)錄酶可加RNase抑制劑第82頁,共102頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)修飾酶一、堿性磷酸酶功能：

催化核酸脫去5`-磷酸基團(tuán)，使DNA或RNA片段5`-P末端轉(zhuǎn)換成5`-OH末端。來源：有兩種，分別來自于大腸桿菌和小牛腸道，前

者叫bacterialalkalinephosphatase(BAP);后

者叫calfintestinalalkalinephosphatase(CIAP)第83頁,共102頁，2024年2月25日，星期天主要用途：在用32P標(biāo)記DNA5’端之前，去除5'端的磷酸；在DNA重組技術(shù)中，去除DNA片段5'磷酸，防止載體的自身環(huán)化。第84頁,共102頁，2024年2月25日，星期天二、T4多核苷酸激酶1.來源T4polynucleotidekinase由T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。多種哺乳動物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化

磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5’端使缺失5`-P末端的DNA發(fā)生磷酸化作用第85頁,共102頁，2024年2月25日，星期天三、末端轉(zhuǎn)移酶是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase,TdT）的簡稱，來自于小牛胸腺組織，在DNA分子的3'-OH端增加一個或多個脫氧核苷酸特點①5’

3’DNA聚合酶活性②不需要模板！③底物可以是單鏈DNA、3’-OH突出的雙鏈DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④隨機(jī)添加dNTPs。如果只有一種dNTP，就添

加上同聚物。第86頁,共102頁，2024年2月25日，星期天

用途：

(1)主要用于給外源DNA片段和及載體分子加上互

補(bǔ)同聚物尾巴；

(2)標(biāo)記DNA片段的3`末端。第87頁,共102頁，2024年2月25日，星期天四、核酸酶1.S1核酸酶來源：來源于稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）功能：是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶。注意：對雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA-RNA雜交體相對不敏感。用途：(1)催化單鏈RNA或DNA