基因與基因工程

基因工程的創(chuàng)立與發(fā)展與基因的研究之間的內(nèi)在聯(lián)系

基因的研究為基因工程的創(chuàng)立奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，基因工程的誕生是基因研究發(fā)展的必然結(jié)果；

基因工程技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，又深刻并有力地影響著基因的研究，使我們對(duì)基因本質(zhì)的認(rèn)識(shí)提高到了一個(gè)空前的高度。第2頁,共64頁，2024年2月25日，星期天1基因研究的發(fā)展基因的發(fā)展大體可劃分為三個(gè)階段基因的染色體遺傳學(xué)階段(細(xì)胞遺傳學(xué)):

20世紀(jì)50年代之前，主要從細(xì)胞染色體水平上進(jìn)行研究?；虻姆肿由飳W(xué)階段(分子遺傳學(xué)):

20世紀(jì)50年代之后，主要從DNA水平上進(jìn)行研究?；蚬こ虒W(xué)階段(分子生物技術(shù)):

20世紀(jì)70年代，重組DNA技術(shù)的建立，使基因的研究進(jìn)入了反向生物學(xué)研究階段。第3頁,共64頁，2024年2月25日，星期天5′3′5′5′3′3′2DNA的分子結(jié)構(gòu)及其特點(diǎn)DNA分子中各脫氧核苷酸之間以3′-5′磷酸二酯鍵連接。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列順序，因此攜帶有不同的遺傳信息。5′3′DNA分子是脫氧核苷酸的多聚體。第4頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

DNA堿基組成特點(diǎn)和規(guī)律不同物種間DNA堿基組成一般是不同的；一個(gè)給定物種的DNA堿基組成不因個(gè)體的年齡、營養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境改變而改變

；

DNA堿基組成的Chargaff定律：腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等，即[A]=[T]；鳥嘌呤和胞嘧啶的摩爾數(shù)也相等，即[G]=[C]；嘌呤的總數(shù)等于嘧啶的總數(shù)，即[A]+[G]=[C]+[T]。第5頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)（Watson-Crick模型）5′3′5′3′5′3′5′3′磷酸脫氧核糖堿基T-A堿基對(duì)C-G堿基對(duì)小溝大溝第6頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

DNA復(fù)制的一般特點(diǎn)

1、半保留復(fù)制2、固定的起點(diǎn)和方向3、半不連續(xù)4、需要RNA作為引物5、需要模板

DNA的特性DNA的復(fù)制

第7頁,共64頁，2024年2月25日，星期天DNA

的半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)實(shí)驗(yàn),證明了DNA是采取半保留的方式進(jìn)行復(fù)制.[15N]DNA原始分子[14N-15N]DNA第一子代[14N]DNA[14N-15N]DNA第二子代第8頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

DNA的特性DNA的變性

是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團(tuán)，因而發(fā)生性質(zhì)改變（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等），稱為DNA變性。

第9頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）由于DNA在260nm處有最大吸收值，因此，可利用DNA變性后波長260nm處紫外吸收的變化追蹤變性過程。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中堿基藏于內(nèi)側(cè)，變性時(shí)由于雙螺旋解開，于是堿基外露，260nm紫外吸收值因而增加，這一現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。第10頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

熔解溫度（meltingtemperature,Tm）通常把DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱為熔點(diǎn)或熔解溫度（meltingtemperature,Tm）。DNA的Tm一般在70-85℃之間。第11頁,共64頁，2024年2月25日，星期天1）DNA的均一性：均一性高的DNA，Tm值的范圍越窄；DNA的Tm值與以下因素有關(guān)：2）溶劑的性質(zhì)：離子強(qiáng)度較低的介質(zhì)中，DNA的Tm值較低，熔解溫度的范圍也較窄。因此，DNA制劑不應(yīng)保存在離子強(qiáng)度過低的溶液中，一般保存在1MNaCl溶液中較穩(wěn)定；

3）G-C含量：G-C含量越高，Tm值越高。第12頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

DNA的特性DNA的復(fù)性與雜交

復(fù)性(renaturation)：變性DNA在適當(dāng)條件，二條彼此分開的互補(bǔ)鏈重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性或退火(annealing)。雜交(hybridization):當(dāng)DNA復(fù)性時(shí)，來源不同的DNA(或RNA)片段,按堿基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子

。第13頁,共64頁，2024年2月25日，星期天復(fù)性在基因工程中的應(yīng)用顯示不同生物體間的遺傳相關(guān)性；檢測特定的DNA；考查某些序列在特定生物體DNA中的拷貝數(shù)；確定特定堿基序列在DNA中的位置；分離克隆基因。第14頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共64頁，2024年2月25日，星期天12345CKSouthernbloting第17頁,共64頁，2024年2月25日，星期天3基因的定義

經(jīng)典的基因概念：在染色體或DNA分子上，基因是成串珠似的一個(gè)挨一個(gè)地排列著，它們之間是由非遺傳的物質(zhì)連接起來。交換只是在基因之間進(jìn)行，而不是在基因內(nèi)部發(fā)生?；虻娜灰惑w論

遺傳功能單位交換單位突變單位第18頁,共64頁，2024年2月25日，星期天順反子概念的提出

1955年，Benzer通過對(duì)噬菌體的研究提出了順反子(cistron)概念。順反子(cistron)

：編碼一種完整多肽鏈的核苷酸序列。這種多肽既可以是一種具有生物活性的蛋白質(zhì)，也可同別的多肽聚合形成多功能的蛋白質(zhì)。

第19頁,共64頁，2024年2月25日，星期天順反子是功能單位，其最小交換單位(又稱交換子)和最小突變單位(又稱突變子)，都應(yīng)是DNA分子中的一個(gè)核苷酸對(duì)。順反子概念表明，基因不是最小的單位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸區(qū)段才是基因的編碼區(qū)。

第20頁,共64頁，2024年2月25日，星期天基因就是合成有功能意義的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列?；虻姆肿佣x：按照這個(gè)定義，一個(gè)基因應(yīng)包括哪些部分？

？第21頁,共64頁，2024年2月25日，星期天4基因的結(jié)構(gòu)1．基因的組成部分基因編碼區(qū)(codingregion)非編碼區(qū)(nocodingregion)啟動(dòng)區(qū)(promoterregion)

終止區(qū)(terminatorregion)第22頁,共64頁，2024年2月25日，星期天編碼區(qū)(codingregion)含有大量的遺傳密碼，包括起始密碼子(AUG)和終止密碼子(UAA,UAG或UGA)，以及表達(dá)子(exon)。

非編碼區(qū)(nocodingregion)指基因分子結(jié)構(gòu)中存在的對(duì)于遺傳信息表達(dá)所必須的、但卻不能轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)多肽的DNA序列。

5

-UTR，即5

-末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)；3

-UTR，即3

-末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)；Intron，即真核基因的間隔子序列。第23頁,共64頁，2024年2月25日，星期天啟動(dòng)區(qū)(promoterregion)指位于基因5

上游的一段具有特殊功能的DNA序列區(qū)，RNA聚合酶是通過同它結(jié)合作用而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。終止區(qū)(terminator)位于基因3

端下游外側(cè)與終止密碼子相連的一段非編碼的核苷酸短序列區(qū)，具有終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)的功能。第24頁,共64頁，2024年2月25日，星期天按照基因的定義，一個(gè)基因應(yīng)包括：⑴編碼蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA的核酸序列；⑵保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列、5′端非翻譯序列、內(nèi)含子、3′端非翻譯序列等所有的核酸序列。第25頁,共64頁，2024年2月25日，星期天2．原核基因的結(jié)構(gòu)原核基因的范圍原核基因(Prokargoticgene)：系指由原核生物如大腸桿菌基因組的編碼基因，以及高等植物葉綠體基因組的編碼基因，還有線粒體基因組的編碼基因，都是屬于原核基因。第26頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

……TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAA反向回文序列反向回文序列終止區(qū)序列+1-10-35轉(zhuǎn)錄區(qū)終止區(qū)啟動(dòng)區(qū)5

上游3

下游原核基因的結(jié)構(gòu)T80A95t45A60A50T96T82T84G78A65C54a45

ATGttgaca…………tataat…TAA5‘UTR3‘UTRN5-9N17NNNNNNNNNNNN……………第27頁,共64頁，2024年2月25日，星期天原核基因的mRNA結(jié)構(gòu)原核基因的mRNA編碼區(qū)(是連續(xù)不間斷的序列)轉(zhuǎn)錄而不轉(zhuǎn)譯的5

-UTR轉(zhuǎn)錄而不轉(zhuǎn)譯的3

-UTR第28頁,共64頁，2024年2月25日，星期天真核基因的范圍3．真核基因的結(jié)構(gòu)真核基因(Eukaryoticgene)：系指由真核細(xì)胞基因組的編碼基因和感染真核細(xì)胞的DNA病毒及反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的編碼基因均屬于真核基因。第29頁,共64頁，2024年2月25日，星期天+1-20-70轉(zhuǎn)錄區(qū)終止區(qū)啟動(dòng)區(qū)-80TATACCAATGC增強(qiáng)子內(nèi)含子剪接點(diǎn)內(nèi)含子剪接點(diǎn)內(nèi)含子真核基因的結(jié)構(gòu)加尾信號(hào)…ggccacaccc…ggccaatct…ggggcatataa………ATGCAACGGGCT…TGTGCTAT5‘UTR…GTCACTCAGgtaagg……catataggccaa……ctgcagTAGCAGCTG……AATAAA3‘UTR第30頁,共64頁，2024年2月25日，星期天真核基因的mRNA結(jié)構(gòu)真核基因的mRNA5

端帽的結(jié)構(gòu)5

-UTR3

端poly(A)尾巴編碼區(qū)3

-UTRm7G5’ppp-NmpNp-…AUGCTT…CAACGGUAA…AAUAAA……AAAAAA…5

端帽的結(jié)構(gòu)

3

端poly(A)尾巴第31頁,共64頁，2024年2月25日，星期天5基因的類型1．根據(jù)產(chǎn)物類型分類結(jié)構(gòu)基因(Structuralgenes)除了調(diào)節(jié)基因以外的編碼任何RNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。

調(diào)節(jié)基因(Regulatorgenes)其產(chǎn)物能夠控制另外一個(gè)基因或若干基因表達(dá)效率的基因。例如大腸桿菌lac操縱子的laci基因，其編碼蛋白質(zhì)能夠控制lac操縱子結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。第32頁,共64頁，2024年2月25日，星期天無誘導(dǎo)物時(shí)葡萄糖(+),乳糖(–)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)關(guān)閉第33頁,共64頁，2024年2月25日，星期天2．根據(jù)表達(dá)特性組成基因(Constitutivegenes)又叫做看家基因(Housekeepinggene)，是一類理論上在所有細(xì)胞類型中都能進(jìn)行表達(dá)、并為所有類型細(xì)胞生存提供必需的基本功能的基因。誘導(dǎo)基因(Induciblegenes)因環(huán)境中某種特殊物質(zhì)的存在而被誘導(dǎo)表達(dá)的基因，叫做“誘導(dǎo)型基因”，簡稱“誘導(dǎo)基因”。第34頁,共64頁，2024年2月25日，星期天3．根據(jù)實(shí)驗(yàn)用途選擇基因(Selectablegenes)

是指可使被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞獲得其親本細(xì)胞所不具備的新的遺傳特性，從而使得人們能夠使用特定的選擇性培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)化的新細(xì)胞從其親本細(xì)胞群體中選擇出來的一類特殊的基因。

選擇基因主要是一類編碼可使抗菌素(諸如氨芐青霉素、潮霉素、鏈霉素、卡那霉素等)或除草劑失活的蛋白酶基因。第35頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

Amp選擇培養(yǎng)基篩選A.pBridge-GmMYBZ1B.pBridge-GmMYBZ2C.pBridge-GmMYBJ6D.pBridge-GmMYBJ7

D

A

B

C

第36頁,共64頁，2024年2月25日，星期天C

A

B

D

A.CKB.GmMYBZ2C.GmMYBJ6D.GmMYBJ7第37頁,共64頁，2024年2月25日，星期天報(bào)告基因(reportergene)特指其編碼產(chǎn)物能被快速檢測，常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞、器官或組織的一類特殊的基因。常用的報(bào)告基因有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因，

-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，以及綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因。第38頁,共64頁，2024年2月25日，星期天promoter-GUSexpressionpattern第39頁,共64頁，2024年2月25日，星期天subcellularlocalizationoftheOsAbc1-2protein第40頁,共64頁，2024年2月25日，星期天3．根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)斷裂基因(splitgene)編碼序列不連續(xù)的間斷基因，即在其核苷酸序列中間插入了與氨基酸編碼無關(guān)的DNA間隔區(qū)，使一個(gè)基因分隔成若干個(gè)不連續(xù)的區(qū)段。第41頁,共64頁，2024年2月25日，星期天splitgene第42頁,共64頁，2024年2月25日，星期天移動(dòng)基因(movablegene)又叫跳躍基因或轉(zhuǎn)位因子，是指一種可以在染色體基因組上移動(dòng)，甚至在不同染色體之間、噬菌體及質(zhì)粒DNA之間躍遷的DNA短片段。

1951年由BarbaraMclintock（麥克林托克）首次在玉米中發(fā)現(xiàn)了一種控制元件，后來這個(gè)元件被命名為轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子。由此，BarbaraMclintock在1983年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。第43頁,共64頁，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)：不必借助同源序列就可移動(dòng)的DNA片段，即轉(zhuǎn)座作用與供體和受體之間的序列無關(guān)。轉(zhuǎn)座序列可沿染色體移動(dòng)，也可在不同染色體間跳躍（又稱之為跳躍基因）。原核生物和真核生物均有轉(zhuǎn)座子。第44頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

玉米轉(zhuǎn)座因子對(duì)胚乳顏色的影響紫色無色紫色斑點(diǎn)？第45頁,共64頁，2024年2月25日，星期天假基因(pseudogene)指一類同野生型基因序列大部分同源，但由于突變而失去活性的畸變的核苷酸序列。重疊基因(overlappinggene)又叫嵌套基因(nestedgene)。系指核苷酸編碼序列彼此重疊的、編碼不同蛋白質(zhì)的兩個(gè)或多個(gè)基因。重復(fù)基因(repeatgene)以串聯(lián)方式重復(fù)排列在特定染色體上的某些多拷貝基因。如rRNA基因、tRNA基因等。第46頁,共64頁，2024年2月25日，星期天6基因的表達(dá)1．正義鏈與反義鏈早期文獻(xiàn)：正義鏈(有意義鏈)：雙鏈DNA分子中轉(zhuǎn)錄成RNA分子的模板鏈。反義鏈(無意義鏈)：與有意義鏈互補(bǔ)的DNA鏈。第47頁,共64頁，2024年2月25日，星期天現(xiàn)代文獻(xiàn)：反義鏈(-鏈)：雙鏈DNA分子中轉(zhuǎn)錄成RNA分子的模板鏈。正義鏈(+鏈)：雙鏈DNA分子中的編碼鏈。除了以T堿基取代U堿基之外，與RNA轉(zhuǎn)錄本具有同樣的序列結(jié)構(gòu)。第48頁,共64頁，2024年2月25日，星期天2．基因的表達(dá)基因表達(dá)：基因通過DNA的轉(zhuǎn)錄和RNA的翻譯等過程，將其所攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)多肽鏈(或RNA轉(zhuǎn)錄本)的過程。定義：第49頁,共64頁，2024年2月25日，星期天組成性表達(dá)(constitutiveexpression)基因表達(dá)的方式看家基因較少受環(huán)境因素影響，而是在個(gè)體各個(gè)生長階段的大多數(shù)或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。這類基因表達(dá)視為基本的或組成性基因表達(dá)。第50頁,共64頁，2024年2月25日，星期天適應(yīng)型或調(diào)節(jié)型表達(dá)(adaptiveorregulatoryexpression)

有一些基因表達(dá)極易受環(huán)境變化影響而改變，稱為適應(yīng)型或調(diào)節(jié)型表達(dá)。在特定環(huán)境信號(hào)刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因是可誘導(dǎo)的，稱為誘導(dǎo)。相反，如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答時(shí)被抑制，基因表達(dá)產(chǎn)物水平降低，稱為阻遏。第51頁,共64頁，2024年2月25日，星期天第52頁,共64頁，2024年2月25日，星期天時(shí)間特異性：按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按特定的時(shí)間順序發(fā)生，這是基因表達(dá)的時(shí)間特異性。多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時(shí)間特異性又稱階段特異性?；虮磉_(dá)的時(shí)間性及空間性空間特異性：在個(gè)體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個(gè)體按不同組織空間順序出現(xiàn)，這就是基因表達(dá)的空間特異性，又稱細(xì)胞特異性或組織特異性。第53頁,共64頁，2024年2月25日，星期天mRNA加工成熟水平上的調(diào)控(differentialprocessingofRNAtranscript)轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptionalregulation)翻譯水平上的調(diào)控(differentialtranslationofmRNA)3.基因的表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控水平DNA水平上的調(diào)控(regulationonDNAlevel)翻譯后水平上的調(diào)控(differentialpost-translationofmRNA)第54頁,共64頁，2024年2月25日，星期天

DNARNA反饋(?)轉(zhuǎn)錄復(fù)制

翻譯

蛋白質(zhì)生理功能圖:遺傳信息傳遞的“中心法則”示意圖（21世紀(jì)后修正的）tRNA和rRNA小RNA（microRNAs）非編碼RNA（Non-codingRNA）第55頁,共64頁，2024年2月25日，星期天順式作用元件和反式作用因子順式作用元件(cis-actingelement):是指影響自身基因表達(dá)活性的DNA序列（如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和增強(qiáng)子）。它作為一種原位（insitu）順序，其活性只影響與其自身處在同一個(gè)DNA分子上的基因。第56頁,共64頁，2024年2月25日，星期天啟動(dòng)子起正性調(diào)控作用

增強(qiáng)子順式作用元件起負(fù)性調(diào)控作用——沉默子第57頁,共64頁，2024年2月25日，星期天反式作用因子(trans-actingfactor)：調(diào)控轉(zhuǎn)錄的各種蛋白因子總稱反式作用因子。其編碼基因與其識(shí)別或結(jié)合的靶核苷酸序列不在同一個(gè)DNA分子上。第58頁,共64頁，