立體選擇性的制備治療酰胺的酶催化方法

立體選擇性的制備治療酰胺的酶催化方法專利名稱：立體選擇性的制備治療酰胺的酶催化方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明范圍本發(fā)明涉及合成藥用化合物和在合成這樣的化合物中所使用的中間體的方法。具體地講本發(fā)明涉及立體選擇性制備具有叔醇立體中心的N-芳基或-吡啶基丙酰胺，和用于合成這些化合物的對映中間體的新的酶催化方法。本發(fā)明背景1993年12月21日頒布給Russell等的美國專利5272163中公開了N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺和其它的N-芳基或-吡啶基丙酰胺。這些化合物是細胞鉀通道的啟動劑(openers)并因此用于治療尿失禁和其它疾病及紊亂，包括高血壓、哮喘、外周血管疾病及咽峽炎，正如上述專利所公開的。美國專利5272163也公開了制備N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的(S)-(-)對映體的方法，該方法應(yīng)用非對映異構(gòu)體的酯形成后進行層析分離，隨后用堿處理除去酯基團。本發(fā)明概述本發(fā)明提供立體選擇性制備具有叔醇立體中心的N-芳基或-吡啶基丙酰胺的新的酶催化方法，例如制備(S)-(-)-N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺。這些化合物是細胞鉀通道的啟動劑并因此用于治療尿失禁和其它疾病及紊亂，包括高血壓、哮喘、外周血管疾病和咽峽炎。本發(fā)明的新方法使用酶催化步驟選擇性從N-芳基或吡啶基丙酰胺所形成酯的外消旋混合物的一個對映體上裂解酯基。酶催化步驟后，從如此所產(chǎn)生的醇中分離剩余的酯。在酶催化步驟中未被裂解的回收酯(若需要)可以水解產(chǎn)生相應(yīng)的醇。本發(fā)明也提供用于合成上述N-芳基或-吡啶基丙酰胺的中間體的合成方法，例如在制備(S)-(-)-N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺中所使用的(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的制備。在此提供立體選擇性合成具有叔醇立體中心的N-芳基或-吡啶基丙酰胺，例如(S)-(-)-N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺，及在合成這些化合物時使用的中間體的方法。在下列本發(fā)明詳細描述的優(yōu)選實施例中描述所附的權(quán)利要求書中本發(fā)明的各個方面。本發(fā)明詳細描述本發(fā)明的第-個方面是提供制備具有旋光性的活性式Ⅰ化合物的方法其中E選自氮和CZ，其中C是環(huán)碳，Z是下述定義的取代基，其中當E是CZ時，X和Z選自(A)X是ArY，其中Y為選自羰基、亞磺?；突酋；倪B接基團，Ar選自用選自鹵素、羥基、氰基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基的0-2個取代基取代的苯基；含有1-2氮原子作為僅有的雜原子的六元雜芳環(huán)；含有選自氮、氧和硫的1-2雜原子的五元雜芳環(huán)，和Z選自氫、氰基、鹵素、羥基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基；和(B)X是氰基，Z選自苯硫基，苯基亞磺?；捅交酋；渲斜江h(huán)被選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基的0-2個取代基所取代；和當E是氮時，X獨立選自任在上述(A)中給出的X的任何值；和*是具有旋光性的活性的手性中心，所述方法包括用水解酶處理式Ⅱ的外消旋化合物的步驟。式Ⅱ化合物定義如下式Ⅱ其中E和X在此具有上述所定義的意義；和R1是由獨立選自羥基、鹵素、C1-C4烷氧基、氰基、C1-C4烷胺基和C1-C4二烷胺基的一個或多個取代基任選取代的烷基。優(yōu)選為R1是任選取代的C1-C7烷基，更優(yōu)選任選取代的C1-C5烷基。優(yōu)選取代基為鹵素，更優(yōu)選氯。在本發(fā)明方法中，水解酶從式Ⅱ酯的一個對映體上裂解酯提供如式Ⅰ醇的(S)或(R)的對映體，這取決于酶的特異性，并將另一對映體留于未反應(yīng)的底物中。本發(fā)明方法也包括從未反應(yīng)的原料中分離在酶催化步驟中形成的產(chǎn)物的步驟，即，分離在酶處理中形成的式Ⅰ醇和式Ⅱ原料化合物的未反應(yīng)酯。酶從式Ⅱ化合物的外消旋混合物的一個對映體中選擇地裂解酯基生成醇。使用常規(guī)方法如硅膠柱層拆分離式Ⅰ化合物和式Ⅱ未反應(yīng)的酯原料。當所需的對映體是未反應(yīng)的酯時，本發(fā)明方法可以進一步包括將所述酯轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇。通過用堿如氫氧化鈉處理可將所述酯轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇。本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施例將提供制備(S)-(-)-N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺(式Ⅰ其中*為(S)構(gòu)型，E是CZ,X是ArY,Y是羰基，Ar是苯基，和Z是氫)的方法。使用本領(lǐng)域中所知的常規(guī)方法將外消旋的N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺轉(zhuǎn)化成酯。例如，使外消旋化合物在堿如三乙胺存在下與式Ⅲ酰氯反應(yīng)式Ⅲ其中R1具有上述定義的意義，如流程Ⅰ所示。優(yōu)選式Ⅲ化合物包括一氯乙酰氯和丁酰氯。例如，使用美國專利5382598的方法或在此所述的方法可以制備外消旋的N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺。然后使由N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺衍生的酯與水解酶反應(yīng)，優(yōu)選脂酶，更優(yōu)選粗品豬胰脂酶，它選擇地裂解(R)對映體的酯基，留下(S)對映體的酯。該反應(yīng)優(yōu)選在約pH7的緩沖水溶液中用叔-丁基甲基醚(MTBE)為共溶劑中進行。然而，可以理解緩沖溶液的pH將取決于反應(yīng)中所使用的酶。在反應(yīng)混合物中存在的共溶劑是任選的。使反應(yīng)進行直到可用底物已反應(yīng)為止，可能是約一天至約三天。該反應(yīng)可進行快或慢取決于所使用的酶和反應(yīng)條件。使用相反特異性酶在酶催化步驟中直接從(S)對映體裂解酯基也是可能的。流程1(S)-(-)-N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺通過一般方法如硅膠柱層析或任何其它適當方法可以從N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的(R)對映體分離出(S)酯。當酯是(S)對映體時，用堿如氫氧化鈉在甲醇水溶液或其它溶劑中處理除去酯基并提供(S)-(-)-N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺。本發(fā)明的該方面以合成(S)-(-)-N-(4-苯甲酰基苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺為例證。用流程Ⅰ所描述的方法，通過N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺這樣的化合物的取代外消旋混合物可以制備其它的式Ⅰ的N-芳基或-吡啶基丙酰胺。一些取代基可能需要使用保護基。根據(jù)美國專利5382598的方法可以制備式Ⅰ化合物的外消旋混合物。流程2表示(S)-(-)-N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的制備，其中通過用拆分試劑選擇性結(jié)晶而不是酶方法制備(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸中間體。如流程2所示，使1,1,1-三氟丙酮(1)與氰化物如氰化鈉在酸如鹽酸的存在下反應(yīng)，形成外消旋的3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈(2)。然后外消旋的3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈(2)用如鹽酸或硫酸水解提供外消旋的3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸(3)。然后用拆分試劑如(1R,2S)-降麻黃堿選擇地結(jié)晶外消旋物(3)形成鹽(5)，可以重結(jié)晶成非對映異構(gòu)體純度。純化的鹽(6)含有(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸(7)。從鹽釋出(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸(7)與4-氨基二苯酮(8)和SOCl2，使用有機堿如三乙胺或Hunig氏堿反應(yīng)形成(S)-(-)-N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺(9)，然后通過重結(jié)晶純化。對制備具有S構(gòu)型的式Ⅰ其它的N-芳基或-吡啶基丙酰胺而言，如下述定義的式Ⅳ胺取代流程2所示合成中的4-氨基二苯酮。所述的胺與(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸以類似方法反應(yīng)產(chǎn)生酰胺產(chǎn)物，然后任選經(jīng)常規(guī)方法純化。在美國專利5272163中也描述了式Ⅳ胺。流程2式Ⅳ化合物定義如下式Ⅳ其中X和E具有上述定義的意義。根據(jù)美國專利5272163公開的方法可以制備式Ⅳ這樣的胺。除流程2所示的方法，式Ⅳ化合物與(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸在其它適當?shù)娜軇┖驮谄渌m當偶合劑存在下可進行偶合反應(yīng)?？梢允褂米鳛橐话汶呐己蟿┑谋绢I(lǐng)域熟知的適當偶合劑，例如亞硫酰氯[Morris等，J.Med.Chem.,34,447,(1991)]，羰基二咪唑(CDI)和二環(huán)己基碳二亞胺，并任選在催化劑如二甲基氨吡啶(DMAP)或4-吡咯烷并吡啶的存在下。適當?shù)娜軇┌ǘ谆阴０?、二氯甲烷、苯、四氫呋喃和二甲基甲酰胺。偶合反?yīng)在約-40℃～40℃溫度范圍內(nèi)進行。另一方面，本發(fā)明提供制備用于合成美國專利5272163中公開的(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺和其它的N-芳基或-吡啶基丙酰胺中的(S)對映體中間體的立體選擇性方法。(S)對映體中間體使(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺或式Ⅰ的其它N-芳基或-吡啶基丙酰胺制備不需要使用拆分試劑如α-甲基芐胺或降麻磺堿形成冗長的立體選擇鹽的步驟。本發(fā)明提供立體選擇方法，每個方法含有酶催化步驟，用于制備(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈和(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸。在制備這樣中間體的第一個立體選擇方法中，通過使用水解酶，優(yōu)選脂酶如Candidaantarctica脂酶選擇性裂解外消旋3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的酯制備(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸。所述方法包括用水解酶處理優(yōu)選具有式Ⅴ的3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的酯式Ⅴ其中R2是C1-C6烷基，C1-C4烷氧基或苯基。使用常規(guī)方法制備酯，如從外消旋酸用礦物酸作用和適當醇制備。例如，使外消旋3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸和丙醇或丁醇在少量濃硫酸或干燥氯化氫存在下反應(yīng)分別生成丙酯或丁酯來制備丙酯和丁酯。在適當醇的存在下，通過用硫酸水解外消旋3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈也可以制備式Ⅴ酯。通過水解酶，優(yōu)選脂酶如Candidaantarctica脂酶，選擇性地裂解式Ⅴ酯生成酯和酸的混合產(chǎn)物。用水解酶的反應(yīng)優(yōu)選在所用的酶可接受的pH的緩沖水溶液中進行，通常在約pH5和約pH9之間以得到良好的反應(yīng)速率。也可以使用共溶劑如甲基-叔丁基醚(MTBE)。使反應(yīng)進行至有滿意量的酯反應(yīng)為止，通常約1-3天后。實際反應(yīng)時間取決于多種因素，如所使用的酶、底物和溶劑。然后使用本領(lǐng)域中熟知的硅膠層析或任何其它適當?shù)姆椒ǚ蛛x所述的酯和酸。根據(jù)酶的選擇性，所需的(S)對映體可以以回收的未反應(yīng)的酯或游離酸形式存在。在該情況下未反應(yīng)的酯含有(S)對映體，通過與堿如氫氧化鈉反應(yīng)，除去酯基生成(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸，隨后中和。為了制備(S)-(-)-N-(4-苯甲?；交?-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺，根據(jù)在此的方法，使(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸與4-氨基二苯酮反應(yīng)。正如所述，使用(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸和在流程2所示合成中用式Ⅳ的胺代替4-氨基二苯酮制備其它的N-芳基或-吡啶基丙酰胺式Ⅰ。式Ⅴ化合物式Ⅴ其中R2是C3-C6烷基，C1-C4烷氧基或苯基，形成本發(fā)明的另一方面。式Ⅵ化合物式Ⅵ其中*是具有旋光性的活性手性中心，R2是C2-C6烷基，C1-C4烷氧基或苯基，形成本發(fā)明的又一方面。優(yōu)選*是具有(S)構(gòu)型的具有旋光性的活性手性中心。在制備這樣的中間體的第二個立體選擇方法中，通過處理或使式Ⅶ化合物反應(yīng)，可制備(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸，式Ⅶ其中A是CN、COH、CH(OR3)2、COR4、COOR5、CONH2、CONHR6或CONR7R8；R3、R4、R5、R6、R7和R8獨立選自烷基、芳基和芳烷基；R9是烷基、芳基或芳烷基，其中任何一個可獨立任選用選自羥基、鹵素、C1-C4烷氧基、氰基、C1-C4烷胺基或C1-C4二烷胺基取代基所取代，用水解酶，優(yōu)選脂酶如粗品豬胰脂肪酶，選擇性地裂解酯基提供相應(yīng)的式Ⅷ醇，式Ⅷ其中*是具有旋光性的活性手性中心和A具有先前定義的意義，和將式Ⅷ化合物的A基團轉(zhuǎn)化成酸(即COOH基團)。R9優(yōu)選為任選取代的C1-C10烷基，更優(yōu)選C1-C5烷基。A優(yōu)選CN。優(yōu)選R3、R4、R5、R6、R7和R8獨立是C1-C10烷基，更優(yōu)選C1-C5烷基。使用水解酶的反應(yīng)可在緩沖水溶液中進行，將溶液的pH調(diào)至所使用的酶可接受的值，一般在約pH7和約pH7.5之間。也可以使用共溶劑如MTBE。使反應(yīng)進行至滿意量的酯反應(yīng)為止。通常使反應(yīng)進行約3天，但實際時間將取決于多種因素，如所使用的酶，底物和溶劑。然后用常規(guī)方法如硅膠柱層析分離醇和酯的混合物。根據(jù)酶的選擇性，所需的(S)對映體可以以回收的(未反應(yīng))酯或醇形式存在。當所需(S)對映體是回收的酯時，可用堿如氫氧化鈉處理酯除去酯基。用常規(guī)方法將A基團轉(zhuǎn)化成羧基提供(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸。根據(jù)A的性質(zhì)可任選將酯基去除和腈基水解步驟結(jié)合。在優(yōu)選的實施例中，使(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈與酸反應(yīng)制備(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸。通過使1,1,1-三氟丙酮與氰化鈉在鹽酸存在反應(yīng)生成外消旋3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈來制備(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈。然后使外消旋3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈與酰氯如丁酰氯反應(yīng)成酯。使該外消旋酯與脂酶如粗品豬胰脂肪酶反應(yīng)選擇性裂解(R)對映體酯基留下(S)對映體酯。然后使用常規(guī)方法除去(S)對映體酯基提供(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈，然后用酸如硫酸或鹽酸處理生成(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸。本發(fā)明的另一方面提供制備(S)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈的方法，該方法包括用水解酶，優(yōu)選脂酶如粗品豬胰脂肪酶處理式Ⅶ化合物，其中A是CN。本發(fā)明也提供式Ⅶ化合物式Ⅶ其中A和R9具有先前定義的意義；和式Ⅸ化合物式Ⅸ其中*是具有旋光性的活性手性中心，A和R9具有上述定義的意義。優(yōu)選*指具有(S)構(gòu)型具有旋光性的活性手性中心。本發(fā)明也提供式Ⅷ化合物式Ⅷ其中*是具有旋光性的活性手性中心，A具有上述定義的意義。優(yōu)選*指具有(S)構(gòu)型的具有旋光性的活性手性中心。使用任何類型具有選擇性裂解酯基形成醇的水解酶如脂酶、酯酶、肽酶或蛋白酶來進行在此介紹的酶催化步驟的方法。從微生物培養(yǎng)或從植物或動物中可獲得所述的酶。這樣的酶市場有售或通過本領(lǐng)域熟知的方法來制備。已發(fā)現(xiàn)脂酶能選擇裂解由N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺形成的酯和在此描述的其它酯以可接受的收率達到對映體的拆分。已發(fā)現(xiàn)市售的脂酶制劑優(yōu)先地裂解(R)對映體的酯基留下酯形式的(S)對映體。優(yōu)選脂酶是容易購得的粗品豬胰脂肪酶。也可使用來自其它種類的脂酶。豬胰脂肪酶提供良好的特異性和反應(yīng)速率。用于本發(fā)明的酶市場有售并不需要進一步處理可在反應(yīng)混合物中使用或可預(yù)處理，例如通過溶解在約pH7-7.5的緩沖液中和吸收于載體如玻璃珠、硅藻土、炭、離子交換樹酯或硅膠或共價連接于聚合物載體。一般地講，以從1∶10-100∶1(重量∶重量)底物∶酶的比率可以進行本發(fā)明酶催化步驟的方法。已發(fā)現(xiàn)從5∶1-1∶1的底物∶酶的比率可提供令人滿意的結(jié)果。根據(jù)像起始原料、所用的酶等因素和反應(yīng)條件如溫度和溶劑，底物對酶的比率可能需要改變以產(chǎn)生滿意的反應(yīng)速率。使酶催化反應(yīng)進行至從起始原料裂解酯基形成滿意量的醇為止。一般講，將使酶催化反應(yīng)進行約12小時至約4或5天，優(yōu)選從約1-3天。反應(yīng)混合物的pH一般從約5-約9，優(yōu)選從約7-約8。一般在從約15-約40℃，優(yōu)選從約25-約38℃的溫度進行酶催化步驟。根據(jù)像起始原料、酶和所用溶劑因素，反應(yīng)條件可能需要在上述范圍內(nèi)(或甚至超出范圍)變化，以提供滿意的反應(yīng)速率。在反應(yīng)混合物中所用的溶劑和任何共溶劑將根據(jù)像在反應(yīng)中所用的酶和底物等因素而改變。溶劑也可以影響酶催化反應(yīng)的選擇性和/或反應(yīng)速率，在該種情況下應(yīng)選擇溶劑以增加反應(yīng)速率(相對其它溶劑而言)和/或影響酶對所需的對映體的選擇性。反應(yīng)混合物溶劑可以是任何常規(guī)緩沖水溶液如磷酸二氫鉀緩沖液。對所述反應(yīng)而言適當?shù)墓踩軇┌∕TBE。酶催化拆分反應(yīng)需要2天幾乎完成(即，幾乎全部的(R)酯反應(yīng))，使用衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺和丁酸的外消旋的酯和粗品豬胰脂肪酶1∶1的底物∶酶(重量∶重量)的比率。相同原料的5∶1(重量∶重量)的底物∶酶的比率在2天內(nèi)產(chǎn)生約25％的酯水解。豬胰脂肪酶與衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺和丁酸的酯的反應(yīng)(水解回收的酯后)，提供35％收率中對映體過量98.5％的(S)異構(gòu)體(可得70％的(S)酯)。如在此所用，烷基和烷氧基的烷基部分和芳烷基包括直鏈和支鏈殘基。烷基的具體實例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、異丙基、仲-丁基和叔丁基。烷氧基的具體基團包括甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。芳烷基的具體基團包括芐基、苯乙基、苯丙基。芳基的具體基團包括苯基。烷胺基的具體基團包括甲胺基、乙胺基、丙胺基和丁胺基。二烷胺基的具體基團包括二甲胺基和二乙胺基。含1-2氮原子的六元雜芳環(huán)的Ar具體基團包括2-,3-和4-吡啶基，2-吡嗪基，2-和4-嘧啶基和3-和4-噠嗪基。含選自氮、氧和硫的1-2雜原子的5元雜芳環(huán)的Ar的具體基團包括3,4-和5-異噻唑基。2-,4-和5-噁唑基，2,4-和5-噻唑基，2-和3-呋喃基，和2-和3-呋喃基。術(shù)語鹵素指氟、氯、溴和碘，除另有說明外。*代表R或S構(gòu)型中具有旋光性的活性手性中心。參考下列實施例對本發(fā)明進一步說明，所述實施例不限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1-(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的合成A．衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的外消旋丁酸酯的制備在0～5℃，于乙腈(150ml)中攪拌外消旋N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺(25g)和三乙胺(15ml)，并在＜10℃用15分鐘加入丁酰氯(10ml)。在＜10℃2小時45分鐘后，再加入三乙胺(2ml)和丁酰氯(1ml)，并在20℃攪拌反應(yīng)物1小時30分鐘，再加入丁酰氯(1ml)。再過30分鐘后完成反應(yīng)。然后加入水(450ml)、乙酸乙酯(175ml)，攪拌混合物15分鐘，然后分離。用乙酸乙酯(175ml)再提取水層，用50％鹽水(150ml)洗滌合并的有機提取液，過濾和蒸發(fā)。通過溶解于熱叔-丁基甲基醚(MTBE)(60ml)，用10分鐘緩慢加入己烷(400ml)，然后用1小時冷卻至5℃來結(jié)晶油狀物。在5℃30分鐘后，濾除衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的外消旋丁酸酯，用己烷(50ml)洗滌并在40℃真空干燥。收率26g(86％)B．衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的丁酸酯的酶催化水解用0.1N氫氧化鈉溶液(2ml)將5毫摩爾磷酸二氫鉀溶液(50ml)調(diào)至pH7.1，加入豬胰脂肪酶(生物催化劑Treforest,UK)(0.2g)，并用0.1N氫氧化鈉溶液(2ml)再調(diào)pH至7.1。將衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺(1g)的外消旋丁酸酯溶解于MTBE(10ml)中并加進反應(yīng)物中，再用MTBE(2ml)洗滌。在38℃控制起始pH7.05最大攪拌反應(yīng)物7.00分鐘。24小時后，再加入豬胰脂肪酶(0.8g)，將pH調(diào)至7.55最大/7.50分鐘，并保持42小時，同時加入總量10ml的0.1N氫氧化鈉。用2NHCl(2ml)酸化反應(yīng)混合物至pH3.5，攪拌15分鐘，然后加入乙酸乙酯(30ml)并再攪拌混合物10分鐘。然后過濾所述混合物并用乙酸乙酯(20ml)洗滌殘留物。分離出水相并用乙酸乙酯(30ml)提取。用50％鹽水(20ml)洗滌合并的有機提取液，過濾和蒸發(fā)至部分結(jié)晶的油狀物。收率0.95g。所述產(chǎn)物是(R)-醇(99％對映體過量)和酯的混合物。產(chǎn)物分離使用硅膠60(Fluka,Buchs,Switzerland)快速柱層析分離產(chǎn)物，用5％乙酸乙酯/甲苯洗脫得到酯，然后用50％乙酸乙酯/甲苯洗脫得到醇。醇收率338mg；具有97.6％對映體過量的(R)-對映體。酯收率415mg。C．回收酯的水解將回收酯溶解于甲醇(25ml)中，加入100°TW氫氧化鈉溶液并在20℃攪拌30分鐘。加水(70ml)，用2NHCl(2ml)酸化混合物至pH2，然后用乙酸乙酯(2×30ml)提取。用50％鹽水(20ml)洗滌有機提取液，過濾并蒸發(fā)為白色固體。(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的收率297mg(71.7％,98.5％的對映體過量)。實施例2-酸部分對酯水解速率和反應(yīng)特異性的影響由外消旋N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺和相應(yīng)的酰氯可制備一系列酯。通過豬胰脂肪酶使之裂解并于24小時后分析。在38℃將磷酸緩沖液(50ml)調(diào)至pH7.6，加入酶(0.2g)并再調(diào)pH7.6，加入酶(0.2g)并再調(diào)pH至7.6。加入于MTBE中的衍生于N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺(1.0g)的外消旋酯，隨后用MTBE洗滌(總量12ml)，使用自動滴定儀和0.1NNaOH控制pH下，于約38℃攪拌混合物。在反應(yīng)結(jié)束時，用2NHCl調(diào)混合物pH至＜5，并將產(chǎn)物提取到乙酸乙酯中。通過層析分離酯和醇，并用甲醇中的NaOH水解回收酯。使用ChiracelOJ(DaicelChemicalIndustries)柱進行高壓液相層析(HPLC)分析(R)和(S)醇以測定對映體的純度。除了苯甲酸酯和苯基乙酸酯反應(yīng)非常慢外，從未反應(yīng)酯分離后測定轉(zhuǎn)化程度以及(R)醇產(chǎn)物的對映體過量。結(jié)果列在表1中。表1酯使用1∶5w/w酶∶酯的(R)異構(gòu)體產(chǎn)物的選24小時后轉(zhuǎn)化率擇性ee(對映體過量)乙酸酯2.5％86％ee丙酸酯6％87％ee丁酸酯10％99％ee己酸酯4.7％98％ee苯甲酸酯＜1％N/A苯基乙酸酯＜1％N/A單氯乙酸酯約65％約30％ee單氯乙酸酯水解實際比任何其它所試驗的酯都快；所述反應(yīng)進行至遠遠超出50％標記并在從殘基酯中回收的(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺中未測到(R)異構(gòu)體，表明良好的選擇性。實施例3-由N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺和丁酸形成的外消旋酯的水解A．根據(jù)流程2由外消旋3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸和4-氨基二苯酮制備外消旋N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺并轉(zhuǎn)化成丁酯。所述丁酯經(jīng)一系列酯酶和脂酶篩分。將DMSO(0.3ml)中的N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的外消旋丁酯(0.5g)加入于酶(0.1g)的保持在30℃pH7.5的緩沖液中。結(jié)果列于表2。表2酶反應(yīng)程度產(chǎn)物醇(S)∶(R)比率手性酶L5(ChirazymeL5)＜20％1∶1(Boehringer)(脂酶)羊肝丙酮粉(Sigma)＜2％2∶1豬肝丙酮粉(Sigma)＜10％1.1.3胰脂酶(生物催化劑)＜10％1∶10手性酶L7＜10％1∶3.6(Boehringer)(脂酶)胰脂酶(Fluka)＜5％1∶15.6B．根據(jù)流程2由外消旋3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸和4-氨基二苯酮制備外消旋N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺，并轉(zhuǎn)化為丁酯。用豬胰脂酶(生物催化劑)水解丁酯。將于MTBE(5ml)中的N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的外消旋丁酯(0.5g)加入于酶(0.1g)的保持在30℃,pH7.5的緩沖液中。使用豬胰脂酶，在兩天中，反應(yīng)進行約25％的轉(zhuǎn)化并顯示出所需的(S)對映體幾乎不水解。加入更多的豬胰脂酶(0.2g)再過3小時后得出35％反應(yīng)，處理后獲得約99％對映體過量的(R)醇。所述產(chǎn)物經(jīng)層析得到99％對映體過量的(R)醇，以及水解后具有50％的對映體過量的回收酯。使用1∶1(重量/重量)酶∶底物在兩天內(nèi)反應(yīng)幾乎完成，水解回收酯后得到(S)-(-)-N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺，以及基于引入N-(4-苯甲酰苯基)-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酰胺的量計算收率35％的98.5％對映體過量(即可得(S)酯的70％)。實施例4-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的酯的酯催化拆分在38℃使用pH控制器在7.10最大/7.07分鐘進行反應(yīng)。將5克摩爾磷酸二氫鈉溶液(100ml)和固化Candidaantaretia脂酶(NovozymeSP435,BoehringerMannhein)(2g)共同攪拌并在38℃用0.5N氫氧化鈉(2ml)調(diào)pH至7.1。加入任選溶解于甲基叔-丁基醚(MTBE)(50ml)或叔-丁醇(50ml)中的3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的外消旋甲基、乙基或丁基酯(5g)。攪拌反應(yīng)混合物，加入適量的0.5N氫氧化鈉溶液，至相應(yīng)約50％水解為止。任選加入更多的酶增加水解速率。再加入MTBE(50ml)，將反應(yīng)混合物攪拌15分鐘，然后過濾，用MTBE(15ml)洗滌殘留物。分出水層并用MTBE(30ml)提取。合并的有機提取液用鹽水(30ml)洗滌，然后過濾，蒸發(fā)得到未反應(yīng)的酯。用手性位移試劑如2,2,2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇(tfae)經(jīng)NMR分析測定酯的對映體比率。分離的水層酸化至約pH2，并用MTBE或乙酸乙酯(2×50ml)提取。經(jīng)硅灌土(2g)過濾有機提取物，用鹽水洗，過濾并蒸發(fā)得到拆分的3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸，將其用己烷研制，濾除固體。在L-(-)-α-甲基芐胺存在下經(jīng)NMR測定酸對映體純度。(ⅰ)在未用共溶劑時3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的甲基、乙基和丁基酯的水解結(jié)果列下面表3中。表3(ⅱ)用各種共溶劑時3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的乙基酯水解結(jié)果列下面表4中。表4實施例5-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸酯的酶催化拆分實施例5A反應(yīng)按下列之一進行(a)在含有50mM檸檬酸/磷酸鈉緩沖液，pH7.6(4ml)的7ml玻璃管形瓶中。將3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的乙基酯(40mg)懸浮于緩沖液中并加入酶(10mg)開始反應(yīng)。在22℃輕輕攪拌反應(yīng)物?；?b)在含有5mM檸檬酸/磷酸鈉緩沖液，pH7.6(30ml)的50ml夾套玻璃反應(yīng)器中。將3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的乙基酯(300mg)懸浮于緩沖液中，并用0.1M氫氧化鈉調(diào)pH至7.6。加入酶(75mg)開始反應(yīng)。在28℃攪拌反應(yīng)物并用0.1M氫氧化鈉經(jīng)自動滴定儀保持pH在7.6。間隔取反應(yīng)混合物樣品(0.2ml)并用己烷(1.8ml)提取。通過氣相層析測定殘留酯濃度分析樣品的水解程度。在自動滴定儀中進行反應(yīng)時，從氫氧化鈉溶液的消耗也能測定水解程度。在下列條件下經(jīng)氣相層析測定酯的濃度層析儀PerkinElmer8500；柱DB5(30米，J&WScientific；加熱室120℃；檢測室250℃；進樣室250℃；載氣氦氣；壓力8psi；檢測器FID。乙基酯的保留時間是2.8分鐘。在下列條件下經(jīng)氣相層析也可測定殘留酯的對映體過量層析儀PerkinElmer8500；柱CPChirasil-DexCB(25米)，Chrompak；加熱室溫度梯度等溫1在80℃3分鐘，20℃/分升溫2分鐘，等溫2于120℃6分鐘；其它設(shè)定同非手性分析。(S)-對映體保留時間是4.0分和對(R)-對映體是4.1分。結(jié)果列于表5中。如表5所示，經(jīng)米曲霉、地衣型芽胞桿菌，Aspergillussojae和SP539酶水解3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸，對3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的乙基酯的(R)對映體有良好選擇性。實施例5B也可以使用得自Aspergillussojae(Sigma)(蛋白酶)和SP539(Novo)(蛋白酶)的酶水解3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸的丁基酯。分析方法與實施例5A乙基酯所使用的相同。丁基酯的保留時間是4.6分鐘(DB5柱)。(S)對映體的保留時間是6.1分鐘。(R)對映體的保留時間是6.3分鐘(CPChirasil-DexCB柱)。與在實施例5A中所述的乙基酯相同，在pH自動滴定儀中進行實驗。取樣一定時間。結(jié)果列表6和7中。表5表6Aspergillussojae(Sigma)表7SP539(Novo)實施例6-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈的丁酯的酶催化拆分在38℃使用pH控制器在7.50最大/7.45分鐘進行反應(yīng)。攪拌5毫摩爾磷酸二氫鉀溶液(100ml)和粗品豬胰脂肪酶(PPL)(1g)，并在38℃用0.1N氫氧化鈉水溶液(5ml)調(diào)pH至7.5。加入溶解于MTBE(20ml)的3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙腈外消旋丁酯(5g)，用MTBE(5ml)洗滌。7小時后，再加入PPL(1g)，當加入30ml的0.1NNaOH時攪拌反應(yīng)過夜。7小時后，再加入14ml的0.1NNaOH，再加入PPL(2g)，需要10ml的0.1NNaOH用于中和。再加入69ml0.1NNaOH后再攪拌反應(yīng)物2天(消耗總量113ml用于酶催化水解，理論值為119ml)。加入MTBE(50ml)、硅藻土(2g)和2N鹽酸(5ml)調(diào)pH至5，攪拌反應(yīng)混合物15分鐘，然后過濾。分離出水層和用MTBE(50ml)提取。合并的有機提取液用50％鹽水洗滌，然后過濾并蒸發(fā)。將得到的油狀物(3.3g)上硅膠快速層析柱，用二氯甲烷作為洗脫劑。回收未反應(yīng)酯(950mg)，在位移試劑存存在下通過NMR顯示為單一的對映體。在100℃共同加熱回收酯(100mg)，水(1ml)和濃鹽酸(2ml)6小時，然后在20℃攪拌過夜。加入飽和鹽水(2ml)，用MTBE(2×5ml)提取混合物。過濾MTBE溶液并蒸發(fā)得到油狀物及部分固體用己烷(2ml)研磨。濾除固體物(14.5mg)并用已烷(5ml)洗滌。在L(-)-(α)-甲基芐胺存在下，NMR顯示3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸為(S)-對映體。權(quán)利要求1．制備具有旋光性的式Ⅰ活性化合物的方法其中E選自氮和CZ，其中C是環(huán)碳，Z是下述定義的取代基，其中當E是CZ時，X和Z選自(A)X是ArY，其中Y為選自羰基、亞磺?；突酋；倪B接基團，Ar選自用選自鹵素、羥基、氰基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基的0-2個取代基取代的苯基；含有1-2氮原子作為僅有的雜原子的六元雜芳環(huán)；含有選自氮、氧和硫的1-2雜原子的五元雜芳環(huán)；和Z選自氫、氰基、鹵素、羥基、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基；和(B)X是氰基，Z選自苯硫基，苯亞磺?；捅交酋；?，其中苯環(huán)被選自鹵