用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞abo血型基因分型的引物組及試劑盒的制作方法

用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞abo血型基因分型的引物組及試劑盒的制作方法用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞abo血型基因分型的引物組及試劑盒的制作方法本發(fā)明公開了一種主要用于中國人群的，用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的引物組及試劑盒。用于ABO血型基因測(cè)定的引物組包括ABOINTRON2396G引物對(duì)，ABOINTRON2396C引物對(duì)，ABOEXON7272A引物對(duì)，ABOEXON7272T引物對(duì)，ABOEXON7429C引物對(duì)，ABOEXON7429G引物對(duì)，ABOEXON7635G引物對(duì)，ABOEXON7635A引物對(duì)，ABOEXON622A引物對(duì)，ABOEXON7688G引物對(duì)，ABOEXON7688C引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)。本發(fā)明的試劑盒克服了血清學(xué)方法鑒定ABO血型的種種限制、是正確判定血型不可缺少的輔助手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和臨床參考價(jià)值?！緦＠f明】用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型的引物組及試劑盒【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型的試劑盒(PCR-SSP法)?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]人類ABO基因座位于第9號(hào)染色體(9q34)，且A、B、O基因高度同源性，有7個(gè)外顯子。ABO基因長(zhǎng)度約1060bp，編碼353個(gè)氨基酸。A基因和B基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，而O基因?yàn)闊o效基因。B基因與A基因在cDNA序列第297、703、796和803bp這4個(gè)堿基位點(diǎn)存差異；0基因與A基因的區(qū)別為cDNA第26Ibp堿基G缺失。A型主要有Al與A2亞型，此外還有A3、Am和Ax等。與Al基因比較，A2基因在cDNA第467bp存在A/T替換和第1061bp堿基C缺失。O型主要有01與02亞型。與01基因比較，02基因除了第261bp堿基G缺失外，還存在第646T>A、681G>A、771C>T和829G>A等4個(gè)堿基替換。[0003]ABO基因的基因產(chǎn)物是糖基轉(zhuǎn)移酶，這些酶控制ABO血型抗原的合成。ABO抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)是糖蛋白，A基因表達(dá)A酶(a-3-N-D-氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶)，能夠?qū)-乙酰半乳糖加在H物質(zhì)的巖藻糖末端上，產(chǎn)生A抗原特異性；Β基因表達(dá)B酶(a-3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)，能將半乳糖加在H物質(zhì)糖末端產(chǎn)生B抗原特異性。AB型個(gè)體帶有A和B兩種糖基轉(zhuǎn)移酶，因此紅細(xì)胞上同時(shí)有A和B抗原。O型個(gè)體不具有A酶和B酶，所以紅細(xì)胞表面不顯示A和B抗原。血清學(xué)方法通?？繖z測(cè)紅細(xì)胞表面抗原和血液中存在的抗體來鑒定ABO血型，而ABO血型的基因?qū)W分型方法則通過直接檢測(cè)ABO基因?qū)ζ溥M(jìn)行分型。[0004]ABO血型系統(tǒng)是人類血型系統(tǒng)中免疫原性最強(qiáng)的血型系統(tǒng)，在輸血醫(yī)學(xué)以及器官、干細(xì)胞移植等臨床醫(yī)學(xué)中有重要作用。血清學(xué)技術(shù)鑒定ABO血型系統(tǒng)只能鑒定表型，在鑒定異常表達(dá)的個(gè)體和作遺傳學(xué)分析時(shí)受到局限。ABO血型基因分型技術(shù)在輸血醫(yī)學(xué)中可結(jié)合血清學(xué)診斷結(jié)果應(yīng)用于臨床，ABO基因分型結(jié)果可作為遺傳標(biāo)記物應(yīng)用于干細(xì)胞移植后嵌合體檢測(cè)及亞型的家系研究。此外，ABO血型基因分型技術(shù)不受檢材限制，羊水、毛發(fā)等包含有核細(xì)胞的物質(zhì)都可作為檢材，使其在胎兒和新生兒血型鑒定方面有潛在而廣泛的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)患者由于疾病或衰老，ABO基因產(chǎn)物表達(dá)降低，造成Α，B抗原表達(dá)減弱時(shí)，基因分型技術(shù)因其不受表達(dá)影響的優(yōu)勢(shì)成為ABO血型準(zhǔn)確定型的首選。不受血清中自身抗體、不規(guī)則抗體的影響，ABO血型基因分型技術(shù)克服了血清學(xué)方法的種種限制，是正確判定血型不可缺少的輔助手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和臨床參考價(jià)值?！景l(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的是:克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種適合中國人群的用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的引物組。[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種適合中國人群的具有靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速的用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的試劑盒。[0007]一種適合中國人群的用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的引物組，其特征是包括ABOINTR0N2396G引物對(duì)，ABOINTR0N2396C引物對(duì)，ABOEX0N7272A引物對(duì)，ABOEX0N7272T引物對(duì)，ABOEX0N7429C引物對(duì)，ABOEX0N7429G引物對(duì)，ABOEX0N7635G引物對(duì)，ABOEX0N7635A引物對(duì)，ABOEX0N622A引物對(duì)，ABOEX0N7688G引物對(duì)，ABOEX0N7688C引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)；所述ABOINTR0N2396G位于Intron2520-537和Intron2347-369的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.1、SEQIDN0.2所示的核苷酸序列；所述ABOINTR0N2396C位于Intron2520-537和Intron2347-369的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.1、SEQIDN0.3所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7272A位于EX0N7455-472和EX0N7253-272的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.4、SEQIDN0.5所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7272T位于EX0N7455-472和EX0N7253-272的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.4、SEQIDN0.6所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7429C位于EX0N7202-221和EX0N7429-446的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.7、SEQIDN0.8所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7429G位于EX0N7202-221和EX0N7429-446的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.7、SEQIDN0.9所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7635G位于EX0N7500-517和EX0N7635-654的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.10、SEQIDN0.11所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7635A位于EX0N7500-517和EX0N7635-654的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.10、SEQIDN0.12所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N622A位于EX0N61_22和INTR0N6124-146的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.13、SEQIDN0.14所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7688G位于3’NCR97-119和EX0N7671-688的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.15、SEQIDN0.16所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7688C位于3’NCR97-119和EX0N7671-688的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.15、SEQIDN0.17所示的核苷酸序列。[0008]一種適合中國人群的用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的試劑盒，其特征是包括包被有ABOINTR0N2396G引物對(duì)，ABOINTR0N2396C引物對(duì)，ABOEX0N7272A引物對(duì)，ABOEX0N7272T引物對(duì)，ABOEX0N7429C引物對(duì)，ABOEX0N7429G引物對(duì)，ABOEX0N7635G引物對(duì)，ABOEX0N7635A引物對(duì)，ABOEX0N622A引物對(duì)，ABOEX0N7688G引物對(duì)，ABOEX0N7688C引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)的引物板和濃縮dNTP-Buffer；所述ABOINTR0N2396G位于Intron2520-537和Intron2347-369的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.1、SEQIDN0.2所示的核苷酸序列；所述ABOINTR0N2396C位于Intron2520-537和Intron2347-369的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.1、SEQIDN0.3所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7272A位于EX0N7455-472和EX0N7253-272的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.4、SEQIDN0.5所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7272T位于EX0N7455-472和EX0N7253-272的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.4、SEQIDN0.6所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7429C位于EX0N7202-221和EX0N7429-446的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.7、SEQIDN0.8所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7429G位于EX0N7202-221和EX0N7429-446的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.7、SEQIDN0.9所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7635G位于EX0N7500-517和EX0N7635-654的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.10、SEQIDN0.11所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7635A位于EX0N7500-517和EX0N7635-654的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.10、SEQIDN0.12所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N622A位于EX0N61_22和INTR0N6124-146的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.13、SEQIDN0.14所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7688G位于3’NCR97-119和EX0N7671-688的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.15、SEQIDN0.16所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7688C位于3’NCR97-119和EX0N7671-688的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.15、SEQIDN0.17所示的核苷酸序列?！緦＠綀D】【附圖說明】[0009]圖1為人類紅細(xì)胞ABO血型基因特異引物孔位圖。[0010]圖2為實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰陽性判讀圖。[0011]圖3為實(shí)驗(yàn)結(jié)果分型讀板紙。[0012]圖4為ABO電泳結(jié)果膠圖，AOl型。[0013]圖5為ABO電泳結(jié)果膠圖，0102型。[0014]圖6為ABO電泳結(jié)果膠圖，BOl型。[0015]圖7為ABO電泳結(jié)果膠圖，A20501型。[0016]圖8為ABO電泳結(jié)果膠圖，A20101型。[0017]圖9為ABO電泳結(jié)果膠圖，0101型。[0018]圖10為ABO電泳結(jié)果膠圖，A02型。[0019]圖11為ABO電泳結(jié)果膠圖，0202型。[0020]圖12為ABO電泳結(jié)果膠圖，B02型。[0021]圖13為ABO電泳結(jié)果膠圖，A20502型。[0022]圖14為ABO電泳結(jié)果膠圖，A20102型。[0023]圖15為ABO電泳結(jié)果膠圖，AA型。[0024]圖16為ABO電泳結(jié)果膠圖，A205A205型。[0025]圖17為ABO電泳結(jié)果膠圖，A201A201型。[0026]圖18為ABO電泳結(jié)果膠圖，A205A型。[0027]圖19為ABO電泳結(jié)果膠圖，A201A型。[0028]圖20為ABO電泳結(jié)果膠圖，A201A205型。[0029]圖21為ABO電泳結(jié)果膠圖，BB型。[0030]圖22為ABO電泳結(jié)果膠圖，AB型。[0031]圖23為ABO電泳結(jié)果膠圖，A201B型。[0032]圖24為ABO電泳結(jié)果膠圖，A205B型。具體實(shí)施例[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。[0034]實(shí)施例1依據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心基因庫(NCBIGeneBank)公開的ABO等位基因序列，設(shè)計(jì)出用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的引物組，該引物組包括ABOINTR0N2396G引物對(duì)，ABOINTR0N2396C引物對(duì)，ABOEX0N7272A引物對(duì)，ABOEX0N7272T引物對(duì)，ABOEX0N7429C引物對(duì)，ABOEX0N7429G引物對(duì)，ABOEX0N7635G引物對(duì)，ABOEX0N7635A引物對(duì)，ABOEX0N622A引物對(duì)，ABOEX0N7688G引物對(duì)，ABOEX0N7688C引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)。[0035]實(shí)施例2一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的試劑盒，包括包被有ABOINTR0N2396G引物對(duì)，ABOINTR0N2396C引物對(duì)，ABOEX0N7272A引物對(duì)，ABOEX0N7272T引物對(duì)，ABOEX0N7429C引物對(duì)，ABOEX0N7429G引物對(duì)，ABOEX0N7635G引物對(duì)，ABOEX0N7635A引物對(duì)，ABOEX0N622A引物對(duì)，ABOEX0N7688G引物對(duì)，ABOEX0N7688C引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)的引物板和濃縮dNTP-Buffer。[0036]用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的試劑盒的制備方法是:(1)依據(jù)人類紅細(xì)胞ABO血型基因特異引物孔位圖(見圖1)，分別將ABOINTR0N2396G引物對(duì)，ABOINTR0N2396C引物對(duì)，ABOEX0N7272A引物對(duì)，ABOEX0N7272T引物對(duì)，ABOEX0N7429C引物對(duì)，ABOEX0N7429G引物對(duì)，ABOEX0N7635G引物對(duì)，ABOEX0N7635A引物對(duì)，ABOEX0N622A引物對(duì)，ABOEX0N7688G引物對(duì)，ABOEX0N7688C引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)包被至引物板的相應(yīng)位置上，干燥處理；(2)依據(jù)配220mMdNTP、3.5mMMg2+、500mMKCLUOOmMTris_HCL、l%TritonX-100制備出440μI濃縮dNTP-Buffer；(3)將包被有引物對(duì)的引物板每人份檢測(cè)包括11孔特異性引物孔，濃縮dNTP-Buffer組成一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的試劑盒。[0037]實(shí)施例3使用操作流程。[0038]一、2.5%瓊脂糖凝膠的準(zhǔn)備。[0039]1.將加入2.5g瓊脂糖加入100mlIXTBE溶液(Tris-硼酸鹽-EDTA溶液)，加熱直到形成均勻的凝膠溶液。再加入適量電泳染色劑，混合均勻。[0040]2.將凝膠槽置于水平位置，向凝膠槽中加入適量凝膠溶液，插入電泳梳。前后水平移動(dòng)凝膠槽，確保凝膠溶液覆蓋均勻。[0041]3.待凝膠完全凝固后，豎直拔出電泳梳。[0042]二、PCR循環(huán)參數(shù)見表1(表1擴(kuò)增參數(shù)特征表):【權(quán)利要求】1.一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的引物組，其特征是包括ABOINTR0N2396G引物對(duì)，ABOINTR0N2396C引物對(duì)，ABOEX0N7272A引物對(duì)，ABOEX0N7272T引物對(duì)，ABOEX0N7429C引物對(duì)，ABOEX0N7429G引物對(duì)，ABOEX0N7635G引物對(duì)，ABOEX0N7635A引物對(duì)，ABOEX0N622A引物對(duì)，ABOEX0N7688G引物對(duì)，ABOEX0N7688C引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)；所述ABOINTR0N2396G位于Intron2520-537和Intron2347-369的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.1、SEQIDN0.2所示的核苷酸序列；所述ABOINTR0N2396C位于Intron2520-537和Intron2347-369的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.1、SEQIDN0.3所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7272A位于EX0N7455-472和EX0N7253-272的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.4、SEQIDN0.5所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7272T位于EX0N7455-472和EX0N7253-272的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.4、SEQIDN0.6所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7429C位于EX0N7202-221和EX0N7429-446的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.7、SEQIDN0.8所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7429G位于EX0N7202-221和EX0N7429-446的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.7、SEQIDN0.9所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7635G位于EX0N7500-517和EX0N7635-654的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.10、SEQIDN0.11所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7635A位于EX0N7500-517和EX0N7635-654的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.10、SEQIDN0.12所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N622A位于EX0N61_22和INTR0N6124-146的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.13、SEQIDN0.14所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7688G位于3’NCR97-119和EX0N7671-688的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.15、SEQIDN0.16所示的核苷酸序列；所述ABOEX0N7688C位于3’NCR97-119和EX0N7671-688的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.15、SEQIDN0.17所示的核苷酸序列。2.一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞ABO血型基因的試劑盒，其特征是包括包被有ABOINTR0N2396G引物對(duì)，ABOINTR0N2396C引物對(duì)，ABOEX0N7272A引物對(duì)，ABOEX0N7272T引物對(duì)，ABOEX0N7429C引物對(duì)，ABOEX0N7429G引物對(duì)，ABOEX0N7635G引物對(duì)，ABOEX0N7635A引物對(duì)，ABOEX0N622A引物對(duì)，ABOEX0N7688G引物對(duì)，ABOEX0N7688C引物對(duì)引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)的引物板和濃dNTP-Buffer；所述ABOINTR0N2396G位于Intron2520-537和Intron2347-369的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.1、SEQIDN0.2所示的核苷酸序列；所述ABOINTR0N2396C位于Intron2520-537和Intron2347-369的引物對(duì)的上、下游引物分別是序列表中SEQIDN0.1、SEQ