（高清版）WST 421-2024 抗酵母樣真菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) 肉湯稀釋法

WSWS/T421—2024Standardsforantifungalsusceptibilitytestingofyeasts—BrothdilutionmethodWS/T421—2024I 2 4 4 5 8 WS/T421—2024本標(biāo)準(zhǔn)代替WS/T421—2013《抗酵母樣真菌藥物敏感性試驗(yàn)—肉湯稀釋法》，與WS/T421—2013——更改了結(jié)果解釋內(nèi)容：按CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardInstitute）有折點(diǎn)的本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京醫(yī)院/國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心、北京大學(xué)人民醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附醫(yī)院（同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院）、北京大學(xué)第一醫(yī)院、解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)WS/T421—20241抗酵母樣真菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用經(jīng)典的宏量肉湯稀釋方法（BrothMacrodilut低抑菌濃度（MinimalInhibitoryConcentration,MIC）的參考方法，并推薦了與本參有良好一致性的微量肉湯稀釋方法（BrothMi本標(biāo)準(zhǔn)適用于引起感染的酵母樣真菌（包括念珠菌屬某些種Candidaspp.和隱球菌屬某些種Cryptococcusspp.）的藥物敏度（MIC）質(zhì)控參考范圍、折點(diǎn)、結(jié)果解釋性本標(biāo)準(zhǔn)不適用于雙相真菌如皮炎芽生菌Blastomycesdermatitidis、莢膜組織胞漿菌Histopla3.13.2用于區(qū)分菌株為敏感、劑量依賴性敏感、中介、耐藥的3.3根據(jù)建立的折點(diǎn)將藥敏結(jié)果所得的MIC值進(jìn)行敏感3.43.5劑量依賴性敏感susceptible-dosedepend指分離株的敏感性依賴于對(duì)患者的用藥方案，即對(duì)于藥敏結(jié)果在SDD范圍內(nèi)的分離株，為了使血藥濃度達(dá)到臨床療效，采用較高劑量和/或增加用藥頻率的給藥方案，使藥物暴露高于常用敏感折點(diǎn)的劑3.6WS/T421—20242區(qū)，以防止微小的、不可控的技術(shù)因素導(dǎo)致較嚴(yán)重的3.73.8流行病學(xué)界值epidemiologicalcutoffvalue;ECV/epidemiologicalcu非野生型）。ECV定義了菌株野生型菌群藥物敏感性的上限值3.9ECV將分離菌株歸類為對(duì)某種檢測(cè)的抗菌藥物無(wú)獲得性耐藥機(jī)制或無(wú)敏感性降低的生物型。3.10ECV將分離菌株歸類為對(duì)某種檢測(cè)的抗菌藥物具有推測(cè)的/已知獲得性耐藥機(jī)制或敏感性降低的生3.113.123.134抗真菌藥物的配制可使用式（1）、式（2）計(jì)算藥物重量及稀釋液體積:WS/T421—20243m——藥物的重量，單位為毫克（mg4.3藥物儲(chǔ)存液（母液）4.3.1藥物稱量藥物稱量按照配制儲(chǔ)存液的濃度計(jì)算，配制儲(chǔ)存液濃度至少按檢測(cè)范圍最高濃度的100倍配制儲(chǔ)存液。但有些溶解度低的藥物應(yīng)配制較低濃度的儲(chǔ)存液。稱量4.3.2溶劑包括：二甲基亞砜（DMSO）、乙醇、聚乙二醇、羧甲基纖表1抗真菌藥物的儲(chǔ)存液使用的溶劑、稀釋液種類及藥物Manogepixc培養(yǎng)基指RPMI-1640肉湯培養(yǎng)基，如使用商品化RPMI-1640肉湯干粉配制，步驟見(jiàn)表A.4.3.3過(guò)濾WS/T421—20244取出的當(dāng)天使用，現(xiàn)用現(xiàn)取，未用完的應(yīng)丟棄。大4,4非水溶性抗真菌藥物稀釋液稀釋為10倍終濃度的中間濃度（最終要與菌液1:9），推薦使用RPMI-1640肉湯培養(yǎng)基（配制方法見(jiàn)表A.1），若無(wú)商品化RPMI-164b62534483542621710859b配制步驟1舉例，取5120μg/mL的儲(chǔ)存液1.0mL，加入7.0mL溶劑，得到中間濃度為640濃度，取1.0mL，加入1.0mL溶劑，得到中間濃度320μg/mL，以此類推；宏量肉湯稀釋法取0.1mL中間濃度液與10WS/T421—20245確保菌株的純度和活性。念珠菌于35℃培養(yǎng)24h，新型隱球菌培養(yǎng)48落，加入5mL0.85％無(wú)菌鹽水混勻，用濁度儀或0.5麥?zhǔn)蠁挝涣蛩徜^濁度標(biāo)準(zhǔn)管（配制見(jiàn)表A.4）配制濃度為0.5×103CFU/mL～2在無(wú)菌試管中分別加入表2所示系列中間濃度液0.1mL，15min內(nèi)（4℃下可懸液。陽(yáng)性生長(zhǎng)對(duì)照管（無(wú)抗真菌藥物）中加入0.9mL菌懸液和0.1mLRPMI-照管，只加1mLRPMI-1640肉湯培養(yǎng)基，不加菌將接種管置于35℃溫箱中培養(yǎng)，念珠菌應(yīng)培養(yǎng)24h～48h，對(duì)于24h后生長(zhǎng)不良的分離株，最高6.2微量肉湯稀釋法操作步驟按本標(biāo)準(zhǔn)第6.1.1條方法培養(yǎng)和制備0.5麥?zhǔn)蠁危鷮?duì)照孔，只加2％葡萄糖RPMI-1640肉湯，不加菌懸液根據(jù)藥物濃度檢測(cè)范圍（可參考表2）由低濃度到高濃度依次用（多道）加樣器，從96孔板的第1L2倍終濃度的菌懸液，最終接種量為0.5×103CFU/mL對(duì)于微量肉湯稀釋法，念珠菌及新型隱球菌培養(yǎng)溫度均為35℃,所有抗真菌藥物的質(zhì)控范圍基于培養(yǎng)24h。對(duì)于念珠菌，棘白菌素類、兩性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、伊曲康唑、艾沙康唑、泊沙康唑、雷夫康唑和伏立康唑的MIC值應(yīng)在24h讀取結(jié)果。如果24h生長(zhǎng)對(duì)照可用于培養(yǎng)48h結(jié)果判讀。上述所有抗真菌藥物對(duì)于隱球菌屬的MIC值應(yīng)在培養(yǎng)72h讀WS/T421—20246宏量肉湯稀釋法質(zhì)控菌株的參考范圍見(jiàn)表B.1，微量肉湯稀釋法質(zhì)控菌株的參考范圍見(jiàn)表B——2濁度顯著降低(≈50%);——3濁度輕微降低；——4濁度沒(méi)有變化。生長(zhǎng)終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)為100％抑制（評(píng)分為0，完全清亮）。MIC值為抑制生長(zhǎng)最低抗菌濃度，終點(diǎn)拖氟胞嘧啶和吡咯類抗真菌藥物有拖尾生長(zhǎng)現(xiàn)象，生長(zhǎng)終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)為50％抑7.2結(jié)果解釋抗真菌藥物存在折點(diǎn)時(shí)，不應(yīng)在臨床實(shí)踐中僅有一些真菌-藥物組合建立了折點(diǎn)，念珠菌屬折點(diǎn)見(jiàn)與折點(diǎn)不同，ECV值不能預(yù)測(cè)臨床治療效果。對(duì)于既有折點(diǎn)又有ECV的念珠菌屬（見(jiàn)表D.2），ECV不能預(yù)測(cè)治療的臨床反應(yīng)。當(dāng)評(píng)估的真菌種類和抗真菌藥物存在折點(diǎn)時(shí)，不應(yīng)在臨床實(shí)踐中使表D.3）作為參考而非明確的耐藥折點(diǎn)?；颊呤褂闷渌拐婢幬餆o(wú)效的情況下，即使某抗真菌藥物的WS/T421—202477.3抗真菌藥物結(jié)果解釋湊的聚集，使用商品化方法可能會(huì)提供更準(zhǔn)確的體外MIC之前的CLSI折點(diǎn)不再使用。無(wú)折點(diǎn)念珠菌屬的氟胞嘧啶ECV值這些新折點(diǎn)不適用于克柔念珠菌。菌株應(yīng)鑒定到種水平，才能準(zhǔn)確解釋和報(bào)告MIC結(jié)果。當(dāng)分離株鑒定新型隱球菌分離株的檢測(cè)應(yīng)用尚不清楚，研究已建立伏立康唑?qū)Π啄钪榫?、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌已建立無(wú)折點(diǎn)的念珠菌屬對(duì)阿尼芬凈和米卡芬凈的ECV值（表D.EUCAST微量肉湯稀釋法24h質(zhì)控菌株MIC范圍見(jiàn)表E.1；念珠菌體外微量肉湯稀釋7,4結(jié)果報(bào)告WS/T421—20248a)有MIC判斷折點(diǎn)（念珠菌MIC折點(diǎn)見(jiàn)表），b)無(wú)MIC判斷折點(diǎn)但有ECV值，見(jiàn)表D.2和表D.4，報(bào)告MIC值；如果MIC值低于或等于ECV值報(bào)告為c)無(wú)MIC判斷折點(diǎn)且無(wú)ECV值：只報(bào)告MIb)無(wú)MIC判斷折點(diǎn)但有ECOFF值，見(jiàn)表E.3和表E.4，報(bào)告MIC值；如果MIC值低于或等于ECOFF值報(bào)當(dāng)使用新批次的培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿或RPMI-1640肉湯培養(yǎng)基以及微量稀釋96孔板伊曲康唑和其他三唑類藥物適合用于比對(duì)試驗(yàn)，并用已確定MIC的質(zhì)控菌株和參考菌株進(jìn)行終點(diǎn)判實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)在相同條件下獨(dú)立判讀結(jié)果，并與操作熟練生長(zhǎng)后，于-70℃凍存。用15％甘油制成菌懸液或保存在真菌凍存管中-70℃挑選菌落進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。若MIC值在質(zhì)控范圍之內(nèi)（見(jiàn)表），若短期使用，可在沙保羅培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)后2℃~8℃保存，每?jī)芍苓M(jìn)行一次傳WS/T421—20249從-70℃或液氮中取出凍存管，待室溫融化后，轉(zhuǎn)種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)（念珠WS/T421—2024用商品化RPMI-1640肉湯干粉配制1LRPMI-1640肉湯培養(yǎng)基步驟見(jiàn)表A.1，若無(wú)肉湯干粉，配制12345aMOPS表示3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(3-N-morpholinopropanesulfonicaMOPS123456表B.1宏量肉湯稀釋法質(zhì)控菌株MIC范圍(μg/mL，48h）MICs在范圍內(nèi)比例%ATCC90018a標(biāo)準(zhǔn)菌株：由菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的、有且僅有永久保藏號(hào)、遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的c參考菌株：經(jīng)參考實(shí)驗(yàn)室或權(quán)威機(jī)構(gòu)鑒定的菌株，或WS/T421—2024表B.2微量肉湯稀釋法質(zhì)控菌株MIC范圍(μg/mL，24h和48h）比例%MIC范圍比例%128–––211122–––11表B.2微量肉湯稀釋法質(zhì)控菌株MIC范圍(μg/mL，24h和48h續(xù)）比例%MIC范圍比例%WS/T421—2024––––––杜布斯希木龍念珠菌–––––––––––––––––格特隱球菌(VGI)––Deuterogattii隱球菌（以前的格特––新型隱球菌(VNI)–WS/T421—2024念珠菌屬體外微量肉湯稀釋法MIC折點(diǎn)見(jiàn)表D.1，無(wú)折點(diǎn)的念珠菌屬和隱球菌屬ECV值分別見(jiàn)表D.2和表D.3，有折點(diǎn)的念珠菌屬的ECV值見(jiàn)表D.4，耳念珠菌體外微量肉湯稀釋法MIC暫定折點(diǎn)表D.1念珠菌屬體外微量肉湯稀釋法MIC折點(diǎn)(μg/mL,24h）MIC折點(diǎn)和判讀SIR––4––4––––4––4––––4––4–––4–––––––4–4WS/T421—2024表D.1念珠菌屬體外微量肉湯稀釋法MIC折點(diǎn)(μg/mL,24h續(xù)）MIC折點(diǎn)和判讀SIR–––––1–––注2：念珠菌屬的MIC折點(diǎn)與不同藥物相對(duì)應(yīng)。如果檢測(cè)的MICs值介于兩個(gè)結(jié)果解釋a如果24h生長(zhǎng)對(duì)照顯示生長(zhǎng)不足，此折點(diǎn)也可用于b對(duì)于近平滑念珠菌復(fù)合群，由于擬平滑念珠菌和似平滑念珠菌流行率較低，當(dāng)未進(jìn)行進(jìn)一步種屬測(cè)定時(shí)，可采用近平滑念珠菌折點(diǎn)。如果進(jìn)一步的菌種鑒定確認(rèn)c體外卡泊芬凈藥敏試驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)室間偏差呈顯著相關(guān)，當(dāng)使用此參考方法時(shí)，有可能報(bào)告假耐藥，偏差原因尚不清楚。當(dāng)檢測(cè)卡泊芬凈時(shí)，敏感結(jié)果可報(bào)告“敏感”。但當(dāng)實(shí)下任一種方法進(jìn)行確認(rèn)：1）米卡芬凈或阿尼芬凈進(jìn)行額外的藥敏試驗(yàn)；2）對(duì)fks基因進(jìn)定fks1（所有念珠菌屬）和fks2（僅光滑念珠菌屬）中的耐藥熱點(diǎn)突變；3)將米卡芬凈或阿尼芬凈耐藥，或具有特征性fks熱點(diǎn)突變的念珠菌屬應(yīng)視為對(duì)所有棘白菌素耐藥，包括對(duì)卡泊芬≤32μg/mL，臨床醫(yī)生應(yīng)確定氟康唑是否適合具體的臨床背e克柔念珠菌對(duì)氟康唑天然耐藥，不應(yīng)使用此表格解釋其MIC。f對(duì)于光滑念珠菌和伏立康唑，目前的數(shù)據(jù)不足以證明WS/T421—2024842182122a與折點(diǎn)不同，ECV值不能預(yù)測(cè)臨床治療WS/T421—2024表D.3耳念珠菌體外微量肉湯稀釋法MIC暫定折點(diǎn)(μg/mL）MIC暫定折點(diǎn)注1：/fungal/candida-auris/c-auris-antifungal注2：基于這些MIC暫定折點(diǎn)，許多分離株對(duì)多種藥物具有耐藥性。已發(fā)現(xiàn)一些耳念珠菌對(duì)三唑類、多烯菌素類抗真菌藥物都產(chǎn)生耐藥，在其他國(guó)家發(fā)現(xiàn)泛耐藥性的報(bào)告。在美國(guó)，約90％的耳念珠菌分離株對(duì)氟康g/mL。應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇適合的藥2222221212WS/T421—202411211811421421111111bECV值基于對(duì)97.5％的建模種群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。ECVs可能會(huì)忽略潛在的耐藥菌株(非野生型)。WS/T421—2024表D.5無(wú)折點(diǎn)a的隱球菌屬ECV值(μg/mL）Deuterogattii隱球菌（以前的格特隱球菌）(VGII)1Deuterogattii隱球菌（以前的格特隱球菌）(VGII)84Deuterogattii隱球菌（以前的格特隱球菌）(VGII)8Deuterogattii隱球菌（以前的格特隱球菌）(VGII)1Deuterogattii隱球菌（以前的格特隱球菌）(VGII)格特隱球菌和Deuterogattii隱球菌（以前叫格特隱球菌）的分子基因型，只有通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或基于DNA測(cè)序等分子分型方法進(jìn)行識(shí)別，但不能確定是否為唯一物種，未來(lái)可能b流行病學(xué)界值ECV[9]是使用肉湯微量稀釋參考方法建立的[1]。如果使WS/T421—2024液；接種量：最終濃度0.5×105CFU/mL～2.5×105CFU/mL；培養(yǎng)時(shí)間：18h～菌ATCC22019或克柔念珠菌ATEUCAST微量肉湯稀釋法質(zhì)控菌株MIC范圍見(jiàn)表E.1,念珠菌體外微量肉湯稀釋法MIC折點(diǎn)見(jiàn)表E.2,有折點(diǎn)的念珠菌屬的ECOFF值見(jiàn)表E.3,EUCAST有折點(diǎn)的隱球菌屬的EC表E.1EUCAST微量肉湯稀釋法質(zhì)控菌株MIC范圍(μg/mL）211注：Version5.0,2020,WS/T421—2024表E.2EUCAST念珠菌體外微量肉湯稀釋法MIC折點(diǎn)(μg/mL）MIC折點(diǎn)和判讀SIR–––––––––––4444–––––––––––表E.2EUCAST念珠菌體外微量肉湯稀釋法MIC折點(diǎn)(μg/mLMIC折點(diǎn)和判讀SIR注1：Version2.0,2020,.“增加藥物暴露敏感”；R-耐藥：當(dāng)治療失敗的可能注3：*代表ATU：技術(shù)不確定性區(qū)域，白念珠菌對(duì)米卡芬凈的ATU值是0.03mg/L，如果對(duì)阿尼芬凈敏感感，并加以下注釋：菌株對(duì)阿尼芬凈敏感，對(duì)米卡芬凈的MIC值為0.03mg/L沒(méi)有fks突變；如果對(duì)阿尼芬凈不敏表E.3EUCAST有折點(diǎn)的念珠菌屬的ECOFF值(μg/mL）111114WS/T421—2024表E.3EUCAST有折點(diǎn)念珠菌屬的ECOFF值(μg/mL續(xù)）2212121表E.3EUCAST有折點(diǎn)念珠菌屬的ECOFF值(μg/mL續(xù)）11注1：Version2.0,2020,.表E.4EUCAST有折點(diǎn)的隱球菌屬的ECV值(μg/mL）1注1：Version2.0,2020,.WS/T421—2024AntifungalSusceptibilityTestingofYeasts.4thEdition,M27,2017.derivingbreakpoints.InfectClinMicrobiolInfecsusceptibilitytestsoftenantifungalagents.invasivecandidiasisduetoCandidaglabrata.AntimicrobAgentsChem56(9):4862-4869.InfectDis.2011,70(3):330AntifungalSusceptibilityTesting.3rdEdition,M59,2020.SusceptibilityTestingofFilamentousFungi.2ndEdition,M61gattii/Cryptococcusneoformansspec