【生物】重組DNA技術(shù)的基本工具課件-2023-2024學年高二下人教版選擇性必修三

1980年世界上第一個轉(zhuǎn)基因動物問世超級小鼠：轉(zhuǎn)入大鼠的生長激素基因，使小鼠體重為正常個體的二倍。中國抗蟲棉之父郭三堆普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲棉棉鈴蟲抗蟲棉花核心技術(shù)于1995年申請國家發(fā)明專利，1998年正式授權(quán)，2001年該專利被國際知識產(chǎn)權(quán)組織及國家知識產(chǎn)權(quán)局授予發(fā)明專利金獎。它標志著我國成為繼美國之后，世界上獨立自主研制成功抗蟲棉的第二個國家。

按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ滩僮魉剑篋NA分子水平轉(zhuǎn)基因技術(shù)、DNA重組技術(shù)、基因拼接技術(shù)

原理：基因重組克服遠緣雜交不親和障礙、定向改造生物性狀普通棉花蘇云金芽孢桿菌Bt抗蟲蛋白基因普通棉花細胞DNA含Bt抗蟲蛋白基因棉花抗蟲棉基因工程的可行性所有細胞生物遺傳物質(zhì)都是DNA，且DNA分子在結(jié)構(gòu)上具有統(tǒng)一性，保證了目的基因可插入受體細胞的DNA中所有的生物共用同一套密碼子，保證目的基因能在受體細胞中表達出相同蛋白

優(yōu)點：基因工程轉(zhuǎn)基因技術(shù)、DNA重組技術(shù)、基因拼接技術(shù)“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運輸車”切割DNA分子連接DNA片段將重組DNA導入受體細胞選擇性必修三第3章第1節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具CT制作自學時間P71Thequestion：Q3：“分子手術(shù)刀”的作用位點？Q2：“分子手術(shù)刀”的來源？Q1：“分子手術(shù)刀”是什么？Q4：“分子手術(shù)刀”的類型有哪些？一“分子手術(shù)刀”限制性內(nèi)切核酸酶限制酶2.作用位點：切斷特定部位的磷酸二酯鍵1.主要來源：原核生物目前分離出數(shù)千種磷酸二酯鍵2.作用位點：切斷特定部位的磷酸二酯鍵識別序列

長度一般為4-8個或其他數(shù)量的脫氧核苷酸，最常見的為6個核苷酸。3.種類EcoRⅠ限制酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GSmaⅠ限制酶E口Rone斯馬oneC

CC

GG

GGGG

CC

C回文序列：正反讀一樣限制酶的命名

EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個字母R型菌株從中分離的第一個限制酶流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindIHindIIHindIII

粘質(zhì)沙雷氏桿菌(Serratiamarcesens)中分離的第一種限制酶為Sma

ⅠEcoRⅠ限制酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G識別GAATTC序列，并在G和A之間磷酸二酯鍵切開粘性末端：-G-CTTAAAATTGCCTTAAG磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵切斷幾個磷酸二酯鍵?SmaⅠ限制酶識別CCCGGG序列，并在C和G之間磷酸二酯鍵切開平末端：-CCC-GGG磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵C

CC

GG

GGGG

CC

CGGGC

CCCC

C

GGG

要想獲得某個目的基因需要幾個識別位點，要用限制酶必須切斷幾個磷酸二酯鍵？產(chǎn)生幾個粘性末端？GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGAATTCGGCTTAA目的基因目的基因目的基因兩側(cè)各具備一個或多個限制酶的切割位點GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGAATTCGGCTTAA目的基因目的基因CCCGGGGAATTCGGGCCCCTTAAGGGGGCCCCTTAA目的基因目的基因目的基因兩側(cè)各具備一個或多個限制酶的切割位點，但每種酶的切點最好只有一個，否則獲得的目的基因會出現(xiàn)自我環(huán)化。提示：如圖寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。下圖甲是一個DNA片段，箭頭處代表不同限制酶的切點，據(jù)圖回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

種DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；（3）同時用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；（4）只用PstⅠ酶切，最多能得到

種DNA片段。2355

要想獲得某個目的基因選擇怎樣的限制酶？最終會形成多少個DNA片段？

現(xiàn)有一長度為1000堿基對(bp）的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用Kpn1單獨酶切得到400bp和600bp兩種長度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同時酶切后得到200bp和600bp兩種長度的DNA分子。該DNA分子的酶切圖譜正確的是

請判斷：以下黏性末端是由

種限制酶作用產(chǎn)生的。3①②③結(jié)論：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端細菌等原核生物容易受到自然界外源DNA（如噬菌體）的入侵。所以它在長期的進化過程中形成了套完善的防御機制。這類原核生物之所以長期進化而不滅絕，限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。思考：根據(jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？思考：為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？細菌自身的DNA沒有限制酶識別的特定序列或者識別序列被修飾（甲基化），所以不會限制酶切割自身的DNA。自學時間P72Thequestion：Q1：“分子縫合針”是什么？Q2：“分子縫合針”的類型有哪些，它們發(fā)揮作用有何區(qū)別？Theanswer：GC

TT

AA

AA

TT

C

G目的基因G

C

TT

AA

AA

TT

C

G目的基因二“分子縫合針”DNA連接酶DNA連接酶磷酸二酯鍵GC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

G目的基因1、功能：通過形成磷酸二酯鍵將不同DNA分子的相同末端進行連接氫鍵自動恢復(fù)Theanswer：二“分子縫合針”DNA連接酶2、種類Theanswer：二“分子縫合針”DNA連接酶E·coliDNA連接酶

T4DNA連接酶E考里（來源大腸桿菌，連接粘性末端）

（來源T4噬菌體，連接粘性末端和平末端效率低）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGEcoRⅠ限制酶E·coliDNA連接酶或

T4DNA連接酶DNA連接酶不識別堿基序列，只與末端類型有關(guān)CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSmaⅠ限制酶

T4DNA連接酶有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ進行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進行切割，各限制酶的識別序列和切割位點如下：哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeⅠ切割的A片段產(chǎn)生的DNA片段相連接，為什么？XbaⅠ因為XbaⅠ與SpeⅠ切割產(chǎn)生了相同的黏性末端（可互補）結(jié)論：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶歸納總結(jié)——與DNA相關(guān)的五種酶的比較DNA磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA切成兩個或多個片段將兩個DNA片段連接為一個DNA分子將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈DNADNA片段脫氧核苷酸磷酸二酯鍵DNA自學時間P72Thequestion：Q1：“分子運輸車”是什么？Q2：作為“分子運輸車”具有哪些條件？Theanswer：三“分子運輸車”載體種類受體細胞不同點質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動物病毒細菌細胞植物細胞動物細胞來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別大腸桿菌擬核質(zhì)粒質(zhì)粒環(huán)狀DNATheanswer：三“分子運輸車”載體目的基因插入位點一個和多個限制酶切割位點復(fù)制原點在受體細胞中自我復(fù)制或整合到染色體DNA中隨受體DNA同步復(fù)制標記基因便于重組DNA分子的篩選抗性基因：四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因目的基因重組DNA分子載體“拼接”受體細胞導入EcoRⅠ限制酶CCCGGGGAATTCGGGCCCCTTAAGGGGGCCCCTTAA目的基因SmaⅠ限制酶CTTAAGAAGTTC質(zhì)粒GGGccccccGGGCCCGGAAGTTCGEcoRⅠ限制酶SmaⅠ限制酶GGGGCCCCTTAA目的基因CCCGGAAGTTCGCCCGGGAAGTTCGCGAACCTT重組質(zhì)粒GGC①正向連接②正向連接③反向連接多個限制酶切位點：防止目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化或目的基因與質(zhì)粒反向連接GGGGCCCCTTAA目的基因CCCGGAAGTTCG質(zhì)粒CCCGGGAAGTTCGCGAACCTT重組質(zhì)粒GGC

質(zhì)粒的自身環(huán)化

由于用同種限制酶切割，會產(chǎn)生相同黏性末端，則可能導致目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接。圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。1.上述操作中不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞

和

。2.在基因工程的操作中，不宜只選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，

。目的基因抗性基因目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中標記基因便于重組DNA分子的篩選CT制作1、結(jié)構(gòu)單位：脫氧核糖核甘酸OPOH磷酸H3PO3OHO堿基CH2CCCCOHHHHOHH脫氧核糖G鳥嘌呤含氮T胸腺嘧啶A腺嘌呤C胞嘧啶Review：DNA脫氧核糖核酸1’2’3’4’5’腺嘌呤脫氧核苷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸2、脫氧核苷酸的種類AGCTRe