【生物】基因工程的基本操作程序課件-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修三

第三章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序選必三P76課標(biāo)內(nèi)容要求核心素養(yǎng)對接闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細胞和目的基因的檢測與鑒定。1.科學(xué)思維：結(jié)合生產(chǎn)實例，舉例說出基因工程的基本操作程序。2．科學(xué)探究：針對人類生產(chǎn)和生活的某一需求，嘗試提出初步的基因工程構(gòu)想，完成初步設(shè)計。從社會中來1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡)普通棉花1.目的基因的篩選與獲取第一步：目的基因的篩選與獲取1.目的基因的概念：（1）方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。2.篩選合適的目的基因

在基因工程的設(shè)計和操作中，用于_________________或_________________等的基因就是目的基因，根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指_________________；改變受體細胞性狀獲得預(yù)期表達產(chǎn)物編碼蛋白質(zhì)的基因與生物抗逆性(Bt抗蟲基因等)、優(yōu)良品質(zhì)(xx產(chǎn)量高的基因等)、生產(chǎn)藥物(胰島素、干擾素基因等)、毒物降解、工業(yè)用酶等相關(guān)的基因認識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法：_____技術(shù)、___________數(shù)據(jù)庫、____________工具。測序序列（如GenBank）序列比對（如BLAST）DNA序列自動測序儀第一步：目的基因的篩選與獲?。?）實例：2.篩選合適的目的基因Bt抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過程蘇云金桿菌（Bt）制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害對Bt基因的表達產(chǎn)物-Bt抗蟲蛋白有較為深入的了解：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲蘇云金桿菌的殺蟲作用于Bt基因有關(guān)掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因【P77相關(guān)信息】當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體。因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響。第一步：目的基因的篩選與獲?。?）PCR的概念:3.利用PCR獲取和擴增目的基因PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)；①全稱：②原理：③操作環(huán)境：④目的：⑤優(yōu)點：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制可以在短時間內(nèi)大量擴增目的基因

PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎

如果說，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著分子生物學(xué)時代的開啟，那么PCR技術(shù)則標(biāo)志著分子生物學(xué)的騰飛。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，徹底變革了生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)等等。因為他，分子生物學(xué)被劃分為兩個時代【凱利·穆利斯】/video/BV19m4y1K7ZN/?buvid=XXE83F2EEECB3594C8517F3E3F4307FE52431&from_spmid=main.space-contribution.0.0&is_story_h5=false&mid=L9I53oFp71vyluIt1Ey6jw%3D%3D&p=1&plat_id=116&share_from=ugc&share_medium=android&share_plat=android&share_session_id=602b6bdf-5069-45b6-92ca-79e5f30f1068&share_source=WEIXIN&share_source=weixin&share_tag=s_i&spmid=united.player-video-detail.0.0×tamp=1712669410&unique_k=qJ1spM9&up_id=1046210349新合成的子鏈DNA聚合酶DNA聚合酶解旋酶4種游離的脫氧核苷酸（2）DNA復(fù)制及其所需的基本條件:②DNA母鏈/DNA模板鏈①③④④⑤（2）DNA復(fù)制及其所需的基本條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用

解旋酶DNA母鏈

4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶，如Taq酶）（體外用高溫代替）引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。在細胞內(nèi)進行DNA復(fù)制時，引物多為短RNA單鏈（由引物酶合成）。在體外PCR中，引物為人工設(shè)計、合成的短DNA單鏈，長度通常為20~30個核苷酸。（體外用dNTP）引物(2種)DNA模板耐高溫的DNA聚合酶Taq酶4種脫氧核苷酸

實際為dNTP3’5’3’5’3’5’3’5’①變性

當(dāng)溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈②復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合③延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈（3）PCR反應(yīng)過程條件3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’緩沖液（含Mg2+)Mg2+激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物（3）PCR反應(yīng)過程變性（90--95℃）復(fù)性（50--55℃）延伸（72℃左右）PCR的每一次循環(huán)：（3）PCR反應(yīng)過程①變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在高溫的作用下

受熱變性，_____鍵斷裂，形成_________②復(fù)性（復(fù)性50℃左右）：溫度降低，______與DNA模板

互補配對，結(jié)合形成局部________。③延伸（72℃左右）：___________________________在

_____酶的作用下，合成與模板互補的DNA鏈。氫單鏈DNA雙鏈引物Taq4種游離的脫氧核苷酸/dNTP每次循環(huán)一般可以分為______、______、______三步。變性復(fù)性延伸重復(fù)循環(huán)多次。由于延伸后得到的_____又可以作為下一個循環(huán)的_____，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成_____形式擴增。產(chǎn)物模板指數(shù)（約為2n，其中n為擴增循環(huán)的次數(shù)）

目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合(復(fù)性)；然后以目的基因的兩條單鏈DNA為模板在DNA聚合酶作用下進行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到引物的3’端，如此重復(fù)循環(huán)多次。（3）PCR反應(yīng)過程上述過程可以在PCR擴增儀（PCR儀）中自動完成，完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。【P79旁欄思考題】用PCR可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。1.逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成

RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的

DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA。目的基因第1輪復(fù)制【思考】加入PCR擴增儀的DNA片段一般比目的基因要長，用PCR技術(shù)至少經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA片段中分離出目的基因？3次第2輪復(fù)制5’5’第3輪復(fù)制高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化2）TaqDNA聚合酶的應(yīng)用DNA模板，四種脫氧核苷酸/dNTP，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，Taq酶4)PCR和細胞內(nèi)DNA復(fù)制的異同1）DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只有當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶才能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。關(guān)于PCR的說明：3)緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)新合成的子鏈DNA聚合酶DNA聚合酶解旋酶4種游離的脫氧核苷酸②DNA母鏈/DNA模板鏈①③④④⑤返回邊解旋邊復(fù)制PCR技術(shù)與細胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項目細胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋特點解旋方式場所酶溫度結(jié)果聯(lián)系先解旋后復(fù)制邊解旋邊復(fù)制DNA在高溫(超過90℃)下變性解旋解旋酶催化體外/PCR擴增儀主要在細胞核內(nèi)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)解旋酶、DNA聚合酶

等控制不同溫度(變性、復(fù)性、延伸)細胞內(nèi)溫和條件大量的DNA片段或基因合成整個DNA分子①原理都是DNA的半保留復(fù)制；都遵循堿基互補配對原則②模板：均需要DNA的雙鏈作為模板④原料：均為四種脫氧核苷酸(dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP)⑤酶：均需DNA聚合酶③引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3’端開始進行互補鏈的合成(PCR的引物是人工設(shè)計、合成的短DNA片段)⑥均需要能量1.

下列有關(guān)PCR技術(shù)的說法，錯誤的是（）

A.

PCR是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)

B.

PCR技術(shù)的原理是DNA分子半保留復(fù)制

C.

復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補配對原則

D.

PCR擴增中需要解旋酶解開雙鏈DNA2.

下列有關(guān)PCR擴增目的基因的敘述，錯誤的是（

）

A.

PCR擴增一般需要經(jīng)歷多個循環(huán)，每個循環(huán)分為變性、復(fù)性和延伸3步

B.

PCR擴增時，需要向PCR管中加入4種游離的脫氧核苷酸

C.

PCR過程需要耐高溫的Taq酶和DNA連接酶

D.

PCR擴增區(qū)域由2種引物來決定D隨堂練習(xí)C3.下列關(guān)于PCR的敘述，正確的是（

）

A.

PCR是體外復(fù)制DNA的技術(shù)，關(guān)鍵酶是解旋酶和DNA聚合酶

B.

DNA聚合酶從引物的5'端開始連接脫氧核苷酸

C.

第三輪循環(huán)產(chǎn)物中出現(xiàn)位于兩種引物之間的DNA片段

D.

延伸過程需要酶和4種核糖核苷酸4.應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA，需要的條件是（

）①目的基因

②引物

③四種脫氧核苷酸

④四種核糖核苷酸⑤耐熱的DNA聚合酶

⑥核糖體

⑦mRNA

A.

①②④⑤

B.②③④⑦

C.①③④⑤

D.①②③⑤C隨堂練習(xí)D第二步：基因表達載體的構(gòu)建(核心步驟)1.構(gòu)建基因表達載體的目的：通過PCR技術(shù)獲取了足夠量的Bt基因后，下一步要做什么？（1）讓目的基因在受體細胞中____________并可以_________給下一代；（2）使目的基因能夠________和發(fā)揮作用。穩(wěn)定存在表達遺傳基因表達載體是載體的一種，除___________、__________外，它還必須有_________、_______等。2.基因表達載體目的基因選必三P80標(biāo)記基因啟動子終止子第二步：基因表達載體的構(gòu)建2.基因表達載體當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達(1)啟動子→轉(zhuǎn)錄開始一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的______片段DNA①本質(zhì)：②位置：位于基因的____，緊挨____________上游轉(zhuǎn)錄的起始位點③功能：

RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA④人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動子：操縱基因結(jié)構(gòu)基因

啟動子RNA聚合酶第二步：基因表達載體的構(gòu)建2.基因表達載體(2)終止子→轉(zhuǎn)錄結(jié)束：①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的____片段DNA②位置：位于基因的_____下游③功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(3)標(biāo)記基因：①作用：便于重組DNA分子的篩選(4)目的基因：②常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。如Bt基因。(5)復(fù)制原點：使能完成自主復(fù)制DNA復(fù)制的起點DNA聚合酶的結(jié)合位點啟動子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別

項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰堿基mRNA上三個相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出RNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束決定翻譯的開始決定翻譯的結(jié)束①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因（、啟動子、終止子）。注意：③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。②目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去?！舅伎肌勘磉_載體為什么一定要有啟動子？啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有啟動子，才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達；(2)通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，如果只將編碼序列導(dǎo)入受體細胞無法轉(zhuǎn)錄，需要將啟動子、編碼基因、終止子都導(dǎo)入受體細胞。DNA連接酶3.

基因表達載體的構(gòu)建過程重組DNA分子/基因表達載體限制酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因基因表達載體構(gòu)建模式圖限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點質(zhì)粒/載體要求？①在構(gòu)建基因表達載體時，首先會用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個切口；②用_____________或___________________________________切割含有目的基因的DNA片段同種限制酶能產(chǎn)生相同末端的限制酶/同尾酶③利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個重組DNA分子。1.切割載體和切割含有目的基因的DNA片段為什么要用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端，以便通過DNA連接酶連接；思考與討論2.用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，再用DNA連接酶處理后，會出現(xiàn)幾種產(chǎn)物？(只考慮兩兩結(jié)合)一定會形成符合要求的重組DNA分子嗎？不一定，載體和目的基因都可能出現(xiàn)自環(huán)化或自身與自身連接；目的基因也可能會出現(xiàn)反向連接3.如何避免上述問題？

同時用兩種限制酶切割含目的基因的DNA片段和載體（使得目的基因的一端與載體一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端與載體另一端的黏性末端相同）1、運載體上和目的基因兩端都必須的限制酶的切位點；2、限制酶的切位點不能破壞目的基因以及標(biāo)記基因（運載體上至少保留一個標(biāo)記基因）3、最好同時用兩種限制酶，避免載體和目的基因出現(xiàn)自環(huán)化，避免目的基因出現(xiàn)反向連接。選擇限制酶的原則：隨堂練習(xí)

圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細胞的質(zhì)粒（陰影部分表示四環(huán)素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。（1）上述操作中不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞________________。（2）上述操作中不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________。目的基因(抗病基因)和標(biāo)記基因(四環(huán)素抗性基因)目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中①用圖1中的質(zhì)粒和圖2中的外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。②不選用EcoRⅠ切割，原因是

。SmaⅠ會破壞目的基因和質(zhì)粒中的抗性基因防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化隨堂練習(xí)思考與討論【P80旁欄思考題】將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w細胞有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法將這些DNA導(dǎo)入受體植物，沒有進行基因表達載體的構(gòu)建。隨堂練習(xí)1.在基因表達載體的構(gòu)建中，下列敘述正確的是（）A.必須在細胞內(nèi)進行B.有了啟動子才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNAC.所有基因表達載體的構(gòu)建是完全相同的D.一個基因表達載體的組成只包括目的基因、啟動子、終止子2.下列關(guān)于基因表達載體的構(gòu)建，描述錯誤的是（）A.基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心B.基因表達載體上的標(biāo)記基因不一定是抗生素抗性基因C.目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因D.終止密碼子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止BD隨堂練習(xí)3.下列有關(guān)抗蟲基因表達載體的敘述，正確的是（）A.切割含抗蟲基因的DNA片段和載體必須用同種限制酶B.抗蟲基因表達載體中要有起始密碼子C.抗蟲基因表達載體必須具備標(biāo)記基因，其作用是篩選含有目的基因的受體細胞D.抗蟲基因的表達開始于復(fù)制原點C第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胧荏w細胞的常用方法：閱讀81頁和82頁倒數(shù)第二段的內(nèi)容，找出將目的基因?qū)氩煌荏w細胞的常用方法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法(多用于單子葉植物)花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法/感受態(tài)細胞植物細胞動物細胞微生物細胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎某Ｓ梅椒ǎ?1)花粉管通道法：我國科學(xué)家獨創(chuàng)①用___________將___________________直接注入_____中；微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去_____，將__________滴加在__________上，使目的基因借助___________進入_____；柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊子房花粉柱頭花粉管精子卵細胞胚囊花粉管通道法的受體細胞：受精卵將目的基因?qū)胫参锛毎某Ｓ梅椒ǎ?2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)___________和______的過程。維持穩(wěn)定表達例子：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗。閱讀81頁的資料卡，思考下列問題。1.T-DNA的T是什么意思？為何要把目的基因接在T-DNA中？2.目的基因發(fā)生了幾次剪切和拼接？3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法能有效應(yīng)用于單子葉植物嗎？為什么？(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。將目的基因插入_______________中，通過農(nóng)桿菌的______作用，就可以使目的基因______________②農(nóng)桿菌特點：a.能在自然條件下侵染___________和_________，而對大多數(shù)___________沒有侵染能力；雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有_______，當(dāng)它侵染植物細胞后，能將______上的_______（_____________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其____________________________；Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細胞的染色體DNA上③利用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進入植物細胞轉(zhuǎn)化的實質(zhì)：將目的基因整合到受體細胞的基因組中，使其成功表達(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法④過程：兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體DNA上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細胞。

(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法⑤轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與__________________的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后_____________，并利用______________技術(shù)得到表現(xiàn)出新性狀的植株；受體細胞為_______導(dǎo)入了重組Ti質(zhì)粒篩選轉(zhuǎn)化細胞植物組織培養(yǎng)體細胞b.可以將花序直接浸沒在含有________________的農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得_____，再進行_____、_____等；受體細胞為_______導(dǎo)入了重組Ti質(zhì)粒種子篩選鑒定受精卵(3)基因槍法(多用于單子葉植物)基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。目的基因?qū)雱游锛毎贿m合用基因槍法，動物細胞易被殺傷。將目的基因?qū)雱游锛毎某Ｓ梅椒?/p>

——

顯微注射法（1）受體細胞：受精卵(因為受精卵易表現(xiàn)出全能性)（2）過程：2024/4/24構(gòu)建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物將目的基因?qū)胛⑸锛毎某Ｓ梅椒?/p>

——

Ca2+處理法（1）受體細胞：常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌最廣泛（2）原核生物的優(yōu)點:繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少、易于培養(yǎng)（3）一般過程:2024/4/24Ca2+處理大腸桿菌使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達載體導(dǎo)入其中Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性這種細胞稱為感受態(tài)細胞隨堂練習(xí)1.下列有關(guān)目的基因?qū)胧荏w細胞的說法中，正確的是（）

A.

大腸桿菌作為受體細胞時通常需要使用鈉離子處理

B.

通過顯微注射法可將目的基因直接導(dǎo)入受體細胞中

C.

將目的基因?qū)胧荏w細胞，并在受體細胞維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化

D.

可用基因槍法將目的基因?qū)雱游锸芫阎?.將目的基因?qū)耸荏w細胞是實施基因工程的第三步，下列有關(guān)說法不正確的是（）

A.

將目的基因?qū)肼阕又参锖蛦巫尤~植物細胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

B.

轉(zhuǎn)基因動物的培育過程中受體細胞一般選擇受精卵

C.

用Ca2+處理受體細胞是將目的基因?qū)胛⑸锛毎胁捎米疃嗟姆椒?/p>

D.

基因槍法是單子葉植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高CA隨堂練習(xí)3.受體細胞不同，將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法也不相同。下列受體細胞與導(dǎo)入方法匹配錯誤的是（）4.通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以使人的胰島素基因得以表達，合成有活性的胰島素的受體細胞是（）

A．大腸桿菌

B．酵母菌

C．肺炎雙球菌

D．乳酸菌選項受體細胞導(dǎo)入方法A棉花細胞花粉管通道法B大腸桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法C羊受精卵顯微注射技術(shù)D大豆細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法B大腸桿菌為原核細胞，而酵母菌為真核細胞，具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等多種細胞器，所以在，生產(chǎn)需要加工和分泌的蛋白質(zhì)時，酵母菌比大腸桿菌更具優(yōu)勢。B若利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)人的胰島素原核生物作為受體細胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。檢查目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的鑒定受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)DNA探針、RNA探針目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體是否具有相應(yīng)性狀病原體接種實驗等1.目的：第四步：目的基因的檢測與鑒定2.檢測內(nèi)容及方法:個體生物學(xué)水平的鑒定具體方法舉例轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進行功能活性比較功能、活性正常第四步：目的基因的檢測與鑒定隨堂練習(xí)1．下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細胞的描述，不正確的是()

A．培育“黃金大米”可用花粉管通道法導(dǎo)入目的基因

B．顯微注射技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動物中采用最多的方法

C．目的基因?qū)氪竽c桿菌最常用的方法是Ca2＋處理法

D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛毎畛Ｓ玫姆椒ˋ提示：水稻的花很小，不適合用花粉管通道法導(dǎo)入目的基因，A錯誤；將目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ蔑@微注射法，B正確；將目的基因?qū)胛⑸锛毎畛Ｓ玫姆椒ㄊ怯肅a2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)，C正確；將目的基因?qū)胫参锛毎畛Ｓ玫姆椒ㄊ寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，此外還有基因槍法和花粉管通道法，D正確。歸納總結(jié)第四步：目的基因的檢測與鑒定隨堂練習(xí)1．基因工程主要操作步驟的順序是()①基因表達載體的構(gòu)建②將目的基因?qū)胧荏w細胞③目的基因的檢測與鑒定④目的基因的獲取

A．③②④①

B．②④①③

C．④①②③

D．③④①②C【思考】基因表達載體中具備標(biāo)記基因，已經(jīng)對受體細胞進行了篩選，為什么在基因工程的第四步還要對目的基因進行檢測和鑒定？基因表達載體中的標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）可以對受體細胞進行初次篩選：利用含抗生素的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，在這種培養(yǎng)基上能生長的是具有抗生素抗性的細胞，即導(dǎo)入了載體的細胞，這里的載體可能是基因表達載體，也可能是未插入目的基因的空載體。因此第四步需要對目的基因是否成功導(dǎo)入進行進一步的檢測。此外，雖然在選擇培養(yǎng)基上能生長的細胞中導(dǎo)入的是基因表達載體，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正確，能否正確表達，因此也需要在轉(zhuǎn)錄和翻譯及個體水平上進行檢測和鑒定。隨堂練習(xí)判斷對錯(正確的打“√”，錯誤的打“×”)1．從已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選目的基因是獲取目的基因的一種有效方法。（

）2．Taq酶是用PCR儀對DNA分子擴增過程中常用的一種耐高溫的DNA連接酶。（

）3．基因表達載體中啟動子是DNA聚合酶識別和結(jié)合的部位。（

）4．將重組表達載體導(dǎo)入動物受精卵常用顯微注射法。（

）5．轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測才能達到目的。()6．可通過PCR等技術(shù)檢測棉花的染色體上是否插入了Bt基因。（

）×√×√×Taq酶是耐高溫的DNA聚合酶RNA個體水平的檢測√隨堂練習(xí)1．下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。下列相關(guān)敘述正確的是(

)DA．②的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶參與B．③侵染植物細胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀D．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異隨堂練習(xí)2．下圖是將某細菌的基因A導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)制備“工程菌”的示意圖。據(jù)圖回答：(1)獲得A有兩條途徑：一是以A的mRNA為模板，在________酶的催化下，合成互補的單鏈DNA，然后在____________酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需基因；二是根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的________序列，推測出相應(yīng)的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測其DNA的_____________序列，再通過化學(xué)方法合成所需基因。逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合氨基酸脫氧核苷酸隨堂練習(xí)2．下圖是將某細菌的基因A導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)制備“工程菌”的示意圖。據(jù)圖回答：(2)利用PCR技術(shù)擴增DNA時，需要在反應(yīng)體系中添加的有機物質(zhì)有_______、_____________、4種脫氧核糖核苷三磷酸和耐高溫的DNA聚合酶，擴增過程可以在PCR擴增儀中完成。(3)由A和載體B拼接形成的C通常稱為______________。(4)在基因工程中，常用Ca2＋處理D，其目的是________________________。引物模板(A基因)基因表達載體使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)到社會中去轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在世界范圍內(nèi)被廣泛種植，有效控制了棉鈴蟲的種群數(shù)量，顯著減少了農(nóng)藥的用量。面對棉鈴蟲的危害，有了抗蟲棉是否就可以一勞永逸、高枕無憂呢？根據(jù)棉鈴蟲對傳統(tǒng)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的發(fā)展歷史，科研人員推測棉鈴蟲存在對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的可能。請你查閱資料，了解以下問題。1．在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴重的抗性？證據(jù)是什么？2．科研工作者在發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

這是一個開放性的問題，需要學(xué)生查找資料來回答。隨著田間監(jiān)測數(shù)據(jù)的更新及新的科研論文發(fā)表，每年學(xué)生獲得的證據(jù)是不一樣的。例如，科研人員對長江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進行了監(jiān)測，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標(biāo)害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，科研人員通過毒素的連續(xù)性抗性篩選，已經(jīng)培育出多個高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。教師要注意引導(dǎo)學(xué)生搜集科學(xué)、可靠的證據(jù)，如科研論文、權(quán)威的官方報道等。1．在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴重的抗性？證據(jù)是什么？科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）國家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實施分區(qū)種植管理、加強抗性監(jiān)測、進行嚴格的安全性評價等。（2）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性，包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個殺蟲基因、構(gòu)建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉(zhuǎn)入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經(jīng)常將兩種或兩種以上的Bt基因（如Cry1Aa和Cry1Ac基因）同時轉(zhuǎn)入棉花細胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。2．科研工作者在發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？（3）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。例如，澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉(zhuǎn)基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花，或在轉(zhuǎn)基因棉田周圍種植20%~30%面積的可使用化學(xué)殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花；在印度，一些地區(qū)要求，在轉(zhuǎn)基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉(zhuǎn)基因棉花。我國除新疆棉區(qū)及大型農(nóng)場需設(shè)計專門的庇護所外，其他棉區(qū)如長江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度（如將轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉鈴蟲宿主作物混作），這些作物可以構(gòu)成天然的庇護所，一般無須種植非轉(zhuǎn)基因棉花作為庇護所。這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標(biāo)害蟲種群。這樣，即使目標(biāo)害蟲對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉產(chǎn)生了抗性，但是因為其與敏感目標(biāo)害蟲交配，后代抗性基因會發(fā)生分離，所以抗性目標(biāo)害蟲的種群也不至于迅速增加。2．科研工作者在發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？一、概念檢測1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（

）（2）構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。（

）（3）只要檢測出番茄細胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功。()練習(xí)與應(yīng)用

（書本P83）√××一、概念檢測2．利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關(guān)PCR的敘述錯誤的是（

）A．PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B．變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶C．復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補配對原則D．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸練習(xí)與應(yīng)用

（書本P83）D二、拓展應(yīng)用

研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒有卡那霉素抗性