口蹄疫滅活疫苗有效成分及穩(wěn)定性問(wèn)題解析

筆者在技術(shù)服務(wù)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到客戶(hù)問(wèn)一些如“發(fā)病后能否打口蹄疫疫苗？”“母豬、仔豬免疫后抗體水平怎么樣、首免時(shí)間如何確定？”“疫苗是否是最新生產(chǎn)日期，有效期是多少？”“抗體水平如何？”等問(wèn)題，更多的客戶(hù)則關(guān)注如何選擇口蹄疫疫苗？比如疫苗的有效抗原含量是多少？抗原衰減度如何？雜蛋白占比怎樣？而疫苗中雜蛋白、內(nèi)毒素、有效抗原含量都是衡量一個(gè)疫苗企業(yè)的工藝實(shí)力、保障優(yōu)質(zhì)疫苗的前提條件。

疫苗生產(chǎn)是系統(tǒng)工程，影響疫苗免疫效果的因素很多，就疫苗質(zhì)量而言，一個(gè)真正合格的疫苗必須具備四大特性：安全、高效、均一、穩(wěn)定。能否達(dá)到這些要求與疫苗生產(chǎn)工藝、保存、疫苗穩(wěn)定性、檢測(cè)評(píng)估方法、豬群狀態(tài)等因素密切相關(guān)。1.口蹄疫抗原分析

在口蹄疫滅活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S粒子）是重要的免疫抗原，它的含量、完整性、穩(wěn)定性決定了疫苗的免疫效果?？谔阋卟《臼菬o(wú)囊膜病毒，對(duì)氯仿不敏感，對(duì)溫度、酸堿度等物理、化學(xué)物質(zhì)比較敏感，如果保存不當(dāng)、pH變化或溫度升高的狀態(tài)下，完整病毒146S容易分解為五聚體即12S（如下圖1、2所示）。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果將大幅度降低，因此工藝控制及保護(hù)完整病毒粒子不降解是各個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的絕密技術(shù)，如口蹄疫純化、濃縮、保存技術(shù)都是口蹄疫生產(chǎn)中很難突破的技術(shù)，生產(chǎn)中如何保護(hù)146S抗原完整性又要保證疫苗純度，去除非必需雜蛋白，兩者關(guān)系是工藝攻關(guān)難點(diǎn)，完整病毒粒子配合優(yōu)質(zhì)佐劑，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，進(jìn)而保護(hù)易感動(dòng)物不被口蹄疫病毒感染，最終使口蹄疫滅活疫苗起到防控作用。

Figure1.DissociationofFMDVcapsidsintopentamericassembliesanddesignofthemodelsusedforMDsimulations.圖1.口蹄疫衣殼蛋白在存儲(chǔ)、加熱、低pH條件下，完整病毒粒子146S裂解成12S五聚體（電鏡圖）引自：Publishedinfinaleditedformas:NatStructMolBiol.2015October;22(10):788–794.doi:10.1038/nsmb.3096.

Figure2.FMDV,serotypeO:(a)alone,(b)comparedwithIgMantibody

圖2.O型口蹄疫完整病毒粒子能刺激機(jī)體產(chǎn)生早期IgM抗體

引自：F.Brown，Antibodyrecognitionandneutralizationoffoot-and-mouthdiseasevirus，1995AcademicPressLtd2.什么是146S?評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是什么？

146S是指口蹄疫病毒在繁殖子代病毒過(guò)程中，由病毒衣殼和基因組共同組成的完整粒子，不是所有的抗原都能產(chǎn)生有效抗體，能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效抗體的抗原才稱(chēng)為有效抗原?？谔阋咄暾《玖Ｗ釉谡崽敲芏忍荻戎械某两迪禂?shù)為146S，所以我們就用146S來(lái)代表口蹄疫疫苗的有效抗原。

目前146S評(píng)價(jià)方法有蔗糖密度梯度離心法、紫外分光光度計(jì)定量法、液相色譜儀定量法、ELISA檢測(cè)法等四種檢測(cè)方法，但蔗糖密度梯度離心法是OIE推薦的金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，大部分疫苗生產(chǎn)企業(yè)用此方法進(jìn)行定量添加抗原，因?yàn)橥暾?46S抗原上有口蹄疫病毒的所有中和位點(diǎn)，能有效刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，因此完整的146S粒子的濃度多少，可作為一項(xiàng)評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。3.口蹄疫疫苗抗原穩(wěn)定性與免疫原性的關(guān)系

穩(wěn)定的抗原和安全、有效的佐劑是疫苗研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)?？谔阋邷缁钜呙绲淖畲笕毕菰谟谄浞€(wěn)定性很差，在低溫長(zhǎng)期儲(chǔ)存、加熱和微酸性環(huán)境中，病毒顆粒極其容易裂解，裂解產(chǎn)物也被稱(chēng)為12S，12S是一個(gè)由VP1、VP2、VP3組成的五聚體。因?yàn)槲寰垠w之間存在大量的組氨酸殘基，在酸性環(huán)境下組氨酸會(huì)迅速發(fā)生質(zhì)子化，釋放正電荷，通過(guò)靜電排斥作用引發(fā)粒子裂解，這是口蹄疫不穩(wěn)定的原因。由于146S粒子在酸性環(huán)境下分解成12S粒子，而12S表面的免疫反應(yīng)位點(diǎn)被隱藏或發(fā)生形變的緣故，使12S不具備任何免疫原性，無(wú)法激發(fā)產(chǎn)生抗體，降低口蹄疫疫苗的免疫效力?？谔阋卟《緯?huì)在高溫狀態(tài)下，使組合狀態(tài)的12S粒子轉(zhuǎn)化為分解狀態(tài)，因此口蹄疫病毒不宜長(zhǎng)期暴露在高溫狀態(tài)下?？谔阋咭呙缧Яεc口蹄疫滅活疫苗中的146S粒子數(shù)量有關(guān)，若是能夠確保146S粒子穩(wěn)定不被分解，那么口蹄疫疫苗的效力就能到有效的保護(hù)，這也是口蹄疫滅活疫苗必須在2~8℃保存的原因?？谔阋呖乖€(wěn)定性差給口蹄疫疫苗的生產(chǎn)、儲(chǔ)存和應(yīng)用帶來(lái)了很多困難，使用過(guò)程中必須全程冷鏈運(yùn)輸以保護(hù)口蹄疫的免疫原性。

從圖3數(shù)據(jù)可知，金宇口蹄疫A型、O型滅活疫苗在2~8℃分別放置12個(gè)月，每月采用蔗糖密度梯度離心定量法檢測(cè)146S含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，146S抗原含量基本沒(méi)有變化,說(shuō)明疫苗有效抗原保存比較好，完整病毒粒子保存完整，對(duì)疫苗效力有極大的幫助。圖3.口蹄疫滅活疫苗2~8℃放置12個(gè)月的含量的變化

Figure

3.changesinthecontentoftwoantigensafter12monthsat2-8℃圖4.口蹄疫O型、A型疫苗反復(fù)多次凍融后抗原含量的變化Figure4.Changesinantigencontentoffoot-and-mouthdiseaseOandAvaccinesafterrepeatedfreezingandthawing

從圖4數(shù)據(jù)可知，將口蹄疫滅活疫苗多次冷凍融化后，抗原含量降解比較多，每次反復(fù)凍融抗原損失20%~30%左右，5次反復(fù)凍融后，抗原損失70%左右，因此在保管疫苗時(shí)盡量不要凍融，凍融后的疫苗堅(jiān)決不能使用，因?yàn)橥暾《玖Ｗ?46S已經(jīng)裂解為無(wú)效的12S五聚體。

表5.不同口蹄疫毒株在50℃條件下熱穩(wěn)定性試驗(yàn)Figure5.Thermalstabilitytestofdifferentfoot-and-mouthdiseasestrainsat50℃

從圖5數(shù)據(jù)可知，口蹄疫不同毒株對(duì)熱穩(wěn)定性不一樣，不同毒株組氨酸比列不一樣，比列多可能更容易裂解，降解更快，免疫原性比較弱；如果溫度高破壞了疫苗內(nèi)部環(huán)境，使蛋白變性、酸度增加，完整病毒粒子146S已經(jīng)裂解為無(wú)效的12S五聚體。從不同毒株特性分析，MYA98降解速率＞Asia-1＞OR/80＞OZK/93，說(shuō)明MYA98毒株免疫活性?xún)?yōu)于其他毒株?？谔阋逴R/80、OZK/93在50℃條件下裂解8min后檢測(cè)不到有效抗原，說(shuō)明抗原穩(wěn)定性最差。通過(guò)以上數(shù)據(jù)，期望對(duì)口蹄疫疫苗的穩(wěn)定性研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。4.口蹄疫疫苗抗原保護(hù)劑、儲(chǔ)存、運(yùn)輸口蹄疫病毒抗原對(duì)酸和熱極其敏感，為了保證疫