GB-T工業(yè)微生物菌株生長(zhǎng)表型評(píng)價(jià) 液滴濁度法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

工業(yè)微生物菌株生長(zhǎng)表型評(píng)價(jià)微液滴濁

度法

Evaluationofthegrowthphenotypeoftheindustrymicroorganism

strain——Microdropletturbidity

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會(huì)

GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

工業(yè)微生物菌株生長(zhǎng)表型評(píng)價(jià)微液滴濁度法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了工業(yè)微生物菌株質(zhì)量評(píng)價(jià)微液滴濁度法的原理、試劑材料、儀器設(shè)備、操作步驟、結(jié)

果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于工業(yè)微生物菌株生長(zhǎng)表型評(píng)價(jià)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3原理

通過(guò)將微生物細(xì)胞限域在液滴中，利用微球中的面積進(jìn)行生長(zhǎng)速率計(jì)算和評(píng)價(jià)。

4試劑材料

除特殊說(shuō)明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的二級(jí)水。

4.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基

按照GB/T15818中方法配制?；蜻x用商品化的預(yù)制干燥培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照商品說(shuō)明書加水配制。

5儀器設(shè)備

5.1單細(xì)胞拉曼光譜測(cè)試系統(tǒng)：532nm激光，輸出強(qiáng)度不低于100mW，800mm長(zhǎng)焦，600刻線光柵，100

倍物鏡，光譜分辨率不低于2cm-1，波數(shù)范圍需包含“指紋區(qū)”，即390cm-1～1800cm-1。

5.2離心機(jī)，500～4000rpm/min。

5.3顯微鏡：100～400倍，帶CCD成像模塊

5.4無(wú)菌EP管：容量1.5毫升。

5.5微量移液器及槍頭：1毫升，200微升，10微升。

5.6聚四氟乙烯管：內(nèi)徑0.5mm，外徑1.59mm。

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6操作步驟

6.1LB培養(yǎng)基的制備

配制每升培養(yǎng)基,應(yīng)該在950mL去離子水中加入:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搖動(dòng)容

器直至溶質(zhì)溶解。用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.0。用去離子水定容至1L。在121℃蒸汽高壓滅菌20min。

6.2微生物菌株菌液制備

從瓊脂平板挑取微生物菌株單克隆于5mLLB培養(yǎng)基中，在37℃、220rpm搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。取1mL

的培養(yǎng)液3000rpm離心2min去除上清后加入PBS溶液，重復(fù)清洗3次。

6.3微生物菌液濃度選取

用LB培養(yǎng)基稀釋含有PBS的菌液3000倍，得到細(xì)胞懸液濃度約為6×105CFU/mL。

6.3瓊脂糖溶液制備

用分析天平稱取0.02g超低熔點(diǎn)瓊脂糖A5030，并向其中加入1mL已滅菌的LB培養(yǎng)基，加熱溶解，

配制成2%(g/v)的溶液。趁熱用0.22μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，備用。

6.4微流控芯片制作

用AutoCAD設(shè)計(jì)微流控芯片通道圖形，其中分散相的寬度為40μm，連續(xù)相的寬度為60μm。制備

出分辨率為24500DPI的芯片結(jié)構(gòu)掩膜。

制作芯片結(jié)構(gòu)硅片，包括勻膠、前烘、曝光、后烘、顯影步驟。

PDMS微流控芯片制作，同時(shí)制作出兩個(gè)芯片，一個(gè)用于待鑒定菌株，另一個(gè)用于工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株。

6.5單細(xì)胞液滴的產(chǎn)生

分別將兩種菌株稀釋到6×105CFU/mL細(xì)胞與超低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液混勻。

取一塊芯片，將兩個(gè)100μL的槍頭分別插在芯片的油相入口和水相入口，連續(xù)相為氟碳油，分散

相為低熔點(diǎn)瓊脂糖菌液，然后將聚四氟乙烯管連接出口與注射器。

將芯片放在溫控系統(tǒng)，范圍在30℃到37℃內(nèi)，將注射器的活塞用夾子固定在注射器2mL的位置，

開始發(fā)生液滴。

取另一塊芯片重復(fù)上述步驟。

6.6單細(xì)胞液滴的培養(yǎng)與生長(zhǎng)表型評(píng)價(jià)

液滴發(fā)生結(jié)束后，移除芯片上的槍頭和管子后，將兩芯片放入4℃冰箱冷凝20min后再置入盛有水

的培養(yǎng)皿中入37℃恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)6h。

培養(yǎng)后的瓊脂糖微球使用倒置顯微鏡在10X物鏡成像進(jìn)行成像，獲取的圖片保存為bmp格式并用軟件

進(jìn)行計(jì)數(shù)。

根據(jù)兩塊芯片內(nèi)微球中的面積進(jìn)行生長(zhǎng)速率的計(jì)算。獲取的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

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6.7工業(yè)菌株微生物的宏觀培養(yǎng)驗(yàn)證

將目標(biāo)液滴通過(guò)PEEK軟管收集到EP管中，加入破乳試劑對(duì)液滴進(jìn)行破乳。析出底層菌液加入LB培養(yǎng)

基中放入搖床培養(yǎng)12h,稀釋到適宜濃度后進(jìn)行涂布培養(yǎng)。

7結(jié)果分析

篩選菌株與參考菌株的生長(zhǎng)速率差異按式（1）計(jì)算：

………………….（1）

式中：

D——標(biāo)準(zhǔn)