GB-T水產(chǎn)源致敏性蛋白快速檢測 毛細(xì)管電泳法征求意見稿編制說明

一、任務(wù)來源

本國家標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目，項目編號“20171815-T-424”。

本項任務(wù)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院、

浙江工商大學(xué)、綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司、河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院等

單位共同組成。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定目的和意義

2.1保障消費(fèi)者食用安全需要標(biāo)準(zhǔn)提供支持

水產(chǎn)品以其營養(yǎng)豐富且味道鮮美的特性深受消費(fèi)青睞，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)位居

世界榜首，水產(chǎn)食品加工業(yè)發(fā)展迅猛。但是水產(chǎn)動物源致敏蛋白引起的過敏反應(yīng)

問題也日益突出，其過敏發(fā)病率持續(xù)上升，據(jù)統(tǒng)計，亞洲兒童食物過敏患者中，

甲殼類過敏率占39%，成人中甲殼類占33.8%。水產(chǎn)食品過敏可引發(fā)過敏性哮喘、

蕁麻疹、腹痛腹瀉，甚至危及生命。目前，針對易感人群尚沒有完善的治療方法，

水產(chǎn)品及其制品中典型致敏性蛋白標(biāo)識和預(yù)警顯得尤為重要。實際上這已經(jīng)成為

目前原料安全中重要的關(guān)注焦點，逐漸成為國內(nèi)外研究熱點。根據(jù)前期調(diào)研與分

析，目前市場上的確存在水生動物源致敏性蛋白原料標(biāo)注錯誤的現(xiàn)實情況，這勢

必會影響到過敏人群的健康，特別是作為食品原料已經(jīng)成為食品安全的一大因患。

因此，建立快速檢測水生動物源致敏性蛋白含量的檢測標(biāo)準(zhǔn)是保障消費(fèi)者食用安

全，保證食品安全的重要技術(shù)手段。

2.2建立完善的水生動物源致敏性蛋白檢測標(biāo)準(zhǔn)已是形勢發(fā)展之必然

近年來，食物過敏已經(jīng)成為世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization，WHO）

和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FoodandAgricultureOrganization，F(xiàn)AO）關(guān)注的重大公共衛(wèi)

生學(xué)和食品安全問題。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)審評委員會發(fā)布了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》，新標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定“食品及其制品可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)，如果

用作配料，應(yīng)在配料表中使用易辨識的名稱，或在配料表鄰近位置加以提示”。

其中，在我國標(biāo)準(zhǔn)中的過敏原食物中，水生動物占了兩大類，分別為魚類（包括

海水魚、淡水魚）和甲殼類水生動物（蝦、對蝦、螃蟹、大小龍蝦、蛤蜊等）。

因此，為推進(jìn)水產(chǎn)品過敏標(biāo)簽標(biāo)識工作的順利開展，建立完善的水生動物源致敏

性蛋白檢測標(biāo)準(zhǔn)已是形勢發(fā)展之必然。

研發(fā)水生動物源典型致敏性蛋白含量檢測的新方法，創(chuàng)建典型水生動物源致

1

敏性蛋白如原肌球蛋白和小清蛋白等快速檢測技術(shù)意義重大，旨在保障消費(fèi)者的

健康和安全以及促進(jìn)相關(guān)水生動物源原料的快速可持續(xù)發(fā)展。對于發(fā)展我國具有

獨立自主知識產(chǎn)權(quán)的水生動物源致敏性蛋白標(biāo)注產(chǎn)品具有重要意義，同時也是改

善目前標(biāo)注不確切和統(tǒng)一的現(xiàn)狀，保障過敏人群健康安全的需要，對于美麗中國

的建設(shè)同樣具有重要的現(xiàn)實價值。

2.3水產(chǎn)品相關(guān)產(chǎn)業(yè)升級迫切需要標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐

隨著世界經(jīng)濟(jì)全球化和貿(mào)易一體化，中國的食品安全和國際接軌是必然趨勢。

目前，過敏原風(fēng)險控制在我國水產(chǎn)品食品企業(yè)尚未得到全面的重視，為了使企業(yè)

更好地控制過敏原風(fēng)險，應(yīng)對出口貿(mào)易壁壘，建立水生動物致敏性蛋白質(zhì)風(fēng)險控

制系統(tǒng)對我國水產(chǎn)品加工企業(yè)是非常有必要的。進(jìn)行正確的過敏原標(biāo)識，在保護(hù)

了消費(fèi)者的同時，也提高了企業(yè)自身的法規(guī)符合性，是對企業(yè)法規(guī)符合性和經(jīng)濟(jì)

利益的保護(hù)。因此，建立水生動物源致敏性蛋白快速檢測標(biāo)準(zhǔn)是必要的，能夠幫

助企業(yè)進(jìn)行過敏原風(fēng)險控制，為相關(guān)產(chǎn)業(yè)的升級提供技術(shù)支撐。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則和依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫

規(guī)則》和GB/T20001.4-2001《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分化學(xué)分析方法》的要求，遵

循先進(jìn)性、科學(xué)性、實用性的原則對現(xiàn)行的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂。

四、主要工作過程

4.1組成標(biāo)準(zhǔn)起草小組

標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)下達(dá)后，2017年12月，組成了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了任務(wù)要

求，安排了工作進(jìn)度，成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，會議研究討論了《水生動物源

典型致敏性蛋白含量的快速檢測》初稿，對起草小組在標(biāo)準(zhǔn)起草過程中的一些思

考及難點問題進(jìn)行了深刻討論，起草工作小組首先確立了標(biāo)準(zhǔn)制定的基本原則，

各單位代表就標(biāo)準(zhǔn)的范圍界定、內(nèi)容等發(fā)表了各自的看法，確定了標(biāo)準(zhǔn)整體框架。

4.2開展相關(guān)調(diào)研情況

為了更好地支撐標(biāo)準(zhǔn)實施，起草工作小組首先對國際和國內(nèi)關(guān)于水生動物源

典型致敏性蛋白含量的檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和研究論文等資料進(jìn)行了調(diào)研，重點

收集分析了水生動物源典型致敏性蛋白含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)情況，完善了標(biāo)準(zhǔn)的框架

2

結(jié)構(gòu)及主要內(nèi)容。

4.3標(biāo)準(zhǔn)起草完善過程

在廣泛調(diào)查研究的基礎(chǔ)上，分析了當(dāng)前水生動物源典型致敏性蛋白含量檢測

需求，結(jié)合方法的研究工作，依據(jù)GB/T1.1—2000《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：

標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》、GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗方

法標(biāo)準(zhǔn)》等標(biāo)準(zhǔn)編制要求，對《水生動物源典型致敏性蛋白含量的快速檢測》標(biāo)

準(zhǔn)開展了研制工作。通過大量的實驗摸索、反復(fù)論證，確定了本標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)定的

一系列重要參數(shù)：提取方式、儀器條件、方法檢出限、回收率、精密度、線性范

圍等指標(biāo)，開展了實際樣品的檢測，并對方法進(jìn)行了驗證。起草工作小組完成了

《水生動物源典型致敏性蛋白含量的快速檢測》國家標(biāo)準(zhǔn)（草案）。在2018年

10月起草組組織專家對標(biāo)準(zhǔn)逐字逐句進(jìn)行了討論完善，形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。

五、主要技術(shù)內(nèi)容

5.1樣品前處理

5.1.1致敏蛋白的提取

采用兩種致敏蛋白提取方法提取蝦樣品，通過考察原肌球蛋白（Tropomyosin，

TM）的提取濃度確定最佳提取方法。

方法一：（1）用液氮研磨蝦肉，直至粉末狀；（2）提取液配制：8M尿素12

g，2M硫脲3.8g，4％3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸1g，用超純水定容到

25mL，于-80℃保存，臨用前加入65mM二硫蘇糖醇、0.8%兩性電解質(zhì)（pH3-10）；

（3）稱取0.1g蝦粉，添加1mL的裂解液，于4℃冰箱中孵育2h，其中每30min

斡旋震蕩一次。之后4℃，10000r/min下離心20min，吸取中間層的澄清液，分

裝保存于-80℃，應(yīng)避免反復(fù)凍融。

方法二：（1）用液氮研磨蝦肉，直至粉末狀；（2）在預(yù)冷的1mLLysisBuffer

中分別加入1μL蛋白酶抑制劑、10μL磷酸酶抑制劑及5μL100mMPMSF，混

勻后置冰上保存數(shù)分鐘待用；（3）快速稱取0.1g蝦粉置于1.5mL預(yù)冷離心管中，

加入1mL上述混合液，混勻后4℃靜置2h；（4）10000r/min，4℃離心5min，

取上清液，分裝保存于-80℃，應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3

表1不同提取方法提取同一蝦樣所得原肌球蛋白的濃度(n=6)

方法原肌球蛋白mg/mLRSD(%)

10.184.8

20.223.5

結(jié)果表明，方法2的原肌球蛋白提取濃度較高，因此采用該方法作為蛋白提

取方法（表1）。

5.1.2蛋白質(zhì)的純化方法優(yōu)化

由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性會影響毛細(xì)管電泳檢測的靈敏度和選擇性，蛋白質(zhì)粗

提后往往需要進(jìn)一步的純化和富集，本標(biāo)準(zhǔn)采用了陰離子交換層析法對提取的蝦

和魚樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。

提取致敏蛋白后，采用DEAESepharoseF.F.陰離子交換層析對蝦蛋白浸液和

魚蛋白浸液進(jìn)行分離純化，步驟如下：

（1）開機(jī)：打開蛋白質(zhì)純化儀，同時打開軟件，使計算機(jī)與儀器相連接；

（2）排氣：將蛋白質(zhì)純化儀的A、B管置于經(jīng)0.45μm濾膜過濾、排氣30min

的去離子水中，設(shè)置流速為0.5mL/min，流速穩(wěn)定后用注射器分別對A1、A2、

B1、B2四個流動泵進(jìn)行排氣；

（3）洗泵：對系統(tǒng)的A1泵、B1泵和系統(tǒng)管路進(jìn)行清洗；

（4）上柱：設(shè)置流速為0.5mL/min，并設(shè)置柱壓警報為0.5mPa后打開柱連

接器，先將DEAESepharoseF.F.1mL預(yù)裝柱上口注滿水然后快速擰緊柱連接器，

同時快速打開柱下口螺母，待出水穩(wěn)定后快速與柱連接器下方連接；

（5）洗柱：設(shè)置流速為0.5mL/min、柱壓警報為0.5mPa、用3倍柱體積的

去離子水洗柱；

（6）將A，B管分別置于平衡緩沖液（10mMTris-HCl，pH7.5）與洗脫液中

（0.5mol/LNaCl溶液）。

（7）上樣：2mL蝦蛋白浸液和魚蛋白浸液以0.5mL/min的流速上樣。

（8）設(shè)置紫外檢測器檢測波長為280nm并運(yùn)行實驗方法，實驗使用的其他

DEAESepharoseF.F.離子交換層析條件如表2所示。

4

表2蛋白純化儀DEAESepharoseF.F.離子交換層析條件

洗脫狀態(tài)流動相流速（mL/min）流動體積（CV）采集

柱平衡100%A1.05否

上樣100%A1.03否

洗柱100%A1.015否

線度洗脫100%B1.040是

再平衡100%A1.05否

（9）收集到的各洗脫峰溶液取部分用SDS分析。所得樣品冷藏備用（-80℃）。

圖1DEAESepharoseF.F.分離蝦蛋白洗脫曲線和SDS電泳圖（A）；DEAESepharoseF.F.

分離魚蛋白洗脫曲線和SDS電泳圖（B）

如圖1所示，各泳道依次為：M、蛋白Marker；S：原肌球蛋白粗提液；1、

離子交換層析第1峰收集物；2、離子交換層析第2峰收集物；3、離子交換層析

第3峰收集物。如圖1A所示，精氨酸激酶（Argininekinase，AK）在洗脫峰1

中獲得，收集管數(shù)為第1~5管；原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）在洗脫峰2中

獲得，收集管數(shù)為第10~15管；小清蛋白（Parvalbumin，PV）在洗脫峰1中獲

得，收集管數(shù)為第1~5管。

5.1.3樣品前處理方法的回收率

表3致敏蛋白標(biāo)品回收率(n=6)

樣品洗脫前（mg）洗脫后（mg）回收率(%)

TM0.77160.733095%

AK0.04990.047495%

5

PV0.43380.420797%

圖2DEAESepharoseF.F.分離蝦原肌球蛋白（A）、蝦精氨酸激酶（B）、魚小清蛋白（C）洗

脫曲線和SDS電泳圖（D）

結(jié)果表明，經(jīng)過DEAESepharoseF.F.洗脫的TM、AK和TM均有較高的回

收率，因此DEAESepharoseF.F.可以作為樣品預(yù)處理中致敏蛋白的純化方法（表

3）。

5.2毛細(xì)管電泳條件的選擇

5.2.1運(yùn)行緩沖液的選擇

運(yùn)行緩沖液的種類、濃度和pH可以直接影響電滲流，從而影響樣品的分離

效果。因此，運(yùn)行緩沖液的選擇至關(guān)重要。由于三種致敏蛋白均為酸性蛋白，因

此，應(yīng)采用pH7~10的緩沖體系，從而使蛋白帶負(fù)電。同時，由于毛細(xì)管的表面

也帶負(fù)電荷，能有效減少毛細(xì)管壁對蛋白的吸附。在三種堿性緩沖液體系中，硼

酸-硼砂緩沖液的分離能力優(yōu)于Tris-HCl緩沖液和磷酸緩沖液，能得到較好的峰

形和較短的遷移時間。此外，糖基化蛋白與硼酸根離子絡(luò)合產(chǎn)生帶負(fù)電的絡(luò)離子，

從而減小吸附[1]。因此本實驗首選硼酸-硼砂緩沖液作為運(yùn)行緩沖液。

5.2.2分離電壓的選擇

6

分離電壓是影響毛細(xì)管電泳分離效果的重要因素。在低電壓下，圖譜表現(xiàn)為

區(qū)帶展寬且分離效果差，適當(dāng)?shù)纳唠妷嚎梢允闺姖B流增加，峰形變銳，分析時

間縮短。但是，在高電壓下，電滲流的增大反而會導(dǎo)致區(qū)帶展寬、分辨率和靈敏

度下降[2]。為了驗證分離電壓對樣品液中致敏蛋白分離效果的影響，本實驗考察

了14~20kV分離電壓下三種致敏蛋白的分離效果。

(A)(B)

(C)

圖3不同分離電壓下蝦精氨酸激酶（A）、魚小清蛋白（B）和蝦原肌球蛋白（C）的毛細(xì)管

電泳圖譜

如圖3所示，結(jié)果表明，分離電壓為15kV時，TM和PV表現(xiàn)為分辨率較

高且分析時間較短。分離電壓為18kV時，AK表現(xiàn)為分辨率較高且分析時間較

短。

7

5.2.3運(yùn)行緩沖液濃度的選擇

緩沖溶液的濃度是影響電滲流的一個重要因素，它會直接影響電滲流的大小，

從而影響分離度和靈敏度。隨著緩沖液濃度的增加，圖譜表現(xiàn)為峰形變銳，分辨

率變大，靈敏度變高，但當(dāng)緩沖液濃度超過一定限度后，過高的鹽濃度會產(chǎn)生較

大的電流強(qiáng)度，從而產(chǎn)生過多的焦耳熱。表現(xiàn)為區(qū)帶展寬、分離度下降，靈敏度

變低[3]。為了驗證緩沖液濃度對樣品液中原肌球蛋白分離效果的影響，本實驗保

持分離電壓為最佳分離電壓不變，考察了硼酸-硼砂緩沖液濃度為20mmol/L、25

mmol/L、30mmol/L時，三種致敏蛋白的分離效果。

(A)(B)

(C)

圖4不同濃度緩沖溶液下的蝦精氨酸激酶（A）、魚小清蛋白（B）和蝦原肌球蛋白（C）的

毛細(xì)管電泳圖譜

8

如圖4所示，結(jié)果表明，隨著硼酸-硼砂緩沖液濃度的增大，兩峰間分離時

間逐漸變長，且雜峰變少，分離效果明顯。當(dāng)硼酸-硼砂緩沖液的濃度為25mmol/L

時，AK、PV和TM的分離效果均達(dá)到最佳，表現(xiàn)為峰形較銳，分析時間較短。

5.2.4運(yùn)行緩沖液pH的選擇

緩沖溶液的pH值是毛細(xì)管電泳中影響原肌球蛋白遷移時間的重要因素，它

不僅影響電滲流的大小，還會影響原肌球蛋白的電荷量。隨著緩沖pH值的增大，

圖譜表現(xiàn)為電滲流增大、分析時間縮短、分辨率增大、靈敏度變高。但是，過高

的pH值也會造成電滲流過大，從而使分辨率和靈敏度下降[4]。為了驗證緩沖液

濃度對樣品液中原肌球蛋白分離效果的影響，本實驗在保持運(yùn)行緩沖液濃度為

25mmol/L、分離電壓為最佳分離電壓的實驗條件下，考察了運(yùn)行緩沖液pH為

8.5~9.5時，三種致敏蛋白的分離效果。

(A)(B)

(C)

圖5不同pH緩沖溶液下的蝦精氨酸激酶（A）、魚小清蛋白（B）和蝦原肌球蛋白（C）的毛

9

細(xì)管電泳圖譜

如圖5所示，結(jié)果表明，當(dāng)硼酸-硼砂緩沖液的pH為9.2時，PV和TM的

圖譜表現(xiàn)為峰形變銳、分辨率變高、雜峰變少、靈敏度增大；當(dāng)硼酸-硼砂緩沖

液的pH為9.0時，AK的圖譜表現(xiàn)為峰形變銳、靈敏度增大。

綜上所述，PV和TM的最佳分離條件為分離電壓15kV、運(yùn)行緩沖液為25

mmol/L硼酸-硼砂緩沖液（pH=9.2）；AK的最佳分離條件為分離電壓18kV、運(yùn)

行緩沖液為25mmol/L硼酸-硼砂緩沖液（pH=9.0）。

六、驗證情況及結(jié)果分析

6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

用0.01MPBS（pH=7.4）精密配制TM和AK的標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、25、40、

50μg/mL，以及PV的標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、25、50、100μg/mL進(jìn)樣，在上述電泳

條件下，每個樣品重復(fù)3次，依次進(jìn)樣檢測，外標(biāo)法定量，以峰面積對濃度進(jìn)行

線性回歸，校正峰面積（A）與質(zhì)量濃度（ρ，μg/mL）具有良好線性關(guān)系。

圖6致敏蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖6所示，線性范圍為5~100μg/mL，檢出限（S/N=3）分別為1.2μg/mL

（AK）、1.1μg/mL（TM）和0.71μg/mL（PV）。

10

6.2方法重現(xiàn)性和精密度

按上述樣品預(yù)處理方法，平行處理6份樣品，每一份含蝦粉0.1g，所得樣品

液連續(xù)6次進(jìn)樣，毛細(xì)管電泳圖譜如圖7所示，分析此方法的批內(nèi)和批間差異，如

表4所示。

(A)(B)

(C)

圖7最佳條件下蝦精氨酸激酶（A）、魚小清蛋白（B）和蝦原肌球蛋白（C）的毛細(xì)管電泳

圖譜

11

表4方法的重現(xiàn)性

遷移時間批間RSD(n=6)批內(nèi)RSD(n=6)

致敏蛋白

(min)遷移時間峰面積遷移時間峰面積

AK4.16.9%4.7%6.8%6.4%

TM1.96.3%5.7%7.6%4.8%

PV2.95.6%6.3%6.8%4.5%

結(jié)果表明，經(jīng)過對被測組分的含量考察后發(fā)現(xiàn)，此方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為

4.5~6.9%。所以，此方法滿足方法學(xué)的要求。

6.4樣品分析和加標(biāo)回收

圖8鷹爪蝦（A）、中國對蝦（B）、斑節(jié)對蝦（C）、南美白對蝦（D）樣品的原肌球蛋白毛細(xì)

管電泳圖譜

12

圖9鷹爪蝦（A）、中國對蝦（B）、斑節(jié)對蝦（C）、南美白對蝦（D）樣品的精氨酸激酶毛細(xì)

管電泳圖譜

圖10草魚（A）、鯽魚（B）、黑魚（C）樣品的小清蛋白的毛細(xì)管電泳圖譜

13

按上述樣品預(yù)處理方法分別對鷹爪蝦、中國對蝦、斑節(jié)對蝦、南美白對蝦、

草魚、鯽魚和黑魚進(jìn)行處理，每種蝦所取蝦粉皆為0.2g。在上述實驗最優(yōu)化條件

下，分別對樣品溶液進(jìn)行測定，每個樣品連續(xù)進(jìn)樣檢測三次。毛細(xì)管電泳圖譜如

圖8~10所示，計算得到樣品含量如表5所示。

表5不同水生動物樣品中致敏蛋白的含量（n=3）

精氨酸激酶（AK）原肌球蛋白（TM）小清蛋白（PV）

樣品濃度濃度濃度

(μg/mL)±SD(μg/mL)±SD(μg/mL)±SD

鷹爪蝦11.60±1.4015.75±0.90—

中國對蝦13.10±1.8512.70±1.40—

斑節(jié)對蝦10.65±1.4015.15±1.40—

南美白對蝦9.80±1.8010.00±0.25—

草魚——4.10±0.58

鯽魚——9.30±0.85

黑魚——7.20±0.40

在上述所測定的四種蝦樣品溶液中，等量加入10μg/mL的致敏蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶

液，進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。實驗結(jié)果如表6所示，結(jié)果表明，其加標(biāo)回收率在

91.5%~109.5%之間，說明方法的準(zhǔn)確度較高。

表6精氨酸激酶加標(biāo)回收率測定結(jié)果

樣品本底值真實值測定值回收率

（μg/mL）（μg/mL）（μg/mL）（%）

鷹爪蝦11.6010.8011.45±1.30106.1

中國對蝦13.1011.5512.24±1.60105.7

斑節(jié)對蝦10.6510.339.45±1.5591.5

南美白對蝦9.809.9010.39±1.20104.9

表6原肌球蛋白加標(biāo)回收率測定結(jié)果

樣品本底值真實值測定值回收率

（μg/mL）（μg/mL）（μg/mL）（%）

鷹爪蝦15.7512.8712.36±0.8596.2

中國對蝦12.7011.3512.37±0.66109.5

斑節(jié)對蝦15.1512.5711.81±1.0094

南美白對蝦10.0010.0010.71±0.45107.8

14

表7小清蛋白加標(biāo)回收率測定結(jié)果

樣品本底值真實值測定值回收率

（μg/mL）（μg/mL）（μg/mL）（%）

草魚4.107.056.50±0.07592.2

鯽魚9.309.6510.10±0.95104.7

黑魚7.208.608.10±0.08893.8

6.5實驗室間驗證

本方法按照有關(guān)要求選取了有代表性的樣品進(jìn)行實驗室間驗證實驗。為驗證

此方法的穩(wěn)定性，平行處理6份蝦糜樣品，每一水平平行測定6次，采用毛細(xì)管

電泳法檢測原肌球蛋白和精氨酸激酶的含量，方法的批間RSD為4.3%~5.4%；

平行處理6份魚糜樣品，每一水平平行測定6次，采用毛細(xì)管電泳法檢測小清蛋

白的含量方法的批間RSD為3.7%~6.5%。

6.6結(jié)論

本標(biāo)準(zhǔn)建立了水生動物源典型致敏蛋白原肌球蛋白和小清蛋白的毛細(xì)管電

泳測定和確證方法。本方法參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過對實驗各項參數(shù)

優(yōu)化，找出最佳的提取和凈化條件。室內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度實驗表明，分別以鷹爪

蝦、中國對蝦、斑節(jié)對蝦、南美白對蝦為添加基質(zhì)，方法的平均回收率范圍為

92.1%~109.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在10%以內(nèi)。

七、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

7.1食物過敏

食物過敏又稱變態(tài)反應(yīng)，是指機(jī)體受到抗原刺激后，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏

淋巴細(xì)胞，當(dāng)再次接觸到同一抗原后在機(jī)體內(nèi)激活人體細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗

體應(yīng)答，由此導(dǎo)致組織損傷或機(jī)體生理機(jī)能障礙。引起食物過敏的抗原被稱為食

品過敏原，一般來說，食品過敏原為分子量介于10kDa-70kDa之間的蛋白或糖

蛋白。據(jù)報道，有8類食物經(jīng)常引起過敏反應(yīng)，占總過敏案例90％以上，它們分

別為：蛋、牛奶、魚類、甲殼類動物、花生、大豆、核果類食物及小麥。在世界

衛(wèi)生組織報告指出威脅人類健康的因素中，食物過敏排在第4位。在近年來國內(nèi)

外食品有關(guān)的警示通報中過敏原問題數(shù)量排名第2，僅次于微生物污染，成為國

際政府和公眾廣泛關(guān)注的食品安全問題之一。

15

從目前研究情況來看，避免接觸含有過敏原的食品或食物成分是降低食物過

敏發(fā)生的有效措施，而通過對食品標(biāo)簽內(nèi)容進(jìn)行適當(dāng)標(biāo)注被認(rèn)為是有效的商業(yè)措

施。國外許多國家都加強(qiáng)了對食品過敏原的標(biāo)識管理，完善了食品中過敏原管理

的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系，并于近年來開始實際運(yùn)用于食品相關(guān)行業(yè)中。歐盟

2003/89/EC指令對食品生產(chǎn)和經(jīng)銷者進(jìn)行監(jiān)管，歐盟2006/142/EC指令則列出了

14種必須明確標(biāo)注的食品過敏原。美國《2004年食物致敏原標(biāo)簽和消費(fèi)者保護(hù)法》

將牛奶、雞蛋、魚類、甲殼貝類動物、堅果、小麥、花生和大豆列為需要強(qiáng)制性

標(biāo)識的主要致敏原。與發(fā)達(dá)國家相比，我國對食品過敏原的研究和關(guān)注水平存在

較大差距，食品過敏原問題也是目前我國食品出口企業(yè)被外方通報的最主要問題。

我國食品中過敏原標(biāo)識的管理還處于起步階段，最早與食品中過敏原標(biāo)識相關(guān)的

管理標(biāo)準(zhǔn)為2008年北京奧運(yùn)會期間頒布的《奧運(yùn)會食品安全食品過敏原標(biāo)識標(biāo)

注》，并于奧運(yùn)會結(jié)束后廢止。2009年，我國為加強(qiáng)食品中過敏原的管理，頒布

了推薦性的國家標(biāo)準(zhǔn)GBT23779-2009《預(yù)包裝食品中的過敏原成分》，該標(biāo)準(zhǔn)對

過敏原進(jìn)行了定義，并列舉了8類推薦性標(biāo)識的食物過敏原。2012年，

GB7718-2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》的頒布首次正式將食品中過敏原的標(biāo)識

問題納入標(biāo)簽管理的范疇。2018年，我國新頒布了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食

品標(biāo)簽通則》，該標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定食物過敏原成分應(yīng)使用易辨識的名稱加以提示。

目前最常使用的檢測過敏原的分析方法是基于抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定

（ELISA）方法和基于DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法。但是，ELISA方

法的特異性取決于抗體的制備，這限制了其應(yīng)用范圍，并且容易存在交叉反應(yīng)或

者產(chǎn)生假陽性結(jié)果，其次，食物在加工過程中存在過敏原降解和結(jié)構(gòu)改變的現(xiàn)象，

從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。PCR方法雖然可以實現(xiàn)多種目標(biāo)物同步檢測，但是PCR方

法是通過檢測食物過敏原蛋白的特異性DNA從而測定過敏原蛋白，無法檢測

DNA尚不清楚的過敏原蛋白，并且容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。兩種方法都難以適用

于當(dāng)今各種復(fù)雜食品的檢測。因此，建立一個能直接檢測致敏蛋白的檢測方法用

于食品中的敏原的定量測定無疑是非常必要的。毛細(xì)管電泳技術(shù)集凝膠電泳和液

相色譜應(yīng)用于一身，對極性或非極性的小分子和大分子皆