GB-T微生物誘變育種技術(shù)規(guī)范征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201XGB/TXXXXX—201X

微生物誘變育種技術(shù)規(guī)范

Operationruleformicrobialmutagenesisbreeding

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局

發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

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GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

微生物誘變育種技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物誘變育種的基本要求、操作步驟。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于紫外、等離子體和化學(xué)誘變育種。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）適用于本文件。

GB15193.19食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)致突變物、致畸物和致癌物的處理方法

3術(shù)語與定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

突變mutation

由于化學(xué)或物理因素導(dǎo)致的微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生的永久性改變，突變可以遺傳。

3.2

菌種strain

用于發(fā)酵過程作為活細(xì)胞催化劑的微生物，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類。

3.3

孢子懸浮液sporesuspension

鏈霉菌或絲狀真菌的孢子均勻懸浮液。

3.4

菌絲懸浮液myceliumsuspension

無孢類真菌菌絲通過超聲波斷裂，得到的長(zhǎng)度為1-3個(gè)細(xì)胞的短菌絲懸浮液。

3.5

原生質(zhì)體懸浮液protoplastsuspension

大型真菌、霉菌等難以直接誘變的微生物的原生質(zhì)體均勻懸浮液。

3.6

誘變材料mutagenicmaterial

直接用于誘變處理的微生物。如對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液、孢子懸浮液、菌絲懸浮液或原生質(zhì)體懸浮液。

4基本要求

4.1環(huán)境

要求具有能開展基本微生物實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室或車間，配備相關(guān)水、電、氣等基礎(chǔ)設(shè)施；實(shí)驗(yàn)環(huán)境需保

持整潔。

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4.2人員

實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)熟悉基本微生物操作，在開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)前應(yīng)充分了解誘變劑存在的風(fēng)險(xiǎn)和安全操作規(guī)范，

特別是化學(xué)誘變劑存在很高的致癌風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)做好防護(hù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)按GB15193.19的處理

方法處理誘變材料。

4.5誘變材料

4.5.1誘變材料應(yīng)是單個(gè)的、分散的細(xì)胞，最好呈懸浮狀態(tài)，并且細(xì)胞核越少越好，最好是單核。

4.5.2用于誘變的菌種應(yīng)該按照菌種類型選擇合適的培養(yǎng)條件，保證菌種具有旺盛的活力。

4.5.3細(xì)菌、酵母菌菌種接種至合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，

調(diào)整菌體濃度到106-108cfu/ml，用于誘變。

4.5.4霉菌應(yīng)在固體平板或斜面上培養(yǎng)至產(chǎn)生大量孢子，用無菌生理鹽水洗脫孢子，置于無菌并盛有玻

璃珠的三角瓶中，在震蕩器上震蕩使孢子分散，要求孢子分散率在90%以上。用四層無菌擦鏡紙過濾除

掉菌絲體，得到均勻的孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為106-108cfu/ml，用

于誘變。

4.5.5有些真菌屬于無孢菌群，宜刮取平板上長(zhǎng)勢(shì)旺盛的菌絲，接入搖瓶培養(yǎng)一定時(shí)間。吸取一定量菌

液，加入裝有玻璃珠的生理鹽水中，劇烈震蕩（如吸取5ml菌液，加入裝有40~60粒玻璃珠的生理鹽水

中，劇烈震蕩1h），制成菌絲懸液用于誘變。

4.5.6孢子誘變效果不明顯或不宜獲得孢子的絲狀真菌或大型真菌宜收集新鮮培養(yǎng)的菌絲或孢子加入一

定量過濾除菌的酶液（如1%蝸牛酶和1%纖維素酶混合酶液），在30℃~37℃保溫，50rpm~100rpm搖床

旋轉(zhuǎn)酶解，定時(shí)取樣于顯微鏡下觀察原生質(zhì)體釋放情況。酶解約3h后用四層無菌擦鏡紙過濾去除未酶解

的菌絲，3500rpm離心10min，棄去上清，沉淀的原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌三次，用血球計(jì)數(shù)板在

纖維鏡下計(jì)數(shù)，用滲透壓穩(wěn)定劑調(diào)整原生質(zhì)體濃度為106-108cfu/ml，用于誘變。

4.6誘變條件選擇

4.6.1紫外誘變條件

紫外燈：紫外線誘變處理的有效波長(zhǎng)為200～300nm，最適為254nm?？蛇x擇功率有10W、15W、20W

或30W；

照射距離：10cm到30cm；

照射時(shí)間：細(xì)菌、原生質(zhì)體、鏈霉菌孢子懸浮液：0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s，酵母菌、

霉菌孢子懸浮液：0min、2min、4min、6min、8min、10min。

4.6.2常壓室溫等離子體誘變條件

照射距離：2mm；

照射功率：100W~120W；

氣體流量：10L/min；

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照射時(shí)間：細(xì)菌為30s、1min、2min、3min、4min、5min，真菌為1min、2min、3min、4min、5

min、6min。

4.6.3化學(xué)誘變條件

化學(xué)誘變需優(yōu)化的條件包括誘變劑濃度和處理時(shí)間。誘變劑配制方法參見附錄A，不同微生物適宜

的誘變劑濃度及處理時(shí)間參見附錄B。

4.7致死率的檢測(cè)

致死率按式（1）計(jì)算：

……………（1）

?????

?式?中=：??

LR——致死率（%）

CC——陰性對(duì)照平板菌落數(shù)

CT——試驗(yàn)組平板菌落數(shù)

宜選擇致死率為70%-90%的誘變條件作為最適條件。

5操作步驟

5.1紫外誘變操作程序

在紅燈或避光條件下進(jìn)行。提前20min~30min開紫外燈，以穩(wěn)定光波。取誘變材料置于帶攪拌子的

無菌平皿中，開蓋置于磁力攪拌器上在紫外光下照射一定時(shí)間，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。取相同的誘變材

料作為陰性對(duì)照，不照射紫外光。處理完成后的材料和陰性對(duì)照分別稀釋到104cfu/ml、105cfu/ml、106

cfu/ml（以誘變材料濃度為初始值計(jì)算稀釋倍數(shù)），吸取50～100μl涂布固體平板，避光培養(yǎng)至產(chǎn)生單

菌落，選擇每塊平板菌落數(shù)為102cfu數(shù)量級(jí)的平板統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算致死率。為了避免光修復(fù)，誘變后

的所有實(shí)驗(yàn)步驟在暗室紅光燈下操作。

5.2常壓室溫等離子體誘變操作程序

用移液槍吸取10ul誘變材料滴到無菌的小鐵片中央，再將鐵片置于帶蓋的無菌平皿中，每次用無菌

鑷子取一片滴有誘變材料的鐵片置于常壓室溫等離子體下照射一定時(shí)間，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。取相同

的誘變材料作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照不照射等離子體。照射結(jié)束后，立即把照射過的小鐵片和陰性對(duì)照

鐵片直接放入準(zhǔn)備好的預(yù)先加入1ml培養(yǎng)基的無菌EP管中，利用旋渦混合器，使菌株掉落到培養(yǎng)基中。

這一過程相當(dāng)于菌液已經(jīng)被稀釋100倍了。處理完成后的材料和陰性對(duì)照稀釋到104cfu/ml、105cfu/ml、

106cfu/ml（以誘變材料濃度為初始值計(jì)算稀釋倍數(shù)），吸取50～100μl涂布固體平板，培養(yǎng)至產(chǎn)生菌落，

選擇每塊平板菌落數(shù)為102cfu數(shù)量級(jí)的平板計(jì)算菌落數(shù)，計(jì)算致死率。

5.3化學(xué)誘變操作程序

將化學(xué)誘變劑，配制成呈一定濃度梯度的工作液。取誘變材料分別加入不同濃度梯度的誘變劑工作

液，混勻后反應(yīng)不同時(shí)間，再加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。用無菌去離子水洗滌誘變處理過的菌體。陰性

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對(duì)照不加入化學(xué)誘變劑，而是加入等量無菌水代替。每個(gè)誘變劑量設(shè)三個(gè)重復(fù)，處理完成后的材料和陰

性對(duì)照稀釋到104cfu/ml、105cfu/ml、106cfu/ml（以誘變材料濃度為初始值計(jì)算稀釋倍數(shù)），吸取50～

100μl涂布固體平板，培養(yǎng)至產(chǎn)生菌落，選擇每塊平板菌落數(shù)為102cfu數(shù)量級(jí)的平板統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算

致死率。

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附錄A

（資料性附錄）

常用化學(xué)誘變劑配制方法

B.1亞硝基胍（NTG）

pH6.0磷酸緩沖液：分別配制0.2M的Na2HP04·2H20溶液、0.2M的NaH2P04·2H20溶液，前者取

出12.3ml，后者取出87.7mL，兩者混合即得pH6.0的磷酸緩沖液。

1mg/ml亞硝基胍溶液:稱取50mg亞硝基胍，用5ml丙酮溶解，4℃保存。用之前向其中加入45ml

pH6.0磷酸緩沖液，振蕩使其充分溶解，過濾除菌。

誘變終止劑：0.07mol/LpH8.6磷酸氫二鈉緩沖液：取磷酸二氫鈉2.507g,溶于100ml無菌水中，

過濾除菌。

B.2亞硝酸鈉（NIT）

pH4.5醋酸緩沖液：稱取醋酸鈉18g，冰醋酸9.8ml于1L燒杯中，加入少量蒸餾水溶解，移入1000ml

容量瓶中定溶，充分混勻過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

0.1mol/L亞硝酸鈉溶液：取亞銷酸鈉0.69g，溶于100ml無菌水中，過濾除菌。使用時(shí)與pH4.5

的醋酸緩沖液以1：2的體積比混合后使用。

誘變終止劑25%的Na2S2O3：稱取4gNa2S2O3·5H2O，溶解于6ml蒸餾水中。放置在4℃冰箱中備

用，使用時(shí)過濾滅菌。與誘變液的體積比為1:1。

B.3硫酸二乙酯（DES）

硫酸二乙酯不溶于水，溶于乙醇或乙醚半衰期短，在30℃條件下半衰期為1h，所以需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

取0.5mlDES溶解于4.5ml無水乙醇中，配制成10%的儲(chǔ)備液，過濾除菌。

B.4甲基磺酸乙酯（EMS）

pH7.0的磷酸緩沖液：稱取K2HPO4·3H2O9.39g與KH2PO43.5g，加蒸餾水定容至1000ml，過濾，

121℃，滅菌15min或115℃滅菌30min。

準(zhǔn)確稱取5.408gEMS粉末于10mL容量瓶中，先加入6mLpH7.0的磷酸緩沖液溶解，后定容至

10mL，配成5.0mol/L的母液，4℃保藏，臨用前過濾除菌。

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附錄C

（資料性附錄）

常用化學(xué)誘變劑誘工作濃度及致死率

C.1常用化學(xué)誘變劑工作濃度及致死率

表C.1常用化學(xué)誘變劑工作濃度及致死率

誘變劑工作濃度誘變菌種誘變時(shí)間致死率誘變溫度

亞硝酸鈉0.05mol/L產(chǎn)小檗堿內(nèi)30min76.6%27℃

（NIT）生真菌菌絲

懸液

0.025mol/L綠色木霉孢10min75.4%室溫

子懸液

2mg/ml茂源鏈霉菌30min99.9%30℃

孢子懸液

0.025mol/L粘帚霉菌孢4min89.8%

子懸液

0.025mol/L白腐真菌孢10min~20min85%~95%25℃~26℃

子懸液

0.05mol/L平貝母內(nèi)生20min85.7%室溫

真菌菌絲懸

液

0.025mol/L蠟狀芽孢桿25min78.56%26℃

菌菌懸液

亞硝基胍2mg/ml茂源鏈霉菌20min99.7%30℃

（NTG）孢子懸液

0.5mg/ml蠟狀芽孢桿40min25.93%28℃

菌菌懸液

0.4mg/ml枯草芽孢桿30min73.47%30℃

菌菌懸液

1mg/ml植物乳桿菌40min76.5430℃

菌懸液

1mg/ml放線菌孢子45min85.36%

懸液

硫酸二乙酯1%粗壯脈紋抱60min＞99%30℃

（DES）菌抱子懸液

1%綠色木霉孢40min80.2%30℃

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