外植體褐變及解決措施

第第頁外植體褐變及解決措施外植體褐變及其解決措施植物組織培育過程中，褐變問題普遍存在，與菌類污染和玻璃化現(xiàn)象并稱為植物組織培育的三大難題。針對褐變難題，本文結(jié)合相關(guān)資料，對影響褐變的因素作了全面分析，并針對這些因素提出了相應(yīng)的解決措施。

褐變是指外植體在培育過程中，自身組織向表面培育基釋放褐色物質(zhì)，以致培育基漸漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。

一、褐變產(chǎn)生的機理

1.非酶促褐變

非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。徐振彪等將生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培育基中，組織四周尤其是接觸培育基部分發(fā)生褐變，但培育基中沒有看到擴散的褐化物質(zhì)。當溫度上升時繼代保存時間過長，也會發(fā)生此類現(xiàn)象。但這種褐變假設(shè)采用適當措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了。

2.酶促褐變

目前認為植物組織培育中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培育材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的。酶促褐變猶如一般的酶促反應(yīng)，其發(fā)生需要具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培育和繼代培育過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，說明PPO活性的高低是引起培育材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸〔包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等〕，苯丙烷衍生物〔包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等〕，第三類是黃烷衍生物〔包括花青素、黃酮、蕓香苷等〕，但并非全部的酚類物質(zhì)都是PPO的底物。

在正常發(fā)育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發(fā)生褐變，是由于在正常的組織細胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細胞的液泡內(nèi)，而PPO那么分布在各種質(zhì)體或細胞質(zhì)中，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和破壞時，那么為酶制造了與PPO接觸的條件，在氧存在的狀況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，最末形成黑褐色物質(zhì)，從

而引起褐變。

二、褐變產(chǎn)生的影響因素

1.植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決斷了不同的褐化程度。在組織培育中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質(zhì)含量的多少及多酚氧化酶〔PPO〕活性的差異有關(guān)。木本植物和單寧含量高的植物都簡單褐變，一般木本植物比草本植物更簡單發(fā)生很扁現(xiàn)象，如鵝掌楸、油茶等，褐變現(xiàn)象特別明顯。

2.材料的年齡和生理狀態(tài)很多試驗說明，幼齡材料酚類物質(zhì)含量少，褐變現(xiàn)象較輕；成齡材料酚類物質(zhì)含量較多，簡單發(fā)生褐變。

3.取材時間和部位由于植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生長季節(jié)不相同，一般在生長季節(jié)，酚類物質(zhì)含量增加，多酚氧化酶的活性也漸漸加強，褐變現(xiàn)象回嚴峻許多，因而一般都選在早春或秋季取材。同一外植體不同取材部位，褐變程度不同，如蘋果、石竹、菊花，選擇頂芽比側(cè)芽，褐變程度低，更易成活。王異星用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗說明，莖最簡單誘導出愈傷組織，培育2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。因此，取材時應(yīng)選擇褐變程度輕的部位。

4.外植體的大小肯定程度上，外植體材料越小越簡單發(fā)生褐變，相對較大的材料涌現(xiàn)褐變程度較輕。

5.外植體材料受傷程度外植體材料受傷會加劇褐變的發(fā)生。取材時，應(yīng)用銳利的器械，盡可能減削受傷面積，以減輕褐變的發(fā)生。此外，外植體表面消毒時所用的化學消毒劑及較長的滅菌時間也會加重褐變現(xiàn)象。

6.培育條件溫度過高或光照過強，均可加速被培育組織的褐變。

7.培育基成分培育基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水同等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系。

三、防止外植體產(chǎn)生褐變的對策

適當外植體的選擇

取材時應(yīng)留意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴峻。冬季的芽不易生

長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。

對外植體的處理

通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下：外植體經(jīng)流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培育基中培育5-7天，使組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培育基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培育基中。假設(shè)仍有酚類物質(zhì)滲出，3-5天后再轉(zhuǎn)移培育基2-3次，當外植體的切口愈合后，酚類物質(zhì)減削，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。何瓊英等用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導率。

選擇適當?shù)呐嘤?/p>

1〕適當?shù)臒o機鹽濃度張妙霞等在柿樹組織培育防止褐變所進行的試驗中，4種培育基的無機鹽以改良MS〔大量元素減半〕和1/2MS的效果最好，MS的效果較差，結(jié)果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選說明，隨NaCl濃度上升，褐變現(xiàn)象加重。

2〕適當和適量的激素王異星在荔枝的組織培育過程中，培育基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產(chǎn)生褐變。培育基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。

3〕培育基的硬度在肯定范圍內(nèi)，瓊脂用量大，培育基硬度大，褐變率低，這可能是培育基的硬度影響了酚類物質(zhì)的擴散速度的緣故。

4〕培育基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低，而運用硬度較高的自來水，褐變嚴峻，甚至會涌現(xiàn)褐變死亡。這可能是配制培育基的水轉(zhuǎn)變了培育基中無機鹽的濃度，間接地影響了植物外植體的褐變。

5〕培育基的pH值在水稻體細胞培育中，pH值為4.5-5.0時MS液體培育基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴峻褐變。一般來說，酸性環(huán)境〔pH值為4.5-5.0〕不利于褐變過程的發(fā)生。

4.培育條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類

物質(zhì)的氧化，從而加速被培育的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其緣由是環(huán)境中的CO2向細胞內(nèi)擴散，細胞內(nèi)CO32-增多，CO32-與細胞膜上的Ca2+結(jié)合，導致內(nèi)膜系統(tǒng)瓦解，酚類物質(zhì)與PPO相互接觸，產(chǎn)生褐變。因此，初期培育要在黑暗或弱光下進行。

5.添加褐變抑制劑和吸附劑

褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培育基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應(yīng)用中應(yīng)留意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可不受限制。在水稻細胞的培育基中，添加植酸〔PA〕，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結(jié)合，從而降低了其活力。陳學森等在對植酸在銀杏組織培育中應(yīng)用的討論中也證明了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮〔PVP〕?；钚蕴渴且环N吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培育基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培育物在培育過程中分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培育物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培育基中加入1-4g/L的活性炭。在運用過程中應(yīng)留意，盡量用最低濃度的活性炭來對抗褐變的產(chǎn)生，由于活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時，也會吸附培育基中的其他成分，對外植體的誘導分化會產(chǎn)生肯定的負面影響。而聚乙烯吡咯烷酮〔PVP〕是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質(zhì)和細胞器的愛護劑，可用于防止褐變。

6.進行細胞篩選和多次轉(zhuǎn)移

在組織培育過程中，常常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應(yīng)馬上轉(zhuǎn)移到新鮮培育基中，能減輕酚類物質(zhì)對培育物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。

外植體褐變及其解決措施植物組織培育過程中，褐變問題普遍存在，與菌類污染和玻璃化現(xiàn)象并稱為植物組織培育的三大難題。針對褐變難題，本文結(jié)合相關(guān)資料，對影響褐變的因素作了全面分析，并針對這些因素提出了相應(yīng)的解決措施。

褐變是指外植體在培育過程中，自身組織向表面培育基釋放褐色物質(zhì)，以致培育基漸漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。

一、褐變產(chǎn)生的機理

1.非酶促褐變

非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。徐振彪等將生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培育基中，組織四周尤其是接觸培育基部分發(fā)生褐變，但培育基中沒有看到擴散的褐化物質(zhì)。當溫度上升時繼代保存時間過長，也會發(fā)生此類現(xiàn)象。但這種褐變假設(shè)采用適當措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了。

2.酶促褐變

目前認為植物組織培育中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培育材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的。酶促褐變猶如一般的酶促反應(yīng)，其發(fā)生需要具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培育和繼代培育過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，說明PPO活性的高低是引起培育材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸〔包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等〕，苯丙烷衍生物〔包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等〕，第三類是黃烷衍生物〔包括花青素、