原料乳與乳制品中三聚氰胺檢驗(yàn)方法

GB/T22388-原料乳和乳制品中三聚氛胺檢測(cè)方法-10-07公布-10-07實(shí)施中國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)公布序言本標(biāo)準(zhǔn)包含三個(gè)方法:第一法高效液相色譜法,第二法液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法,第三法氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)使用方法,檢測(cè)時(shí),應(yīng)依據(jù)檢測(cè)對(duì)象及其限量要求,選擇和其相適應(yīng)檢測(cè)方法,,本標(biāo)準(zhǔn)附錄氰為資科性開(kāi)錄,,本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)食品安全應(yīng)急標(biāo)準(zhǔn)化工作組、全國(guó)質(zhì)量監(jiān)管關(guān)鍵產(chǎn)品檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口,,本標(biāo)準(zhǔn)第一法起草單位:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心、國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心、北京市疾病預(yù)防控制中心、國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、漸江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)管檢演研究院、國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣州),,本標(biāo)準(zhǔn)第一法關(guān)鍵起草人:宋書(shū)鋒、魯杰、安娟、楊大進(jìn)、李淑娟、張晶、劉艷琴、楊紅梅、楊金寶、鄂來(lái)明、廖上富、陳小珍、蔡依軍、郭新東、吳玉空,,本標(biāo)準(zhǔn)第二法起草單位:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、北京市疾病預(yù)防控制中心、國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心、中國(guó)江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局,,本標(biāo)準(zhǔn)第二法關(guān)鍵起草人:彭濤、吳永寧、邵兵、王浩、李曉娟、郭啟雷、苗虹、趙云峰、丁濤、李立、蔣原,,本標(biāo)準(zhǔn)第三法起草單位:上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院、國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,,本標(biāo)準(zhǔn)第三法關(guān)鍵起草人:巢強(qiáng)國(guó)、常宇文、雷濤、陳冬東、趙玉琪、周通斌、種同娜、葛宇、曹程明、張輝、麥成華、曹紅,原料乳和乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了原料乳、乳制品和含乳制品中三聚氰胺三種測(cè)定方法,即高效液相色譜法(HPLC法)、液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS法)和氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)使用方法[包含氣相色譜一質(zhì)譜法(GC-MS法),氣相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法(GC-MS/MS法)]。本標(biāo)準(zhǔn)適適用于原料乳、乳制品和含乳制品中三聚氰胺定量測(cè)定;液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法、氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)使用方法(包含氣相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法)同時(shí)適適用于原料乳、乳制品和含乳制品中三聚氰胺定性確證。本標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜法定量限為2mg/kg,液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法定量限為0.01mg/kg,氣相色譜一質(zhì)譜法定量限為0.05mg/kg(其中氣相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法定量限為0.005mg/kg)。規(guī)范性引用文件下列文件中條款經(jīng)過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)條款。通常注日期引用文件,其隨即全部修改單(不包含勘誤內(nèi)容)或修訂版均不適適用于本標(biāo)準(zhǔn),然而,激勵(lì)依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議各方研究是否可使用這些文件最新版本。通常不注日期引用文件,其最新版本適適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682分析試驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法(GB/T6682-,IS03696:1987,M0D)第二法液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LCMS/MS法)原理試樣用三氯乙酸溶液提取,經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化后,用液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定和確證，外標(biāo)法定量。試劑和材料除非另有說(shuō)明,全部試劑均為分析純,水為GB/T6682要求一級(jí)水。乙酸。乙酸銨。乙酸銨溶液(10mmol/L)：正確稱取0.772g乙酸銨于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。甲醇:色譜純。乙腈:色譜純。氨水：含量為25%~28%。三氯乙酸。檸檬酸。辛烷磺酸鈉：色譜純。甲醇水溶液：正確量取50mL甲醇和50mL水,，混勻后備用。三氯乙酸溶液(1%)：正確稱取10g三氯乙酸于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混勻后備用。氨化甲醇溶液(5%):正確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用。離子對(duì)試劑緩沖液:正確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉,加人約980mL水溶解,調(diào)整pH至3.0后,定容至1L備用。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品:CAS108-78-01,純度大于99.0%。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液:正確稱取100mg(正確到0.1mg)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中,用甲醇水溶液(3.2.7)溶解并定容至刻度,配制成濃度為1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液,于4℃避光保留。陽(yáng)離子交換固相萃取柱:混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱,基質(zhì)為苯磺酸化聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物,填料質(zhì)量為60mg,體積為3mnL,或相當(dāng)者。使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化。定性濾紙。海砂:化學(xué)純,粒度0.65mm~0.85mm,二氧化硅(S02)含量為99%。微孔濾膜:0.2Hm,有機(jī)相。氮?dú)?純度大于等于99.999%。儀器設(shè)備液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）儀：配有電噴霧離子源（ESI）。分析天平:感量為0.0001g和0.01g。離心機(jī):轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。超聲波水浴。固相萃取裝置。氮?dú)獯蹈蓛x。渦旋混合器。具塞塑料離心管:50mL研缽。樣品處理提取液態(tài)奶、奶粉、酸奶冰淇淋和奶糖等稱取1g(正確至0.01g)試樣于50mL具塞塑料離心管中,加人8mL三氯乙酸溶液(2.2.11)和2mL乙腈,超聲提取10min,再振蕩提取10min后,以不低于4000r/min離心10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕濾紙過(guò)濾后,做待凈化液。奶酪、奶油和巧克力等稱取1g(正確至0.01g)試樣于研缽中,加人適量海砂(試樣質(zhì)量4倍~6倍)研磨成干粉狀,轉(zhuǎn)移至50mL具塞塑料離心管中,加入8mL三氯乙酸溶液(2.2.11）分?jǐn)?shù)次清洗研缽,清洗液轉(zhuǎn)入離心管中,再加入2mL乙腈,余下操作同2.4.1.1中“超聲提取10min,……做待凈化液”。注:若樣品中脂肪含量較高,能夠用三氯乙酸溶液飽和正己烷液液分配除脂后再用SPE柱凈化。凈化將2.4.1中待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱(3.2.13)中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌抽至近干后,用6mL氨化甲醇溶液洗脫。整個(gè)固相萃取過(guò)程流速不超出1mL/min。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈?殘留物(相當(dāng)于1g試樣)用1mL流動(dòng)相定容,渦旋混合1min,過(guò)微孔濾膜后,供LC-MS/MS測(cè)定。液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定LC參考條件色譜柱:強(qiáng)陽(yáng)離子交換和反相C18混合填料,混合百分比(1:4),150mm×2.0mm[內(nèi)徑(i.d.)]流動(dòng)相:等體積乙酸銨溶液和乙腈充足混合,用乙酸調(diào)整至pH=3.0后備用。進(jìn)樣量:10L柱溫:40℃。流速:0.2mL/minMS/MS參考條件電離方法:電噴霧電離,正離子。離子噴霧電壓:4kV。霧化氣:氮?dú)?2.815kg/cm2(40psi)。干燥氣:氮?dú)?流速10L/min,溫度350℃。碰撞氣:氮?dú)?。分辨?Q1(單位)Q3(單位)掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),母離子m/z127,定量子離子m/z85,定性子離子m/z68停留時(shí)間:0.3s。裂解電壓:100V。碰撞能量:m/z127>85為20V,m/z127>68為35V。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取空白樣品根據(jù)4.4處理。用所得樣品溶液將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液(3.2.12)逐層稀釋得到濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5ug/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè),以定量子離子峰面積濃度作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。基質(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺樣品LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)量色譜圖參見(jiàn)附錄A中圖A.2。定量測(cè)定待測(cè)樣液中三聚氰胺響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi),超出線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。定性判定根據(jù)上述條件測(cè)定試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,假如試樣中質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一致(改變范圍在士2.5%之內(nèi));樣品中目標(biāo)化合物兩個(gè)子離子相對(duì)豐度和濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)豐度一致,相對(duì)豐度偏差不超出表1要求,則可判定樣品中存在三聚氰胺。表1定性離子相對(duì)豐度最大許可偏差相對(duì)離子豐度＞50%＞20%至50%＞10%至20%≤10許可相對(duì)偏差±20%±25%±30%±50%結(jié)果計(jì)算試樣中三聚氰胺含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式(1)計(jì)算取得:式中:X—試樣中三聚氰胺含量,單位為毫克每千克(mg/kg);A—樣液中三聚氰胺峰面積c-—標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);V---樣液最終定容體積,單位為毫升(mL);As---標(biāo)準(zhǔn)溶液中