原料乳與乳制品中三聚氰胺檢驗方法

GB/T22388-原料乳和乳制品中三聚氛胺檢測方法-10-07公布-10-07實施中國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局中國國家標準化管理委員會公布序言本標準包含三個方法:第一法高效液相色譜法,第二法液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法,第三法氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)使用方法,檢測時,應依據(jù)檢測對象及其限量要求,選擇和其相適應檢測方法,,本標準附錄氰為資科性開錄,,本標準由全國食品安全應急標準化工作組、全國質(zhì)量監(jiān)管關(guān)鍵產(chǎn)品檢驗方法標準化技術(shù)委員會提出并歸口,,本標準第一法起草單位:中國檢驗檢疫科學研究院、中國疾病預防控制中心、國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心、北京市疾病預防控制中心、國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、漸江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)管檢演研究院、國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(廣州),,本標準第一法關(guān)鍵起草人:宋書鋒、魯杰、安娟、楊大進、李淑娟、張晶、劉艷琴、楊紅梅、楊金寶、鄂來明、廖上富、陳小珍、蔡依軍、郭新東、吳玉空,,本標準第二法起草單位:中國檢驗檢疫科學研究院、北京市疾病預防控制中心、國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心、中國疾病預防控制中心、中國江蘇出入境檢驗檢疫局,,本標準第二法關(guān)鍵起草人:彭濤、吳永寧、邵兵、王浩、李曉娟、郭啟雷、苗虹、趙云峰、丁濤、李立、蔣原,,本標準第三法起草單位:上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院、國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心、中國檢驗檢疫科學研究院,,本標準第三法關(guān)鍵起草人:巢強國、常宇文、雷濤、陳冬東、趙玉琪、周通斌、種同娜、葛宇、曹程明、張輝、麥成華、曹紅,原料乳和乳制品中三聚氰胺檢測方法范圍本標準規(guī)定了原料乳、乳制品和含乳制品中三聚氰胺三種測定方法,即高效液相色譜法(HPLC法)、液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS法)和氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)使用方法[包含氣相色譜一質(zhì)譜法(GC-MS法),氣相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法(GC-MS/MS法)]。本標準適適用于原料乳、乳制品和含乳制品中三聚氰胺定量測定;液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法、氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)使用方法(包含氣相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法)同時適適用于原料乳、乳制品和含乳制品中三聚氰胺定性確證。本標準高效液相色譜法定量限為2mg/kg,液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法定量限為0.01mg/kg,氣相色譜一質(zhì)譜法定量限為0.05mg/kg(其中氣相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法定量限為0.005mg/kg)。規(guī)范性引用文件下列文件中條款經(jīng)過本標準引用而成為本標準條款。通常注日期引用文件,其隨即全部修改單(不包含勘誤內(nèi)容)或修訂版均不適適用于本標準,然而,激勵依據(jù)本標準達成協(xié)議各方研究是否可使用這些文件最新版本。通常不注日期引用文件,其最新版本適適用于本標準。GB/T6682分析試驗室用水規(guī)格和試驗方法(GB/T6682-,IS03696:1987,M0D)第二法液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LCMS/MS法)原理試樣用三氯乙酸溶液提取,經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后,用液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定和確證，外標法定量。試劑和材料除非另有說明,全部試劑均為分析純,水為GB/T6682要求一級水。乙酸。乙酸銨。乙酸銨溶液(10mmol/L)：正確稱取0.772g乙酸銨于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。甲醇:色譜純。乙腈:色譜純。氨水：含量為25%~28%。三氯乙酸。檸檬酸。辛烷磺酸鈉：色譜純。甲醇水溶液：正確量取50mL甲醇和50mL水,，混勻后備用。三氯乙酸溶液(1%)：正確稱取10g三氯乙酸于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混勻后備用。氨化甲醇溶液(5%):正確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用。離子對試劑緩沖液:正確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉,加人約980mL水溶解,調(diào)整pH至3.0后,定容至1L備用。三聚氰胺標準品:CAS108-78-01,純度大于99.0%。三聚氰胺標準貯備液:正確稱取100mg(正確到0.1mg)三聚氰胺標準品于100mL容量瓶中,用甲醇水溶液(3.2.7)溶解并定容至刻度,配制成濃度為1mg/mL標準貯備液,于4℃避光保留。陽離子交換固相萃取柱:混合型陽離子交換固相萃取柱,基質(zhì)為苯磺酸化聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物,填料質(zhì)量為60mg,體積為3mnL,或相當者。使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化。定性濾紙。海砂:化學純,粒度0.65mm~0.85mm,二氧化硅(S02)含量為99%。微孔濾膜:0.2Hm,有機相。氮氣:純度大于等于99.999%。儀器設(shè)備液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）儀：配有電噴霧離子源（ESI）。分析天平:感量為0.0001g和0.01g。離心機:轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。超聲波水浴。固相萃取裝置。氮氣吹干儀。渦旋混合器。具塞塑料離心管:50mL研缽。樣品處理提取液態(tài)奶、奶粉、酸奶冰淇淋和奶糖等稱取1g(正確至0.01g)試樣于50mL具塞塑料離心管中,加人8mL三氯乙酸溶液(2.2.11)和2mL乙腈,超聲提取10min,再振蕩提取10min后,以不低于4000r/min離心10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕濾紙過濾后,做待凈化液。奶酪、奶油和巧克力等稱取1g(正確至0.01g)試樣于研缽中,加人適量海砂(試樣質(zhì)量4倍~6倍)研磨成干粉狀,轉(zhuǎn)移至50mL具塞塑料離心管中,加入8mL三氯乙酸溶液(2.2.11）分數(shù)次清洗研缽,清洗液轉(zhuǎn)入離心管中,再加入2mL乙腈,余下操作同2.4.1.1中“超聲提取10min,……做待凈化液”。注:若樣品中脂肪含量較高,能夠用三氯乙酸溶液飽和正己烷液液分配除脂后再用SPE柱凈化。凈化將2.4.1中待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱(3.2.13)中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌抽至近干后,用6mL氨化甲醇溶液洗脫。整個固相萃取過程流速不超出1mL/min。洗脫液于50℃下用氮氣吹干,殘留物(相當于1g試樣)用1mL流動相定容,渦旋混合1min,過微孔濾膜后,供LC-MS/MS測定。液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜測定LC參考條件色譜柱:強陽離子交換和反相C18混合填料,混合百分比(1:4),150mm×2.0mm[內(nèi)徑(i.d.)]流動相:等體積乙酸銨溶液和乙腈充足混合,用乙酸調(diào)整至pH=3.0后備用。進樣量:10L柱溫:40℃。流速:0.2mL/minMS/MS參考條件電離方法:電噴霧電離,正離子。離子噴霧電壓:4kV。霧化氣:氮氣,2.815kg/cm2(40psi)。干燥氣:氮氣,流速10L/min,溫度350℃。碰撞氣:氮氣。分辨率:Q1(單位)Q3(單位)掃描模式:多反應監(jiān)測(MRM),母離子m/z127,定量子離子m/z85,定性子離子m/z68停留時間:0.3s。裂解電壓:100V。碰撞能量:m/z127>85為20V,m/z127>68為35V。標準曲線繪制取空白樣品根據(jù)4.4處理。用所得樣品溶液將三聚氰胺標準貯備液(3.2.12)逐層稀釋得到濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5ug/mL標準工作液濃度由低到高進樣檢測,以定量子離子峰面積濃度作圖,得到標準曲線回歸方程?；|(zhì)匹配加標三聚氰胺樣品LC-MS/MS多反應監(jiān)測質(zhì)量色譜圖參見附錄A中圖A.2。定量測定待測樣液中三聚氰胺響應值應在標準曲線線性范圍內(nèi),超出線性范圍則應稀釋后再進樣分析。定性判定根據(jù)上述條件測定試樣和標準工作溶液,假如試樣中質(zhì)量色譜峰保留時間和標準工作溶液一致(改變范圍在士2.5%之內(nèi));樣品中目標化合物兩個子離子相對豐度和濃度相當標準溶液相對豐度一致,相對豐度偏差不超出表1要求,則可判定樣品中存在三聚氰胺。表1定性離子相對豐度最大許可偏差相對離子豐度＞50%＞20%至50%＞10%至20%≤10許可相對偏差±20%±25%±30%±50%結(jié)果計算試樣中三聚氰胺含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式(1)計算取得:式中:X—試樣中三聚氰胺含量,單位為毫克每千克(mg/kg);A—樣液中三聚氰胺峰面積c-—標準溶液中三聚氰胺濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);V---樣液最終定容體積,單位為毫升(mL);As---標準溶液中