抗藥抗體免疫原性分析方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則(中文版)

抗藥抗體免疫原性解析方法學(xué)考據(jù)指導(dǎo)原則大綱：幾乎全部的生物制藥產(chǎn)品都會(huì)引起必定的抗藥抗體〔anti-drugantiboyADA〕反響，抗藥抗體反響可能會(huì)降低藥物療效或以致嚴(yán)峻的不良反響。在人體內(nèi)，抗藥抗體尋常不會(huì)引起明顯的臨床反響。但是關(guān)于某些治療性蛋白質(zhì)，抗藥抗體反響能引起各種臨床的不良反響，包括平易大事及嚴(yán)峻不良大事。臨床前爭(zhēng)論表示，抗藥抗體能對(duì)藥物暴露、藥物毒性作用、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)等造成影響。因此治療性蛋白質(zhì)的免疫原性引起了臨床醫(yī)生、藥企及看管機(jī)構(gòu)的留意。為了評(píng)估生物藥物分子的免疫原性，以及將試驗(yàn)結(jié)果與臨床大事聯(lián)系起來(lái)，在臨床前爭(zhēng)論和臨床爭(zhēng)論中，很有必要開發(fā)牢靠的能夠有效評(píng)估抗藥抗體反響的試驗(yàn)方法。這里方法學(xué)考據(jù)顯得特別重要，并且方法學(xué)考據(jù)是藥物上市申請(qǐng)必不能少的?，F(xiàn)行的看管文件關(guān)于免疫解析方法的考據(jù)的指導(dǎo)相當(dāng)有限，特別是缺乏相關(guān)免疫原性解析方法的考據(jù)的指導(dǎo)。因此，本文抗衡藥抗體免疫解析方法的考據(jù)供給科學(xué)的建議。在現(xiàn)有的關(guān)于生物解析的標(biāo)準(zhǔn)性文件的根底上參與獨(dú)到的性能考據(jù)。筆者建議承受試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法進(jìn)展免疫解析的方法學(xué)考據(jù)。這些建議被視為最正確的例子，旨在促進(jìn)整個(gè)醫(yī)藥行業(yè)形成一個(gè)更加全都的抗體檢測(cè)方法。簡(jiǎn)介：生物制藥產(chǎn)品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸，一般經(jīng)過(guò)人細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌進(jìn)展表達(dá)，比老例的小分子藥物更大〔一般大于1~3KD〕。由于以上特點(diǎn)，生物制藥產(chǎn)品引起免疫反響的潛力更大。生物制藥的免疫原性與產(chǎn)品的內(nèi)在因素〔種屬特異性表位、外源性、糖基化程度、聚合或變性程度、雜質(zhì)和制劑〕、外在因素〔給藥路子、慢性或急性給藥、藥代動(dòng)力學(xué)及內(nèi)源性當(dāng)量〕、患者因素〔自己免疫性疾病、免疫把握、和取代療法〕相關(guān)?？顾幙贵w反響可能會(huì)以致嚴(yán)峻的臨床病癥，包括過(guò)敏、自己免疫和不一樣的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)〔比方，藥物中和、生物分布特別和藥物除去率增加等均可能會(huì)使藥物的的療效發(fā)生轉(zhuǎn)變〕。藥物引起的免疫反響是藥物安全性和有效性的重要指標(biāo)，這也是看管機(jī)構(gòu)、生產(chǎn)企業(yè)、臨床醫(yī)生和患者共同關(guān)注的。因此，美國(guó)食品藥品督查治理局以及歐盟、日本、加拿大、澳大利亞等國(guó)家的看管機(jī)構(gòu)均要求經(jīng)過(guò)藥理學(xué)或毒理學(xué)相關(guān)的方法抗衡藥抗體進(jìn)展評(píng)估。免疫原性與臨床病癥之間的相關(guān)性的爭(zhēng)論依靠于臨床前爭(zhēng)論和臨床爭(zhēng)論中關(guān)于抗藥抗體的客觀檢測(cè)和表征。所免得疫原性生物解析方法在用于檢測(cè)爭(zhēng)論樣本從前應(yīng)進(jìn)展適宜的開發(fā)及考據(jù)。已有初版物供給了關(guān)于抗藥抗體檢測(cè)和表征的策略、方法開發(fā)及優(yōu)化等方面的指南。方法學(xué)考據(jù)是對(duì)解析方法的談?wù)?，?jīng)過(guò)特定的試驗(yàn)室方法表示承受的解析方法適用于相應(yīng)的檢測(cè)要求。具體到抗藥抗體的檢測(cè)方法，考據(jù)就是指證明該方法能牢靠的〔比方全都性和重復(fù)性〕在簡(jiǎn)潔的生物基質(zhì)〔血清或血漿〕中檢測(cè)出低量的藥物特異性抗體。方法學(xué)考據(jù)應(yīng)當(dāng)經(jīng)過(guò)起初爭(zhēng)論階段和爭(zhēng)論階段兩個(gè)階段進(jìn)展，起初爭(zhēng)論階段是指在解析樣品從前的工作，爭(zhēng)論階段是指樣品的解析工作，起初爭(zhēng)論階段和爭(zhēng)論階段關(guān)于表示解析方法的有效性和可控性同樣重要。本文主要介紹抗藥抗體免疫解析方法考據(jù)的主要性能特點(diǎn)，介紹方法學(xué)考據(jù)相關(guān)的方法和措施。本指南應(yīng)當(dāng)被視為最正確實(shí)踐典范，考慮到具體本質(zhì)解析方法時(shí)，在保持科學(xué)合理性和客觀性的狀況下，也能夠承受取代方法。假設(shè)承受取代方法，建議與看管機(jī)構(gòu)進(jìn)展充分談?wù)?。以?xì)胞功能為根底的中和抗藥抗體生物檢測(cè)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫解析不在本指南的談?wù)摲秶鷥?nèi)。方法抗藥抗體檢測(cè)臨床和非臨床爭(zhēng)論尋常是經(jīng)過(guò)對(duì)治療引起的抗藥抗體反響的檢測(cè)和表征來(lái)評(píng)估藥物的免疫原性。目前可經(jīng)過(guò)多種方法可用于抗藥抗體的檢測(cè)， 包括酶聯(lián)免疫法〔ELISA〕、放射免疫檢定法〔RIA〕、放射免疫積淀法〔RIPA〕、外表等離振〔SPR〕、電化學(xué)發(fā)光法〔ECL〕。每一種檢測(cè)方法均有其優(yōu)點(diǎn)和限制性，在近來(lái)的文章中已進(jìn)展過(guò)談?wù)揫8,14]。無(wú)論是承受何種方法，在方法開發(fā)和優(yōu)化后均應(yīng)進(jìn)展正式的方法學(xué)考據(jù)， 以保證該方法適宜相應(yīng)的檢測(cè)要求。 因此能夠推想，本指南的考據(jù)建議適用于大多數(shù)的抗藥抗體免疫檢測(cè)。 爭(zhēng)論人員應(yīng)依照檢測(cè)系統(tǒng)的特點(diǎn)確立適宜的方法學(xué)考據(jù)方案。臨床爭(zhēng)論中抗藥抗體的檢測(cè)和表征尋常包括四種不一樣種類的方法?？顾幙贵w檢測(cè)試驗(yàn)尋常包括精選試驗(yàn)和特異性確證試驗(yàn)，表征試驗(yàn)尋常包括抗體滴定和中參數(shù)，分別為精選試驗(yàn)的精選臨界點(diǎn)〔screeningcutpon特異性臨界點(diǎn)〔specificitycuton精選臨界點(diǎn)有助于抗藥抗體檢測(cè)結(jié)果的分類，高于精選臨界點(diǎn)為活性樣品〔活性樣品尋常為潛藏陽(yáng)性樣品〕，低于臨界點(diǎn)為無(wú)活性樣品。活性樣品經(jīng)過(guò)特異性確證試驗(yàn)〔如競(jìng)爭(zhēng)性藥物把握信號(hào)通路〕檢測(cè)是陽(yáng)性〔特異性活性〕仍是陰性〔非特異性活性〕。特異性臨界點(diǎn)抗藥抗體的檢測(cè)方法尋常是非定量試驗(yàn)〔有時(shí)是半定量試驗(yàn)〕，由于沒(méi)有可[15]。陽(yáng)性比較一般都是內(nèi)部開發(fā)的〔比方單克隆抗體或高免血清的多克隆抗體〕，不能能將受試者檢測(cè)到的全部抗藥抗體作為陽(yáng)性比較。假設(shè)是預(yù)備使用質(zhì)量單位標(biāo)示抗藥抗體水平，那應(yīng)當(dāng)證明標(biāo)準(zhǔn)品和試驗(yàn)樣品的平行性，以確立樣品的濃度的正確性[8,10與標(biāo)準(zhǔn)品間的平行性，則正確性是可疑的。滴定法是另一種評(píng)估抗體水平的方法，該方法不同樣品稀釋間簡(jiǎn)潔缺乏平行性。但是，值得留意的是已有爭(zhēng)論表示，滴定法適用于抗體水平的評(píng)估。幾十年來(lái)，臨床上感染、自己免疫疾病的診斷和治療以及預(yù)防接種等都承受這一方法[16~22]。滴定法比較抗藥抗體反響更加簡(jiǎn)潔且所需的考據(jù)工作更少，由于其不需要再對(duì)不一樣產(chǎn)品的抗藥抗體與標(biāo)準(zhǔn)品間的平行性進(jìn)展具體描述與證明。其他質(zhì)量單位法每當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品品轉(zhuǎn)變時(shí)均需要進(jìn)展重考據(jù)。綜上所述，兩種方法都無(wú)法供給正確的定量數(shù)據(jù)。因此，贊助商建議承受相對(duì)濃度〔質(zhì)量單位〕或滴度表示抗藥抗體水平。某些看管機(jī)構(gòu)會(huì)更傾向于使用滴度單位。滴度是還能夠產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。在方法的開發(fā)和優(yōu)化階段，應(yīng)先確立方法并進(jìn)展記錄，比方選擇所需的試劑、最正確濃度、預(yù)期樣品所需的最大稀釋倍數(shù)等。這些需要爭(zhēng)論人員在起初爭(zhēng)論階段進(jìn)展簡(jiǎn)潔或重復(fù)確證。本文假定以手下性在考據(jù)從前已被確證：免疫解析方案及方法設(shè)計(jì)，解析基質(zhì)的種類，最大稀釋倍數(shù)〔MRD〕、試劑的最正確濃度、酶標(biāo)板的平均性評(píng)估〔如地址的影響、漂移等〕?？垂軝C(jī)構(gòu)可能會(huì)要求供給相關(guān)的數(shù)據(jù)支持。在方法的開發(fā)和優(yōu)化階段，經(jīng)過(guò)比照較品的檢測(cè)，對(duì)方法的變異性有一個(gè)初步的生疏。統(tǒng)計(jì)學(xué)的應(yīng)用降低考據(jù)過(guò)程中的主觀作用是本文的重點(diǎn)之一。為了保證明驗(yàn)的客觀性必定依靠于統(tǒng)計(jì)手段。由于大多數(shù)爭(zhēng)論者無(wú)法獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)家的效勞，本文供給了簡(jiǎn)潔且足夠嚴(yán)格和有效的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。所涉及的統(tǒng)計(jì)計(jì)算都能夠承受商業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展計(jì)算，計(jì)算過(guò)程不需要閱歷豐富的統(tǒng)計(jì)學(xué)家。但是，假設(shè)是有統(tǒng)計(jì)學(xué)家?guī)椭M(jìn)展考據(jù)明驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)辦理的話，統(tǒng)計(jì)學(xué)的應(yīng)用可能會(huì)比本文供給的更加嚴(yán)格和有效。預(yù)爭(zhēng)論考據(jù)臨床和非臨床爭(zhēng)論中在開頭樣品生物解析前的考據(jù)試驗(yàn)稱為預(yù)爭(zhēng)論考據(jù)，它主[8](prevalidation)是指爭(zhēng)論工作啟動(dòng)前的籌備工作，兩者不能夠混淆。另一方面，在爭(zhēng)論考據(jù)是指監(jiān)控整個(gè)方法使用過(guò)程的性能特點(diǎn)，以保證方法的有效性和數(shù)據(jù)的牢靠性。經(jīng)過(guò)完滿的方法開發(fā)和優(yōu)化后，解析方法應(yīng)具備考據(jù)的條件，如優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示檢測(cè)方法擁有潛藏的牢靠性和適用于相應(yīng)的檢測(cè)要求。方法的牢靠性依靠于解析設(shè)備和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)以及試驗(yàn)人員的嫻熟程度。本質(zhì)上，解析方法是包括多個(gè)因素的整系通通而不能是是試劑而已?？紦?jù)方法應(yīng)包括系統(tǒng)適用性，這屬于在爭(zhēng)論考據(jù)范圍。建議開頭預(yù)爭(zhēng)論考據(jù)從前擬定相應(yīng)的考據(jù)明驗(yàn)方案或考據(jù)明驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序〔SOP〕，考據(jù)明驗(yàn)方案應(yīng)說(shuō)明該方法的預(yù)期目的、解析方法的具體說(shuō)明、待考據(jù)的性能特點(diǎn)以及精巧度、莊重性、結(jié)實(shí)性和耐用性的預(yù)期查收標(biāo)準(zhǔn)。其他建議在考據(jù)明驗(yàn)方案中參與適宜的試驗(yàn)細(xì)節(jié)和數(shù)據(jù)辦理步驟，這樣能夠?yàn)榭紦?jù)人員供給一個(gè)明確的指導(dǎo)以保證更好的辦理數(shù)據(jù)?？顾幙贵w檢測(cè)應(yīng)建立相應(yīng)的查收標(biāo)準(zhǔn)，有助于保證在研階段的試驗(yàn)的有效性。為此，應(yīng)經(jīng)過(guò)對(duì)考據(jù)過(guò)程中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)展統(tǒng)計(jì)談?wù)摵蠼⒂糜谫|(zhì)控的系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)〔可承受范圍〕。其他，在研考據(jù)階段中間精巧度試驗(yàn)，比較品和樣品檢測(cè)也應(yīng)有相應(yīng)的查收標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)在研考據(jù)階段的解析數(shù)據(jù)不吻合查收標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)拒絕該數(shù)據(jù)。在預(yù)研考據(jù)階段不應(yīng)建立查收標(biāo)準(zhǔn)，由于這可能會(huì)使某些考據(jù)數(shù)據(jù)被除去，以致不能夠正確估量解析誤差。除了可明緣由〔如技術(shù)誤差〕、有意或沒(méi)心偏離試驗(yàn)方案所得解析數(shù)據(jù)應(yīng)被剔除外，預(yù)研階段的全部解析數(shù)據(jù)都應(yīng)計(jì)算在內(nèi)。目前，美國(guó)食品藥品督查治理局〔FDA〕、國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議〔ICH〕和美國(guó)藥典的指導(dǎo)性文件闡述了定量檢測(cè)的解析考據(jù)應(yīng)爭(zhēng)論的一般性能特點(diǎn)[23~25]。由于抗藥抗體免疫解析屬于半定量檢測(cè)，因此有些要求其實(shí)不不適用。關(guān)于抗藥抗體免疫解析方法學(xué)考據(jù)，應(yīng)付以下9項(xiàng)參數(shù)進(jìn)展測(cè)定：1.精選臨界點(diǎn)2.確證臨界點(diǎn)3.矯捷度*系統(tǒng)適用性把握〔QCs〕查收標(biāo)準(zhǔn)耐藥性*精巧度魯棒性結(jié)實(shí)性*耐用性〔有條件時(shí)〕假設(shè)是解析方法的開發(fā)和優(yōu)化過(guò)程已充分說(shuō)明并獲得適宜記錄，在預(yù)研考據(jù)階段*的參數(shù)進(jìn)展重復(fù)考據(jù)，盡管考據(jù)報(bào)告中應(yīng)供給相關(guān)的數(shù)據(jù)。假設(shè)是最終的方法有所變動(dòng)的話，預(yù)研考據(jù)階段應(yīng)重測(cè)定?？顾幙贵w檢測(cè)方法開發(fā)階段的預(yù)期用途和產(chǎn)品上市后的用途可能會(huì)不一樣。比方，在開發(fā)早期只有一個(gè)解析人員進(jìn)展試驗(yàn)，開發(fā)工作完成后和上市后可能會(huì)有多個(gè)解析人員進(jìn)展試驗(yàn)。整個(gè)產(chǎn)品生命周期的考據(jù)要求應(yīng)隨著檢測(cè)方法應(yīng)用的轉(zhuǎn)變而轉(zhuǎn)變。此后，在藥物申請(qǐng)期間仍是應(yīng)付以上列出的參數(shù)進(jìn)展考據(jù)。傳統(tǒng)解析方法的稀釋線性測(cè)試不適用于抗藥抗體檢測(cè)。當(dāng)使用滴度標(biāo)示抗藥抗體反響時(shí)，需要使用陽(yáng)性比較，或許最好使用累積抗藥抗體陽(yáng)性樣品，在合理稀釋范圍內(nèi)不消滅特別非線性。尋常，在方法開發(fā)階段都會(huì)包括最大稀釋濃度〔MRD〕的選擇，考據(jù)階段不需要進(jìn)展重復(fù)測(cè)定。假設(shè)是消滅前帶效應(yīng)，建議選擇一個(gè)不受前帶效應(yīng)影響的MRD，或許承受多種稀釋樣品。稀釋線性信息有助于設(shè)計(jì)系統(tǒng)適應(yīng)性質(zhì)量把握。精選臨界點(diǎn)精選臨界點(diǎn)定義為精選試驗(yàn)的響應(yīng)水平，響應(yīng)值高于該臨界點(diǎn)的樣品為活性樣品〔或許稱為潛藏陽(yáng)性〕，響應(yīng)值低于該臨界點(diǎn)的樣品為陰性樣品。一個(gè)有效的精選臨界點(diǎn)需要在預(yù)爭(zhēng)論考據(jù)階段對(duì)一些列樣品測(cè)定值進(jìn)展系統(tǒng)性的統(tǒng)計(jì)分析確立，所使用的樣品要求來(lái)自代表藥物使用目標(biāo)集體或受試者。當(dāng)免疫解析的方法存在錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，精選試驗(yàn)情愿消滅假陽(yáng)性也要防范假陰品的力氣。約5%的精選試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果為假陽(yáng)性，從而保證能夠檢測(cè)出低陽(yáng)性樣品〔如假陽(yáng)性率可能不等于5%〕精選臨界點(diǎn)的種類能夠應(yīng)用于在研考據(jù)階段的精選臨界點(diǎn)共有三種：固定臨界點(diǎn)、浮動(dòng)臨界點(diǎn)、動(dòng)向臨界點(diǎn)。固定臨界點(diǎn)：預(yù)研考據(jù)階段確立固定臨界點(diǎn)，此后應(yīng)用于在研考據(jù)階段。固定臨界點(diǎn)用于測(cè)試樣品的解析，直到需要重考據(jù)或轉(zhuǎn)變〔如測(cè)定方法發(fā)生重點(diǎn)變化、轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試驗(yàn)室進(jìn)展試驗(yàn)或儀器升級(jí)等〕。固定臨界值在一個(gè)目標(biāo)人群的同一爭(zhēng)論中或多目標(biāo)人群的各爭(zhēng)論間是固定的。當(dāng)預(yù)爭(zhēng)論階段的整個(gè)試驗(yàn)的均值相等、方差齊性時(shí)，承受固定臨界點(diǎn)。浮動(dòng)臨界點(diǎn)浮動(dòng)臨界點(diǎn)有兩種計(jì)算方法，解析過(guò)程中數(shù)據(jù)需要進(jìn)展對(duì)數(shù)〔Log〕變換時(shí)，經(jīng)過(guò)預(yù)研階段確立的特定歸一化因子乘以在研階段的生物背景計(jì)算而得；解析過(guò)程無(wú)對(duì)數(shù)變換時(shí)，計(jì)算方法歸一化因子加上生物背景，生物背景能夠由陰性比較〔由樣品的基質(zhì)組成，抗藥抗體反響為陰性〕、解析稀釋劑或預(yù)辦理受試者樣品〔個(gè)體特異性臨界點(diǎn)〕標(biāo)示。浮動(dòng)臨界點(diǎn)能夠是每一次試驗(yàn)每一塊板〔每一次試驗(yàn)中的假設(shè)干塊板〕所特有的或每一個(gè)受試者所特有的〔使用受試者的預(yù)辦理基線樣本結(jié)果〕。假設(shè)是承受個(gè)體特異性臨界點(diǎn)，需要在同一塊板上檢測(cè)預(yù)辦理樣品和辦理后樣品〔或最少在同一試驗(yàn)中檢測(cè)〕。由于浮動(dòng)臨界點(diǎn)確實(shí)定過(guò)程需要對(duì)預(yù)爭(zhēng)論考據(jù)的數(shù)據(jù)進(jìn)展方差估量，因此不一樣試驗(yàn)間的結(jié)果應(yīng)表現(xiàn)出方差齊性。承受陰性比較進(jìn)展歸一化時(shí)，應(yīng)保證陰性比較結(jié)果能代表目標(biāo)人群的藥物初治基質(zhì)樣品的結(jié)果，比方經(jīng)過(guò)考據(jù)陰性比較均值和生物基質(zhì)樣品均值在整個(gè)試驗(yàn)中是相關(guān)系的。假設(shè)是均值相關(guān)，陰性比較均值適用于計(jì)算浮動(dòng)臨界點(diǎn)。假設(shè)是均值不相關(guān)，則使用稀釋液或預(yù)辦理樣品結(jié)果進(jìn)展歸一化辦理更加合理。動(dòng)向臨界點(diǎn)、同一試驗(yàn)的不一樣板之間、同一爭(zhēng)論的不一樣試驗(yàn)間或不一樣爭(zhēng)論間的動(dòng)向臨界點(diǎn)均不一樣。動(dòng)向臨界點(diǎn)確實(shí)定不需要預(yù)爭(zhēng)論階段的方差估量。這一特點(diǎn)將動(dòng)向臨界點(diǎn)和浮動(dòng)臨界點(diǎn)差異開來(lái)。只有當(dāng)不一樣試驗(yàn)間的結(jié)果方差有明顯性差異時(shí)，才使用動(dòng)向臨界點(diǎn)。本質(zhì)使用時(shí)，動(dòng)向臨界點(diǎn)的限制性因素是每次試驗(yàn)都需要大量的樣本數(shù)才能確立臨界點(diǎn)。建議優(yōu)先承受固定臨界點(diǎn)或浮動(dòng)臨界點(diǎn)。假設(shè)是試驗(yàn)間的均值或方差存在差異，建議在承受動(dòng)向臨界點(diǎn)從前先進(jìn)展差異根源檢查。比方，假設(shè)果差異根源于解析員或設(shè)備，則承受解析員或設(shè)備的固定臨界點(diǎn)或浮動(dòng)臨界點(diǎn)取代動(dòng)向臨界點(diǎn)。由于動(dòng)向臨界點(diǎn)是一種不常有的特別規(guī)方法，建議慎重?cái)M定該臨界點(diǎn)，最好能與看管機(jī)構(gòu)進(jìn)展充分溝通。評(píng)估臨界點(diǎn)的樣品建議從適宜的人群中抽樣用于解析臨界點(diǎn)的評(píng)估。有時(shí)需要在開頭預(yù)爭(zhēng)論考據(jù)試驗(yàn)從前從目標(biāo)疾病人群中獲得樣品基質(zhì)是不本質(zhì)的，甚至是不能能的。因此，一般從藥物初治安康受試者的樣本中進(jìn)展評(píng)估，并確立一個(gè)初步臨界點(diǎn)。該方法適用于于臨床期的爭(zhēng)論。當(dāng)臨床爭(zhēng)論睜開到臨床期今后，即可獲得目標(biāo)疾病患者的樣本，應(yīng)當(dāng)對(duì)不一樣的目標(biāo)人群重評(píng)估臨界點(diǎn)。假設(shè)是目標(biāo)人群和正常志愿者的響應(yīng)值的平均值和方差相當(dāng)，能夠使用同一個(gè)臨界點(diǎn)。假設(shè)是沒(méi)有可比性，則需要承受目標(biāo)疾病特異性的臨界點(diǎn)。為了確立臨界點(diǎn)，在考據(jù)階段應(yīng)解析足夠數(shù)量的樣本，這樣才能對(duì)生物和分析變異進(jìn)展有效的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。尋常在臨床爭(zhēng)論中，需要解析高出50個(gè)獨(dú)立受試者的樣本。非臨床爭(zhēng)論最少需要15個(gè)樣品。不應(yīng)使用混淆基質(zhì)樣品進(jìn)展臨界談?wù)摴?，由于從混淆樣品中測(cè)試重復(fù)的樣品，檢測(cè)的可是解析變異而不是生物變異。建議承受平衡試驗(yàn)設(shè)計(jì)有效評(píng)估潛藏的變異性根源〔seeAppendixA〕。假設(shè)是將有多個(gè)解析員在爭(zhēng)論過(guò)程進(jìn)展解析樣品操作，那么在預(yù)爭(zhēng)論考據(jù)階段應(yīng)最少包括兩位解析員。假設(shè)是爭(zhēng)論過(guò)程中只有一個(gè)解析員進(jìn)展樣品解析，而這個(gè)解析員與考據(jù)階段的解析員不一樣，預(yù)爭(zhēng)論考據(jù)階段也應(yīng)最少包括兩位解析員?？煞裥枰獙?duì)同同樣品進(jìn)展重復(fù)試驗(yàn)取決于在研考據(jù)的報(bào)告形式〔比方在微量滴定板中進(jìn)展兩個(gè)復(fù)孔或三個(gè)復(fù)孔〕。除去特別值應(yīng)確認(rèn)藥物初治患者的有時(shí)活性樣本，以保證藥物的特異性。在這一點(diǎn)上，確證臨界點(diǎn)將不能夠真實(shí)確實(shí)認(rèn)陽(yáng)性，推斷方法， 應(yīng)除去無(wú)法

此時(shí)應(yīng)當(dāng)使用科學(xué)的確立可否為有時(shí)活性樣本。在解析臨界點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估時(shí)應(yīng)去除抗藥抗體陽(yáng)性樣品和統(tǒng)計(jì)學(xué)特別樣品〔樣品響應(yīng)值過(guò)高或過(guò)低〕。由于下部極端特別值尋常會(huì)使差異性顛簸從而影響臨界點(diǎn)，因此應(yīng)當(dāng)除去。去除較高或較低特別值會(huì)獲得一個(gè)較低的臨界點(diǎn)，尋常會(huì)增加假陽(yáng)性率而變得更加慎重〔假陽(yáng)性樣本會(huì)在隨后的特異性確證試驗(yàn)中被證明為陰性〕。假設(shè)是在臨界談?wù)摴乐惺褂昧烁粡?qiáng)的統(tǒng)計(jì)方法〔比方基于中位數(shù)的方法，圖基的 biweight函數(shù)〕，則不需要除去特別點(diǎn)。確立精選臨界點(diǎn)為了確立精選臨界點(diǎn)的種類，需要進(jìn)展一系列的數(shù)據(jù)評(píng)估，如圖1所示。第一，假設(shè)是使用參數(shù)估量的方法，需要對(duì)藥物初治的樣本結(jié)果的分布種類進(jìn)展檢驗(yàn)〔正態(tài)分布檢驗(yàn)〕，假設(shè)是數(shù)據(jù)不吻合正態(tài)分布，則能夠?qū)?shù)據(jù)進(jìn)展適宜的變換〔如對(duì)數(shù)變換〕，此后除去特別值〔AppendixB.1〕。假設(shè)是不需要用到參數(shù)估量〔第95百分位〕，則不需要進(jìn)展數(shù)據(jù)變換，但仍需要除去特別值。其次，承受單因素方差解析〔ANOVA-basedstatisticalmethods〕的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法辦理比較每一次試驗(yàn)運(yùn)轉(zhuǎn)的平均值和方差，從而打算承受固定臨界點(diǎn)、浮動(dòng)臨界點(diǎn)仍是動(dòng)向臨界點(diǎn)〔AppendixB.2〕。在浮動(dòng)臨界點(diǎn)的談?wù)撨^(guò)程中，假設(shè)是歸一化過(guò)程使用了陰性比較，則應(yīng)當(dāng)將陰性比較的均值與目標(biāo)人群的基質(zhì)樣本進(jìn)展比較，以確立可否適宜使用陰性比較。最終，基于以上評(píng)估，使用適宜的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出臨界點(diǎn)〔AppendixB.3〕。確證臨界點(diǎn)特異性是解析方法在其他基質(zhì)成分存在的條件下明確檢測(cè)目標(biāo)解析物的力氣[23]。精選試驗(yàn)精選出活性樣品〔尋常稱為潛藏陽(yáng)性〕，5%的假陽(yáng)性率，因此這些活性樣品可能是非特異性的。因此從活性樣品中推斷出陽(yáng)性樣品需要藥物的特異性活性。檢測(cè)人源樣本的抗藥抗體特異性是一種常有的做法，動(dòng)物樣本也同樣。特異性確證試驗(yàn)尋常是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性把握試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)檢測(cè)含或不含預(yù)孵育爭(zhēng)論藥物的樣品的信號(hào)變化來(lái)進(jìn)展評(píng)估。其他還可經(jīng)過(guò)比較同樣大小和電荷的免疫沒(méi)關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)展評(píng)估。還有一些爭(zhēng)論者經(jīng)過(guò)比較加藥和不加藥的信號(hào)差異進(jìn)展評(píng)估，但是本文建議與看管機(jī)構(gòu)樂(lè)觀談?wù)撨@一方法的可承受性。以上的任何一種方法，確證陽(yáng)性信號(hào)的變化值稱為確證臨界點(diǎn)。確證臨界點(diǎn)將抗體與藥物的特異性結(jié)合和非特異性結(jié)合差異開來(lái)，其有效性特別重點(diǎn)，必定客觀評(píng)估。不鼓舞使用50%信號(hào)把握等主觀標(biāo)準(zhǔn)。信號(hào)略高于臨界點(diǎn)的低信號(hào)的抗藥抗體弱陽(yáng)性樣品的談?wù)撎貏e重要?？顾幙贵w強(qiáng)陽(yáng)性藥品需要用過(guò)分的藥物進(jìn)展競(jìng)爭(zhēng)性把握，因此一般不會(huì)消滅這一問(wèn)題。當(dāng)談?wù)摽顾幙贵w弱陽(yáng)性樣品時(shí)，即即是加標(biāo)藥物樣品的信號(hào)很微小的減弱都可能會(huì)使相對(duì)應(yīng)的未加標(biāo)藥物樣品的信號(hào)降低50%以上，從而以致假陽(yáng)性。其他，只有將抗藥抗體陽(yáng)性樣品的信號(hào)下降到背景信號(hào)，這信號(hào)強(qiáng)度只有未把握樣品信號(hào)的50%以下，這樣可能會(huì)消滅假陰性。因此，特異性確證臨界點(diǎn)應(yīng)當(dāng)經(jīng)過(guò)客觀的方法進(jìn)展評(píng)估，在弱陽(yáng)性樣本周邊評(píng)估解析方法的變異性。有多種試驗(yàn)方法能夠用于特異性確證臨界點(diǎn)的評(píng)估。建議在精選臨界點(diǎn)的考據(jù)過(guò)程評(píng)估特異性確證臨界點(diǎn)。精選臨界談?wù)摴涝囼?yàn)所用到的藥物初治樣本能夠參與藥物后再以同樣的方式檢驗(yàn)。計(jì)算未加標(biāo)藥物樣本〔把握〕的均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差〔SD〕，特異性確證臨界點(diǎn)為把握平均值加上3.09倍的SD值〔假設(shè)是預(yù)期假陽(yáng)性率為1%〕。與精選臨界點(diǎn)的評(píng)估同樣，特異性確證臨界點(diǎn)的評(píng)估過(guò)程也需要除去特別值。特異性確證臨界點(diǎn)的具體計(jì)算步驟拜會(huì)附C〔AppendixC〕。在某些試驗(yàn)室，會(huì)在低于精選臨界點(diǎn)的樣品〔25〕中加標(biāo)陽(yáng)性比較使其信號(hào)值等于或略微大于精選臨界點(diǎn)。用過(guò)分藥物孵育后，計(jì)算平均把握百分率，并經(jīng)過(guò)“×SD〔“×”取決于適宜的假陽(yáng)性率〕。必定保證陽(yáng)性比較樣品的信號(hào)不會(huì)高于精選臨界點(diǎn)太多，省得使假陽(yáng)性率增高。這一方法確立的特異性確證臨界點(diǎn)高度依靠于所使用的陽(yáng)性比較品。值得留意的是，爭(zhēng)論樣本中的低抗藥抗體親和力樣本〔特別是多IgG〕可能會(huì)不被把握。因此，使用單一陽(yáng)性比較品確立的特異性確證臨界點(diǎn)可能無(wú)法有效地將一個(gè)爭(zhēng)論樣品分為特異性樣品仍是非特異性樣品。Neyer等提出了一種基于T檢驗(yàn)〔t-test〕的表示抗藥抗體特異性的方法，該方法的原理是比較未加標(biāo)藥物樣品與加標(biāo)藥物樣品的信號(hào)值。 但是，該解析法的競(jìng)爭(zhēng)性把握結(jié)果的觀看樣本量相當(dāng)有限，沒(méi)有考慮到生物變異的影響。但是，以上列舉的方法均比人為的50%把握率更加客觀、牢靠。一些爭(zhēng)論人員進(jìn)展抗體免疫耗竭〔如ProteinA，這一方法其實(shí)不涉及特異性藥物，它只能證明信號(hào)根源于免疫球蛋白。這種方法能夠用作支撐測(cè)試，不建議作為藥物特異性的打算性試驗(yàn)。矯捷度完滿定量方法一般承受適宜的參照標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)估量解析方法矯捷度，而抗藥抗體解析的矯捷度高度依靠于所用的陽(yáng)性比較試劑。比方，在同一個(gè)解析試驗(yàn)中，使用高親和力陽(yáng)性比較品獲得的矯捷度優(yōu)于低親和力陽(yáng)性比較品。因此當(dāng)有一種以上的陽(yáng)性比較品時(shí)，尋常會(huì)覺(jué)察不一樣的陽(yáng)性比較品會(huì)獲得不同樣的矯捷度。其他，沒(méi)有一種陽(yáng)性比較品能表示出不一樣化合物辦理后的免疫應(yīng)答圖譜。盡管這樣，解析矯捷度供給了解析方法的一般相關(guān)性，需要進(jìn)展測(cè)定并報(bào)告。矯捷度有助于在解析方法開發(fā)階段選擇最優(yōu)的抗藥抗體檢測(cè)方法〔方法開提倡始階段比較不一樣方法〕，也有助于確立低陽(yáng)性比較品的考據(jù)?？顾幙贵w解析的矯捷度指陽(yáng)性比較抗體能結(jié)實(shí)產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的最低濃度。比95%高于精選臨界點(diǎn)的比較抗體的濃度，具體的比率取決于全都性水平。確立解析矯捷度的試驗(yàn)方法拜會(huì)附錄D〔Appendix〕。系統(tǒng)適用性把握質(zhì)量把握〔強(qiáng)、弱陽(yáng)性比較和陰性比較〕的查收標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于系統(tǒng)適用性把握開發(fā)和相關(guān)的查收標(biāo)準(zhǔn)的具體信息拜會(huì)附錄E〔AppendixE〕。選擇性/攪亂性〔耐藥性〕考慮到樣品中的其他組分可能會(huì)影響抗藥抗體的檢測(cè)。選擇性就是指解析方法[27]，經(jīng)過(guò)從含有潛藏?cái)噥y組分〔多個(gè)〕的樣品中檢測(cè)解析物〔模擬陽(yáng)性比較品〕的回收率來(lái)進(jìn)展表征。當(dāng)陽(yáng)性比較和anti-framework抗體和抗異種抗體常常會(huì)阻攔陽(yáng)性比較品的回收。留意當(dāng)使用陽(yáng)性比較時(shí)，抗藥抗體解析的選擇性不太可能會(huì)影響測(cè)定臨床或非臨床樣品的選擇性。盡管這樣，仍是很有必要去生疏抗藥抗體檢測(cè)的試驗(yàn)條件，基質(zhì)中可能含有爭(zhēng)論藥物、內(nèi)源性抗體、合并用藥和類風(fēng)濕因子等?；|(zhì)成分的攪亂抗藥抗體解析的回收率評(píng)估包括在試驗(yàn)條件下檢測(cè)基質(zhì)成分可否會(huì)把握抗藥抗體與藥物的結(jié)合。假設(shè)是可能的話，選擇性爭(zhēng)論應(yīng)包括陽(yáng)性比較與疾病狀態(tài)下的血清的比較試驗(yàn)，由于某些人群或疾病狀態(tài)下可能會(huì)產(chǎn)生攪亂性物質(zhì)。假設(shè)是有明顯比率的測(cè)試樣本消滅溶血或高血脂，則需要進(jìn)展回收率談?wù)?。為了確立目標(biāo)基質(zhì)樣品的回收率，應(yīng)將高、低濃度的特異性抗藥抗體比較品〔單克隆或多克隆〕參與解析緩沖液〔不含基質(zhì)成分〕、安康個(gè)體的生物基質(zhì)〔血清或血漿〕、治療人群樣本。比較緩沖液的響應(yīng)值與生物基質(zhì)的響應(yīng)值，可承受標(biāo)準(zhǔn)尋常為兩者的差異高出20%，具體差異取決于所用的陽(yáng)性比較。在試驗(yàn)中選擇表達(dá)高、低非特確證最小稀釋濃度〔MRD〕。藥物攪亂爭(zhēng)論〔耐藥性〕抗藥抗體檢測(cè)的主要攪亂物質(zhì)尋常來(lái)自藥物自己。由于目標(biāo)藥物和試驗(yàn)過(guò)程用到的捕獲試劑的特異性抗體的產(chǎn)生計(jì)在競(jìng)爭(zhēng)性作用，含藥樣品可能存在攪亂物質(zhì)，以致消滅假陰性。尋常的做法是確立把握陽(yáng)性比較抗體檢測(cè)的藥物濃度，并將此耐藥限度應(yīng)用于爭(zhēng)論樣本抗藥抗體狀態(tài)的決策方面。這一做法存在必定的弊端，由于耐藥性高度依靠于所使用的陽(yáng)性比較，在同一個(gè)試驗(yàn)中，使用高親和力陽(yáng)性比較能夠獲得較低的耐藥性，而低親和力比較獲得的耐藥性更高。由于抗藥抗體存在個(gè)體差異性，因此爭(zhēng)論樣本的抗體獲得的真實(shí)的耐藥性可能會(huì)與陽(yáng)性對(duì)照的耐藥性不一樣。事實(shí)上，當(dāng)有一個(gè)以上陽(yáng)性比較時(shí)，尋常會(huì)覺(jué)察每一個(gè)陽(yáng)性比較會(huì)對(duì)應(yīng)一個(gè)不一樣的耐藥性值。因此，真實(shí)的耐藥性是無(wú)法確立的。與矯捷度近似，耐藥性僅限于生疏試驗(yàn)中藥物可否會(huì)產(chǎn)生攪亂，在方法的開發(fā)和優(yōu)化階段能夠用于比較不一樣方法。盡管這樣，確立耐藥性是看管期望。ADAQC進(jìn)展預(yù)孵育，QC信號(hào)檢測(cè)的最低藥物濃度就是試驗(yàn)的藥物耐受限，該耐受限會(huì)隨著陽(yáng)性比較的不一樣而轉(zhuǎn)變。爭(zhēng)論階段的生物解析報(bào)告中，當(dāng)在抗藥抗體陰性的樣本中檢測(cè)藥物時(shí)，建議附上該抗藥抗體陰性樣本可能伴隨的藥物攪亂聲明。精巧度精巧度是指解析方法一系列隨機(jī)測(cè)量值的變異程度，精巧度的可承受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)在免疫解析的常用預(yù)期范圍內(nèi)；同時(shí)也應(yīng)當(dāng)適宜所用的平臺(tái)〔比方，電化學(xué)發(fā)光法Elisa法〕附錄A〔AppendixA〕所示。精選試驗(yàn)、特異性確證試驗(yàn)和滴定方法的精巧度確定方法以下。假設(shè)是可行，建議在爭(zhēng)論階段將精巧度試驗(yàn)適宜放大至預(yù)期本質(zhì)使用規(guī)模。精選試驗(yàn)精巧度對(duì)試驗(yàn)比較品〔陰性比較、高、低濃度陽(yáng)性比較〕進(jìn)展最少 6次獨(dú)立檢測(cè)，解析相應(yīng)數(shù)據(jù)確立精選試驗(yàn)精巧度。以上數(shù)據(jù)能夠經(jīng)過(guò)附錄

D〔AppendixD〕所述的矯捷度確立試驗(yàn)獲得。從以上試驗(yàn)受騙算出高濃度陽(yáng)性樣品和低濃度陽(yáng)性樣品〔恰巧高于臨界點(diǎn)〕的不準(zhǔn)確性，不準(zhǔn)確性能夠用變異系數(shù)〔 CV%〕表示，變異系數(shù)表征了先關(guān)變異的根源。批內(nèi)解析精巧度〔也稱批內(nèi)精巧度或內(nèi)部運(yùn)轉(zhuǎn)周密度〕和中間精巧度〔也稱運(yùn)轉(zhuǎn)間精巧度、批間精巧度、中間精巧度或整體精巧度〕都應(yīng)當(dāng)用變異系數(shù)CV%[27]。假設(shè)是解析爭(zhēng)論樣本是使用了解析員特異性臨界點(diǎn)，則應(yīng)當(dāng)測(cè)定解析員中間精巧度〔inter-analystCV〕。特異性確證試驗(yàn)精巧度特異性確證試驗(yàn)精巧度的目的是檢測(cè)信號(hào)把握的重復(fù)性。為了計(jì)算百分把握率〔〕，特異性確證臨界點(diǎn)確實(shí)定試驗(yàn)中，在最少6次獨(dú)立運(yùn)轉(zhuǎn)中，往高、低濃度比較組中參與適宜的藥物。以上試驗(yàn)已經(jīng)有足夠的數(shù)據(jù)計(jì)算批間精巧度，計(jì)算方式如3.6.1.莊重性魯棒性能夠指示解析方法的牢靠性。魯棒性是指當(dāng)方法的參數(shù)發(fā)生有意的渺[23]。魯棒性關(guān)注的是在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)室發(fā)生真實(shí)生活的變化時(shí)解析方法的全都性?？紦?jù)過(guò)程中魯棒性參數(shù)測(cè)定需要基于具體并設(shè)計(jì)適宜的測(cè)試，以檢查被以為重點(diǎn)的參數(shù)。包括微孔板批次、孵育時(shí)間、溫度、每一次運(yùn)轉(zhuǎn)的微孔板數(shù)、試劑批次和濃度或許設(shè)備。爭(zhēng)論樣本或陽(yáng)性比較樣本都可用于檢測(cè)魯棒性。建議在魯棒性考據(jù)過(guò)程中使用系統(tǒng)適用性把握的查收標(biāo)準(zhǔn)〔在方法開發(fā)和優(yōu)化階段計(jì)算或考據(jù)系統(tǒng)適用性查收標(biāo)準(zhǔn)〕結(jié)實(shí)性結(jié)實(shí)性爭(zhēng)論評(píng)估解析方法在預(yù)期樣品的儲(chǔ)蓄條件下的解析性能。抱負(fù)狀態(tài)下，結(jié)實(shí)性測(cè)試條件應(yīng)模擬預(yù)期樣品和試劑的裝卸條件、儲(chǔ)蓄溫度和不一樣的儲(chǔ)蓄時(shí)間?？紤]到解析物的結(jié)實(shí)性，抗藥抗體的本質(zhì)屬性值得深思。無(wú)論抗藥抗體解析物是X藥物抗體仍是抗Y藥物抗體，他們都是多克隆抗體。因此，有緣由以為抗藥抗體的結(jié)實(shí)性都是同樣的。依照這一規(guī)律，抗藥抗體的結(jié)實(shí)性湊近血清或血漿中任意抗原的免疫球蛋白的結(jié)實(shí)性。建議對(duì)每一物種的的基質(zhì)樣本分開進(jìn)展結(jié)實(shí)性表征，無(wú)論是臨床的仍是非臨床的，此后在爭(zhēng)論試驗(yàn)室內(nèi)將試驗(yàn)結(jié)果實(shí)行至全部的藥物檢測(cè)工程，有必要檢測(cè)來(lái)自目標(biāo)適應(yīng)癥〔如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎〕的基質(zhì)。因此，并未規(guī)定解析不一樣藥物時(shí)樣品結(jié)實(shí)性都要分開進(jìn)展考據(jù)。 需要留意一個(gè)事實(shí)，當(dāng)不一樣受試者注射不一樣的藥物時(shí)，產(chǎn)生的 IgM，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的比例各不同樣，不能夠夠知道并模擬不一樣人群的