重組克隆的篩選與鑒定

重組克隆的篩選與鑒定內(nèi)容提要第一節(jié)載體表型選擇法第二節(jié)DNA電泳檢測法第三節(jié)核酸雜交檢測法第四節(jié)免疫化學檢測法第五節(jié)轉譯篩選法第六節(jié)真核重組基因的選擇方法第2頁,共167頁，2024年2月25日，星期天一般克隆與篩選策略第3頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)載體表型選擇法根據(jù)載體提供的表型進行選擇的方法：抗生素抗性基因的插入失活選擇法

-半乳糖苷酶的顯色反應選擇法第4頁,共167頁，2024年2月25日，星期天一般原理一種利用抗生素抗性基因或其他基因的插入失活，來篩選重組子的方法。通常外源DNA插入的位點設計在特定基因上，一旦外源DNA插入，該基因就被破壞而失去活性。由此來判斷載體上是否帶有外源DNA。一、插入失活法的原理第5頁,共167頁，2024年2月25日，星期天二、利用抗生素抗性基因：pBR322以pBR322為例，說明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理。1.原理在pBR322上有多個單一的限制酶位點，如BamHI位點，恰好在一個四環(huán)素抗性基因內(nèi)。如果有外源DNA插入BamHI位點，那么涉及四環(huán)素抗性的基因就損壞，因此，帶有重組pBR322質(zhì)粒的細胞，仍對氨芐青霉素有抗性，但對四環(huán)素的抗性消失（敏感）。第6頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.篩選的方法①轉化細胞涂布于含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。②用一個牙簽接觸培養(yǎng)基的表面，將沾有不同菌落的牙簽，放到另一含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基表面接觸一下。③適溫培養(yǎng)，有的克隆生長，有的不生長。④根據(jù)不會生長的位置，再回到帶氨芐的培養(yǎng)基上去找那些原始的克隆。⑤這些克隆因為喪失了對四環(huán)素的抗性，就是含有重組pBR322質(zhì)粒的重組子。第7頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖pBR322的結構圖第8頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3.抗菌素標記的選擇（1）Ampr氨芐青霉素抗性基因產(chǎn)生

-內(nèi)酰胺酶。酶使氨芐青霉素變?yōu)榍嗝雇?。青霉酮酸使藍灰色的碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）褪色。Ampr有PstI、ScaI等多個插入位點。（2）四環(huán)素抑制細菌生長，但不殺死細菌。（3）環(huán)絲氨酸殺死生長的細菌，但不殺停止生長的細菌。第9頁,共167頁，2024年2月25日，星期天4.選擇的過程（1）四環(huán)素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，導致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素﹢環(huán)絲氨酸的平板，選擇重組克隆。Tetr插入失活的細菌，其生長可被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的細菌，能抗四環(huán)素，正常生長，但可被環(huán)絲氨酸殺死。第10頁,共167頁，2024年2月25日，星期天無環(huán)絲氨酸圖四環(huán)素抗性插入失活重組克隆第11頁,共167頁，2024年2月25日，星期天（2）氨芐青霉素抗性插入失活氨芐青霉素抗性基因編碼產(chǎn)生

-內(nèi)酰胺酶。酶使氨芐青霉素變?yōu)榍嗝雇?。青霉酮酸使藍灰色的碘-青霉素指示液褪色。如果Ampr上插入外源DNA，導致氨芐青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青霉素指示液褪色呈藍灰色。據(jù)此選擇陽性克隆。第12頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖氨芐青霉素抗性插入失活第13頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共167頁，2024年2月25日，星期天三、利用-半乳糖苷酶顯色選擇重組子的原理1.-半乳糖苷酶與LacZ基因由E.colilac操縱子上的LacZ基因編碼。分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。2.LacZ

基因突變的LacZ基因，只編碼

-半乳糖苷酶的部分肽段（氨基端）。第15頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.培養(yǎng)基中IPTG、X-gal的作用（1）IPTG作用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷是誘導物，可誘導lacZ基因的表達

-半乳糖苷酶。（2）X-gal作用5-溴-4-氯-3-吲哚-

-D-半乳糖苷。作為

-半乳糖苷酶水解的底物。（3）X-gal的顯色反應β-半乳糖苷酶(四聚體)將X-gal水解成半乳糖苷和藍色的吲哚衍生物(靛藍)。在4℃藍色加深。第16頁,共167頁，2024年2月25日，星期天

-互補作用是pUC質(zhì)粒載體的特性。pUC載體：含有LacZ

基因，編碼

-半乳糖苷酶的部分肽段（

片段，氨基端）。受體菌：基因組中帶有突變的

-半乳糖苷酶基因（缺失

片段），可被IPTG誘導表達（只編碼

-半乳糖苷酶的

-肽）。載體和受體菌基因組互補：只有當受體菌吸收了帶有LacZ

基因的pUC質(zhì)粒，才能合成完整的有活性的

-半乳糖苷酶。3.-互補作用第17頁,共167頁，2024年2月25日，星期天氨芐青霉素抗性基因LacZ

基因：編碼

-半乳糖苷酶的部分肽段。LacZ

上有插入外源DNA的MCS位點。pUC18/19的結構圖第18頁,共167頁，2024年2月25日，星期天利用藍白斑法篩選pUC8/9重組子，是一種直接檢測

-半乳糖苷酶活性的方法。①先將轉化子涂于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基，能合成

-半乳糖苷酶。②然后再通過檢測

-半乳糖苷酶的活性，來選擇重組子，如果既能抗氨芐青霉素，又能合成

-半乳糖苷酶的細胞，就是重組子細胞。4.篩選的方法：藍白斑法第19頁,共167頁，2024年2月25日，星期天③

-半乳糖苷酶分解X-gal的顯色反應很靈敏。當在含有氨卡青霉素、X-gal、IPDG的培養(yǎng)基中，那些能合成完整的

-半乳糖苷酶的非重組子克隆，會因它能分解X-gal而變成藍色；④而重組子克隆因LacZ

基因被破壞，不能合成完整的

-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而呈白色。第20頁,共167頁，2024年2月25日，星期天5.選擇培養(yǎng)的原理在含有X-gal和IPTG的選擇培養(yǎng)基上，載體上沒有插入片段的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉化子為白色菌落。平板37℃培養(yǎng)后，放于冰箱3-4小時，可使顯色反應充分，菌落為藍色。第21頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖

-半乳糖苷酶顯色反應*

-半乳糖苷酶

乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍++藍色第22頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖LacZ插入外源DNA第23頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖白色菌落與藍色菌落的挑選第24頁,共167頁，2024年2月25日，星期天四、pBS重組質(zhì)粒的篩選實驗使用的載體為pBS質(zhì)粒。轉化受體菌為E.coliDH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr和lacZ基因，故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補現(xiàn)象篩選相結合的方法。第25頁,共167頁，2024年2月25日，星期天載體α-供體為羧基末端缺失的β-半乳糖苷酶。如pUC、pGEM系列載體。菌株α-受體為氨末端缺失的β-半乳糖苷酶。如DH5α(LacZ△M15)、JM101~110(LacZ△M15)等。第26頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1.抗性篩選因pBS質(zhì)粒帶有Ampr基因，而外源DNA片段上不帶該基因，故轉化受體菌后，只有帶有pBSDNA的轉化子，才能在含有Amp的LB平板上存活下來；而只帶有自身環(huán)化的外源DNA片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。第27頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.lacZ基因的插入失活pBS質(zhì)粒上帶有β-半乳糖苷酶基因的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。該編碼區(qū)有一個多克隆位點，但并不破壞lacZ的閱讀框架，不影響其正常功能。第28頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3.DH5α菌株E.coliDH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶的C端的部分編碼序列。在各自獨立的情況下，pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時，可形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。第29頁,共167頁，2024年2月25日，星期天4.α-互補現(xiàn)象lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)象。由α-互補產(chǎn)生的Lac+細菌較易識別，它在生色底物X-gal存在下，被IPTG誘導，形成藍色菌落。第30頁,共167頁，2024年2月25日，星期天當外源DNA片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點后，導致讀碼框架改變，表達蛋白失活，產(chǎn)生的肽段失去α-互補能力。因此，在同樣條件下，含重組質(zhì)粒的轉化子，在生色誘導培養(yǎng)基上，只能形成白色菌落。第31頁,共167頁，2024年2月25日，星期天α互補作用/現(xiàn)象當pUC質(zhì)粒轉化LacZ基因的氨基未端編碼序列缺失的Lac-指示菌株時，能恢復β-半乳糖苷酶活性，從而在含IPTG和X-gal的平板上，分解X-gal成5-溴-4-氯靛藍，出現(xiàn)藍色菌落的現(xiàn)象。當外源DNA插入pUC的MCS時，α-互補作用被破壞，在IPTG和X-gal平板上則不顯藍色而出現(xiàn)白色菌落。第32頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)DNA電泳檢測法PFGE第33頁,共167頁，2024年2月25日，星期天從轉化后的克?。ㄞD化子）中快速抽提重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳比較其分子量大小。插入外源DNA的重組質(zhì)粒分子量大，沒有插入外源DNA的質(zhì)粒分子量小。比較不同質(zhì)粒在凝膠中的遷移率，遷移快慢不同，即可選出重組子。一、直接電泳檢測法第34頁,共167頁，2024年2月25日，星期天Marker載體重組圖瓊脂糖凝膠電泳圖譜的比較已知未知第35頁,共167頁，2024年2月25日，星期天二、酶切產(chǎn)物電泳篩選法1.原理根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇1~2種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較DNA帶數(shù)和長度?；蛴靡环N內(nèi)切酶切下插入片段，再用另一種酶酶切這個片段，電泳后比較兩者是否符合預計的結果。第36頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖酶切產(chǎn)物的電泳篩選第37頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖限制性內(nèi)切酶酶切圖譜第38頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖表型篩選加酶切篩選０AATTAATT第39頁,共167頁，2024年2月25日，星期天三、PCR擴增檢測法1.原理在模板序列上擴增出預期DNA片斷。2.過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用插入的DNA片段的引物作PCR。（3）PCR產(chǎn)物電泳檢查。（4）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。第40頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)核酸的分子雜交核酸雜交技術由Hall、Nygaard等于70年代建立，應用DNA或RNA探針，與靶序列在溶液中雜交，檢測固定在硝酸纖維素（NC）膜上的核酸序列的技術。核酸雜交法利用標記的核酸探針，與轉化細胞的DNA進行雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。第41頁,共167頁，2024年2月25日，星期天常用的方法：將轉化后生長的菌落，復印到硝酸纖維膜上，再用堿裂細菌菌落，釋放的DNA就吸附在膜上，再與標記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結合在含有目的序列的菌落DNA上。該技術已廣泛應用于基因的表達、基因定位、克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列檢測、遺傳病疾病的診斷及生物分類等方面。第42頁,共167頁，2024年2月25日，星期天一、核酸分子雜交的基礎1.變性與退火DNA以雙鏈形式存在，在進行分子雜交時，先將雙鏈DNA分子解聚為單鏈，這一過程稱為變性。兩條單鏈通過堿基互補，聚合成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)的過程稱為退火或復性。第43頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.同源序列不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序，即某種程度的同源性，就可形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA（Southernblot）、RNA與DNA（Northernblot）或RNA與RNA（Insitu）的二條單鏈之間進行。第44頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3.分子雜交法分子雜交是通過一定方法，將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標記的探針與被固定的核酸分子雜交，經(jīng)顯影后，顯示出目的DNA或RNA所處的位置。分子雜交就是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行雜交。第45頁,共167頁，2024年2月25日，星期天4.探針經(jīng)過同位素或非同位素標記的已知序列的寡核苷酸。單一的已知序列的寡核苷酸探針，能與它們的目的序列配對，可以準確地設計雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交，對于一些未知序列的目的片段則無效。第46頁,共167頁，2024年2月25日，星期天5.雜交的靈敏度和特異性核酸分子雜交具有高度的靈敏度和特異性?？梢愿鶕?jù)所使用的探針的已知序列，進行特異性的靶序列檢測。第47頁,共167頁，2024年2月25日，星期天二、探針的類型根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為：DNA探針、RNA探針、cDNA探針和寡核酸探針。根據(jù)是否使用放射性標記物，可分為：放射性標記探針和非放射性標記探針。根據(jù)是否存在互補鏈，可分為：單鏈和雙鏈探針。根據(jù)放射性標記物摻入情況，可分為：均勻標記和末端標記探針。第48頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1.雙鏈DNA探針雙鏈DNA探針的合成方法主要有兩種：①切口平移法。②隨機引物合成法。第49頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.單鏈DNA探針單鏈DNA探針主要有兩種合成方法:①以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針。②以RNA為模板，用反轉錄酶合成單鏈cDNA探針。第50頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3.末端標記DNA探針以Klenow片段標記3’末端為例說明末端標記的方法。第51頁,共167頁，2024年2月25日，星期天4.寡核苷酸探針利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫。第52頁,共167頁，2024年2月25日，星期天三、探針的標記方法與選擇1.探針標記的方法①缺口平移法②DNA快速末端標記③T4多核苷酸激酶標記DNA5’末端法④隨機引物延伸法⑤聚合酶鏈反應法。第53頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.標記方法的選擇根據(jù)實驗的要求如靈敏度和顯示方法等，選擇合適的標記方法。①一般放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。②在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法。③在對靈敏度要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術，或比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)或過氧化物酶系統(tǒng)。第54頁,共167頁，2024年2月25日，星期天四、分子雜交1.常用的核酸雜交方法①

Southern印跡雜交（Southernblot）②

Northern印跡雜交（Northernblot）③菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）④組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）等。⑤點雜交（Dotblot）第55頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.分子雜交的分類根據(jù)被測定的對象不同，可分為2大類:(1)Southern雜交被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。(2)Northern雜交RNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉移到硝酸纖維濾膜（NC）上，然后用探針雜交。被檢對象為RNA，探針為DNA或RNA。第56頁,共167頁，2024年2月25日，星期天五、Southernblot1.Southern雜交或DNA印跡1975年由Southern創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術。用DNA或RNA探針檢測樣品DNA。2.特點Southern雜交用以檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列。從宿主細胞中提取基因組DNA或質(zhì)粒載體，再用探針雜交。只有插入目的片段的重組體，才能與探針雜交，并在X光底片上曝光顯示印跡。第57頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3.雜交的方法轉膜：將DNA樣本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性、Tris緩沖液中和、高鹽下通過毛吸作用，將DNA從凝膠中轉印至硝酸纖維素（NC）濾膜上，烘干固定后，即可用于雜交。雜交：在一定條件下，探針與同源DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異性結合的探針。通過自顯影檢查目的DNA所在位置。第58頁,共167頁，2024年2月25日，星期天4.雜交的步驟或程序(1)酶切待測目的DNA，凝膠電泳分離各酶切片段，并使DNA原位變性為單鏈。(2)將單鏈DNA片段轉移到硝酸纖維素（NC）濾膜或尼龍膜上。(3)預雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點。(4)讓單鏈的探針與同源DNA片段雜交，漂洗除去非特異性結合的探針。(5)通過自顯影檢測目的DNA所在位置。第59頁,共167頁，2024年2月25日，星期天Southern雜交(Southern印跡法)將混合在一起的限制性酶切DNA片段，用瓊脂糖電泳分開，并變性為單鏈DNA，再轉移到一張硝酸纖維素膜上。在膜上的單鏈DNA可用32p標記的單鏈DNA探針雜交。再用放射自顯影方法，顯示出與探針順序互補的限制性酶切DNA片段的位置。這個方法能將上萬個片段中的某一個特殊的目的片段鑒定出來。第60頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖Southernblot第61頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖Southernblot第62頁,共167頁，2024年2月25日，星期天凝膠電泳底片顯示雜交印跡圖Southern印跡第63頁,共167頁，2024年2月25日，星期天六、Northernblot1.Northern印跡雜交對被檢測的RNA進行變性凝膠電泳，以除去RNA中的二級結構，使大小不同的RNA完全分離。將變性后RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上，然后與探針雜交。第64頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.特點用DNA或RNA探針檢測RNA樣品。從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交。主要檢測插入片段是否被轉錄。用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛變性RNA，變性后的RNA有利于在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，以及保持其單鏈狀態(tài)。用NaOH會水解RNA。第65頁,共167頁，2024年2月25日，星期天七、DNA-RNA雜交DNA-RNA雜交采用R-環(huán)檢測法。選擇過程①用mRNA與重組載體雜交。②在70%甲酰胺中，DNA雙鏈變性，復性時，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。③電鏡下可見到R-環(huán)形結構。第66頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖DNA-RNA雜交（R-環(huán)）第67頁,共167頁，2024年2月25日，星期天八、菌落原位雜交

Colonyinsituhybridization1.雜交的方法①將細菌從平板轉移到硝酸纖維素濾膜上。②將濾膜上的菌落原位裂解，以釋出DNA。③烘干，將DNA固定于膜上。④與32P標記的探針雜交。⑤平板置于4℃，放射自顯影，檢測菌落雜交信號（結果），并與平板上的菌落對應。第68頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.特點對應的菌斑(或噬菌斑)位置不變，可以直接找出陽性菌落。對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落(~200)進行克隆篩選時可采用本法。將分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。第69頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖菌落原位雜交Colonyinsituhybridization第70頁,共167頁，2024年2月25日，星期天九、組織原位雜交Tissueinsituhybridization，簡稱原位雜交1.方法組織或細胞經(jīng)適當處理后，使細胞通透性增加，探針直接進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。第71頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.特點組織的原位雜交與菌落的原位雜交不同，可以確定探針的互補序列在細胞內(nèi)的空間位置。例如，通過與細胞RNA的雜交，可分析一種RNA在細胞組織中的分布、顯示細胞及病原微生物的存在方式和部位等。

第72頁,共167頁，2024年2月25日，星期天十、斑點雜交斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交,以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定量的結果。所以它是一種簡便、快速、經(jīng)濟的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到,是研究基因表達的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其在本底干擾較高時,難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。第73頁,共167頁，2024年2月25日，星期天點雜交法（Dotblot）將被檢測標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準確方便，有多種多管吸印儀如Bio-Dot(Bio–Rad)，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。第74頁,共167頁，2024年2月25日，星期天凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。第75頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1.核酸雜交重組克隆與探針雜交。2.檢測用的探針與外源DNA插入片段互補的序列。3.識別標記（1）放射性同位素：32P或125I。（2）非放射性標記：熒光素一、原理第76頁,共167頁，2024年2月25日，星期天酶切前酶切后插入片段載體載體載體重組體重組體第77頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)免疫化學檢測法對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白—蛋白“雜交”利用抗體作為“探針”，檢測轉入受體菌并且表達出相應的蛋白質(zhì)的外源基因。第78頁,共167頁，2024年2月25日，星期天一、放射性抗體檢測法1.抗體與產(chǎn)物的結合方式根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：第79頁,共167頁，2024年2月25日，星期天待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標記的二抗結合蛋白固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗125I標記的二抗固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標記的二抗結合蛋白125I標記的二抗第80頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.放射性抗體檢測法過程第81頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3.Broome-Gilbert雙位點檢測法檢測融合蛋白既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物第82頁,共167頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)?；駻插入基因B表達質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白第83頁,共167頁，2024年2月25日，星期天固相支持濾膜抗A抗體125I標記的抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光第84頁,共167頁，2024年2月25日，星期天二、免疫沉淀檢測法1.原理利用抗原—抗體凝集反應。用于檢測分泌型產(chǎn)物。第85頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.方法把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當插入基因的表達產(chǎn)物被細菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應形成“沉淀圈”。對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。第86頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第87頁,共167頁，2024年2月25日，星期天三、酶聯(lián)免疫吸附測（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理一抗（primaryantibody）與目標分子的特異結合二抗（secondaryantibody）與一抗的特異性結合酶連（enzyme-linke）二抗上攜帶一種酶能催化一種反應將無色的底物轉變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標分子的含量。第88頁,共167頁，2024年2月25日，星期天待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶

待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶

第89頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.ELISA檢測的一般步驟（1）固定樣品將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。第90頁,共167頁，2024年2月25日，星期天孔底第91頁,共167頁，2024年2月25日，星期天（2）一抗結合加入一抗，反應后沖洗掉未結合的抗體第92頁,共167頁，2024年2月25日，星期天一抗第93頁,共167頁，2024年2月25日，星期天（3）二抗結合加入二抗，與一抗結合后再將未結合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。第94頁,共167頁，2024年2月25日，星期天二抗第95頁,共167頁，2024年2月25日，星期天（4）顯色反應加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應轉變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。第96頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第97頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖ELISAassay第98頁,共167頁，2024年2月25日，星期天（5）比色在特殊的分光光度儀（酶標儀）上比色，打印出結果。第99頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖Safire多功能掃描型酶標儀第100頁,共167頁，2024年2月25日，星期天3.ELISA的局限性有效，但準確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonalantibody）第101頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第102頁,共167頁，2024年2月25日，星期天臨床檢驗常用的單抗第103頁,共167頁，2024年2月25日，星期天四、免疫印跡法（westernblotting）在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶第104頁,共167頁，2024年2月25日，星期天1.原理（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）①SDS是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結合，使蛋白質(zhì)帶上負電荷②聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大小（鏈的長短），從而把不同分子量的肽鏈分開。第105頁,共167頁，2024年2月25日，星期天電泳buffer電泳buffer圖電泳槽第106頁,共167頁，2024年2月25日，星期天點樣電泳方向圖第107頁,共167頁，2024年2月25日，星期天③蛋白質(zhì)電泳的分子量標準已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計。商品化供應道爾頓(質(zhì)量單位,等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓第108頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第109頁,共167頁，2024年2月25日，星期天Dalton第110頁,共167頁，2024年2月25日，星期天④凝膠中的蛋白質(zhì)染色：1）直接染色考馬斯亮藍：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉到膜上進行染色。第111頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖直接染色電泳結果第112頁,共167頁，2024年2月25日，星期天（2）Westernblotting①Western（轉膜）電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉的方法，轉到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）第113頁,共167頁，2024年2月25日，星期天膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉移到正極一側的膜上第114頁,共167頁，2024年2月25日，星期天膜膠蛋白第115頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖Western裝置第116頁,共167頁，2024年2月25日，星期天②Blotting原理與ELISA相同。辣根過氧化物酶：HRPO第117頁,共167頁，2024年2月25日，星期天待測蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過氧化物酶底物產(chǎn)物，并發(fā)出光PAGE膠待測蛋白底片曝光第118頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第119頁,共167頁，2024年2月25日，星期天③Blotting過程1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與膜上的蛋白結合。2）洗去未結合的一抗。3）用二抗與一抗結合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。ImmunoBlotting第120頁,共167頁，2024年2月25日，星期天④結果第121頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖單抗blotting結果第122頁,共167頁，2024年2月25日，星期天圖多克隆抗體Blotting的結果第123頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)翻譯篩選法借助無細胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預期。適用于mRNA轉錄豐度高的外源基因。第124頁,共167頁，2024年2月25日，星期天一、無細胞翻譯系統(tǒng)能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細胞提取物。如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細胞提取物系統(tǒng)。第125頁,共167頁，2024年2月25日，星期天二、轉譯篩選與預期的產(chǎn)物分子量相符？第126頁,共167頁，2024年2月25日，星期天mRNA無細胞翻譯系統(tǒng)35S標記的甲硫氨酸翻譯35S標記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性帶紋的位置載體+外源DNA轉錄第127頁,共167頁，2024年2月25日，星期天三、雜交抑制轉譯法1.原理mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉譯被抑制）。第128頁,共167頁，2024年2月25日，星期天單鏈mRNA核糖體小亞基核糖體大亞基能翻譯mRNADNA核糖體小亞基核糖體大亞基不能翻譯第129頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.過程第130頁,共167頁，2024年2月25日，星期天四、雜交釋放轉譯法1.原理在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對應的mRNA，進行體外轉錄。研究其轉錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。第131頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.過程第132頁,共167頁，2024年2月25日，星期天硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA總mRNAcDNA基因的mRNA雜交洗脫cDNA基因的mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編碼的蛋白硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA收集35S標記的氨基酸第133頁,共167頁，2024年2月25日，星期天五、DNA-蛋白質(zhì)相互作用篩選法專門設計檢測能同DNA特異結合的蛋白質(zhì)因子。第134頁,共167頁，2024年2月25日，星期天待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結合的DNA序列放射性標記待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結合的DNA序列放射性標記第135頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第七節(jié)真核重組基因的選擇方法一、哺乳動物基因轉移的選擇標記1.胸苷激酶（thymidinekinase,tk）（1）TK選擇原理①四氫葉酸的必要性真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。第136頁,共167頁，2024年2月25日，星期天二氫葉酸還原酶

dihydrofolatereductase，DHFR二氫葉酸四氫葉酸DHFR第137頁,共167頁，2024年2月25日，星期天②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：第138頁,共167頁，2024年2月25日，星期天dUMP

dATP

TTP

dCTP

氨甲喋啉

抑制

抑制

第139頁,共167頁，2024年2月25日，星期天③次黃嘌呤的補救作用細胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP。④胸苷酸激酶的補救作用TK+細胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成TTP，存活。第140頁,共167頁，2024年2月25日，星期天TtkdUMP

dATP

TTP

dCTP

次黃嘌呤

補救

氨甲喋啉

抑制

抑制

第141頁,共167頁，2024年2月25日，星期天（2）TK選擇過程①HAT培養(yǎng)基含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）②宿主細胞

Tk-

細胞株③載體標記

TK基因，只有轉入TK基因的細胞才能生存。第142頁,共167頁，2024年2月25日，星期天第143頁,共167頁，2024年2月25日，星期天2.二氫葉酸還原酶基因（DHFR）（1）選擇原理①二氫葉酸還原酶的必要性真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。第144頁,共167頁，2024年2月25日，星期天dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸第145頁,共167頁，2024年2月25日，星期天二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶第146頁,共167頁，2024年2月25日，星期天DHFR+細胞DHFR+細胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存不需要補救！第147頁,共167頁，2024年2月25日，星期天DHFR-

細胞DHFR-

細胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。需要補救！第148頁,共167頁，2024年2月25日，星期天②胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補救:第149頁,共167頁，2024年2月25日，星期天dUMPdATPTTPdATP次黃嘌呤補救胸苷補救第150頁,共167頁，2024年2月25日，星期天（2）選擇過程①宿主細胞DHFR-細胞株（不能在無核苷酸的培養(yǎng)基中生長）。需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救?、跓o核苷酸的培養(yǎng)基透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補救。第151頁,共167頁，2024年2月25日，星期天③氨甲喋呤“加壓”添加少量氨甲喋啉抑