中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識

中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷共識2013V1.0中國ALK融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌診斷共識目的：提高我國ALK融合基因型肺癌的個體化精準(zhǔn)治療能力

（precisiontherapy）非小細(xì)胞肺癌的個體化靶向治療：伴隨分子診斷是前提雖然ALK融合基因陽性患者僅占NSCLC的5%，但是總體患者負(fù)荷較大，治療需求迫切ALK融合基因陽性NSCLC具有獨(dú)特臨床&病理、治療和預(yù)后特征，已成為NSCLC中的一個分子亞型第一個ALK抑制劑克唑替尼已獲得SFDA的批準(zhǔn)（2013.01）中國ALK融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌診斷共識總體原則綜合肺癌獲取的各類生物材料的特征、分子分析方法的特點(diǎn)、實驗室自身條件，需要多學(xué)科大協(xié)作，合理采取有效檢測方法和流程，以保證ALK融合型肺癌的檢出率和準(zhǔn)確率從臨床診斷角度出發(fā)，綜合最新的研究數(shù)據(jù)，并結(jié)合SFDA批準(zhǔn)的伴隨診斷方法，定期更新，保證檢測結(jié)果的可信性和臨床實際可操作性ALKprevalenceinChinaAuthorALKincidencePublicationsZhangX,WuYLetal.11.6%(12/103)MolCancer2009Wong,etal.(Hongkong)4.9%(13/265)Cancer2009LiH,ChenHQ,etal.3.0%(7/230smokers,AC)LungCancer2012SunY,ChenH,JiH,etal.5.8%(3/52surgicalAC,non-smokers)JCO2010WuSG,YangPC,etal.(Taiwan)34%(39/116,AC,WTEGFR)JTO2012RikovaK,etal4.7%(6/137)Cell2007WangZ,WangJ,etal.9.7%(11/113,StageIV)Oncology2012RenS,ZhouC,etal.9.6%(10/104,Female,AC,non-smoker)CellBiochemBiophys.2012;Cancer2012[GLCIinternaldata:7%(70/977);7.7%(31/400)]ALK陽性NSCLC總患者數(shù)約為HER2陽性乳腺癌患者的70%，CML患者的3倍多ALK陽性腫瘤患者34,820例乳腺癌HER2陽性患者49,631例驅(qū)動突變腫瘤的每年發(fā)病數(shù)中國腫瘤登記年報，2012CML10,000例左右中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的定義ALK檢測適宜人群ALK檢測診斷流程專家共識中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的定義ALK檢測適宜人群ALK檢測診斷流程專家共識ALK陽性vsEGFR突變vsNSCLC病因臨床&病理特征患者預(yù)后治療方法ALKvsEGFR：不同的驅(qū)動基因EML4EML4–ALKvariant1HELP1496981WDBasic14961059110581620TMKinaseALKEML4–ALK變體1激酶ALK融合基因驅(qū)動EGFR突變驅(qū)動臨床&病理特征：ALK融合vsEGFR突變特征EGFREML4/ALK組織學(xué)腺癌TTF1+腺癌TTF1+亞型非粘液型粘液型吸煙狀態(tài)不吸煙不吸煙人種東亞所有人種發(fā)病年齡66y52y性別女性男>女ALK陽性NSCLC與EGFR突變NSCLC與EGFR突變患者相比，ALK陽性NSCLC患者發(fā)病年齡更輕，更偏重于男性AT.Shaw,etal.JClinOncol.2009;27:4247-4253CharacteristicALK(n=19)EGFR(n=31)WT/WT(n=91)PNo.%No.%No.%ALKvEGFRALKvWT/WTAge,yearsMedianRange5229-766636-906429-87

<.001<.005SexMaleFemale1185842823267429623268.036.039SmokinghistoryNeversmokerLightsmokerSmoker1450742602164681913241552261657.366<.001EthnicityAsianNon-Asian0190100229694784892.519.602PathologyAdenoBAC?AdenosquamousSquamousLargecell/NOS1621008411500247000772300049323255435326.380*.686*與EGFR突變?nèi)巳合啾龋珹LK融合人群年齡更輕ALK融合與EGFR突變NSCLC的病理類型不同分型病例數(shù)EGFR突變Marchettietal.非粘液型粘液型691722（32）0（0）Tametal非粘液型粘液型19515（79）0（0）Sakuma,etal非粘液型粘液型17915（88）2（22）ClinCancerRes2009：20例發(fā)現(xiàn)ALK融合的肺腺癌中82%病例的癌細(xì)胞中包含粘液成分71%病例中，>10%的腫瘤細(xì)胞中含大量粘液成分ALKTRIBUTE研究亞組分析：EGFR突變患者預(yù)后較好ALK陽性NSCLC患者的預(yù)后更差A(yù)LK陽性vsALK陰性YangP,etal.JThoracOncol.2012;7:90–97YearssincediagnosisPFS/RFS曲線FISH(positive)versusFISH(negative)YearssincediagnosisPFS/RFS曲線IHC3(positive)versusIHC0/1(negative)ALK陽性vsEGFR突變vsNSCLCALK陽性EGFR突變驅(qū)動基因ALK融合基因EGFR突變臨床&病理特征年輕、腺癌（粘液型）、不吸煙東亞裔、腺癌（粘液型）、不吸煙患者預(yù)后差好治療方法克唑替尼EGFR-TKIsALK陽性非小細(xì)胞肺癌已成為NSCLC特定的亞型不同的驅(qū)動基因不同的患者預(yù)后不同的治療方法不同的臨床&病理特征AT.Shaw,etal.JClinOncol,2009中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識專家組推薦命名：根據(jù)專家的討論，從檢測方法學(xué)角度考慮到ALK融合型肺癌不僅是基因序列層面的改變，ALK融合蛋白也是該類疾病中的重要變異，因此將此類疾病統(tǒng)稱為ALK陽性非小細(xì)胞肺癌中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識專家組推薦定義：ALK陽性非小細(xì)胞肺癌：是指包括ALKFISH檢測陽性、ALK序列融合變異或ALK融合蛋白表達(dá)陽性的肺癌，腫瘤細(xì)胞中存在ALK融合基因表達(dá)，是非小細(xì)胞肺癌的一個分子亞型，常見于腺癌，該類患者通?？蓮腁LK抑制劑治療中獲益。中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的定義ALK檢測適宜人群ALK檢測診斷流程專家共識是否需要富集人群檢測ALK：EGFR突變？EGFR與ALK雙突變的存在：5%-13%EURTAC研究中：雙突變概率15.8%（RT-PCR法）有文獻(xiàn)報道，雙突變患者克唑替尼治療有效是否需要富集人群：臨床因素如果按照臨床因素富集，將漏診33%（2/6）的ALK陽性患者YoshikoMurakami,etal.FrontiersinOncology.2012;doi:10.3389/fonc.2012.00024是否需要富集人群：病理因素如按病理因素富集：可能會遺漏30%(5/17)的ALK陽性患者中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識ALK檢測適宜人群——專家組推薦：可優(yōu)先在病理組織學(xué)特點(diǎn)富集的優(yōu)勢患者中進(jìn)行ALK分子檢測但單純依靠臨床特征與病理分型選擇適宜人群并不能完全包括所有的ALK陽性NSCLC患者，對于潛在懷疑存在ALK融合變異的患者均可進(jìn)行ALK融合基因檢測中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識ALK檢測適宜人群——專家組推薦：可優(yōu)先在病理組織學(xué)特點(diǎn)富集的優(yōu)勢患者中進(jìn)行ALK分子檢測但單純依靠臨床特征與病理分型選擇適宜人群并不能完全包括所有的ALK陽性NSCLC患者，對于潛在懷疑存在ALK融合變異的患者均可進(jìn)行ALK融合基因檢測中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的定義ALK檢測適宜人群ALK檢測診斷流程專家共識NSCLC活檢組織標(biāo)本陰性或未知；據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)§新鮮標(biāo)本VentanaIHC常規(guī)IHC檢測*

陽性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突變且使用EGFR-TKIs后出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)耐藥的患者石蠟標(biāo)本3+/2+/1+陰性ALK陽性非小細(xì)胞肺癌EGFR突變檢測中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識ALK檢測流程圖——專家組推薦：適合ALK融合基因診斷的腫瘤樣本，包括各種組織樣本和細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。組織標(biāo)本獲取手段包括手術(shù)標(biāo)本、支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺、淋巴結(jié)活檢、手術(shù)活檢等對于惡性胸腔積液、心包積液、痰液或支氣管灌洗液、細(xì)胞學(xué)穿刺和外周血腫瘤細(xì)胞等樣本，在細(xì)胞數(shù)量充足條件下可制備細(xì)胞學(xué)樣本蠟塊（cellblock），檢測方法可采用FISH或IHC如果是新鮮細(xì)胞標(biāo)本可考慮采用特異性PCR方法。考慮到細(xì)胞學(xué)樣本的細(xì)胞數(shù)量少等特點(diǎn)，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的檢測結(jié)果解釋需格外謹(jǐn)慎NSCLC活檢組織標(biāo)本陰性或未知；據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)§新鮮標(biāo)本VentanaIHC常規(guī)IHC檢測*

陽性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突變且使用EGFR-TKIs后出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)耐藥的患者石蠟標(biāo)本3+/2+/1+陰性ALK陽性非小細(xì)胞肺癌EGFR突變檢測采用高靈敏度的檢測系統(tǒng)后，有越來越多的數(shù)據(jù)支持使用IHC作為初步篩查靈敏度和特異度都可達(dá)到100％，但是不同研究間有差異與FISH相比，IHC是一種更常規(guī)的技術(shù)，成本更低，且工作強(qiáng)度也更低ALKIHCFISH患者1：IHC顯示ALK強(qiáng)表達(dá)，F(xiàn)ISH顯示重排患者2：IHC顯示無ALK表達(dá)，F(xiàn)ISH顯示無重排IHC用于檢測ALK表達(dá)Mino-Kenudsonetal.,ClinCancerRes2010;16:1561–1571.常規(guī)IHC的抗體選擇常規(guī)IHC敏感性高（假陰性率低），特異性低（假陽性高），因此建議IHC陽性患者（無論1+，2+，3+）均需FISH、RT-PCR、VentanaIHC確診）EThunissen,etal.VirchowsArch(2012)461:245-257常規(guī)IHC與FISH的吻合性良好研究病例數(shù)FISHIHC3+IHC2+IHC1+IHC0Yi2011101陽性8110陰性022069Paik2011640陽性22600陰性01016586Park2012262陽性91150陰性021234JH,Paik2012735陽性151300陰性0720680XHan119陽性37710陰性21566Total1857陽性913870陰性222621635A.J.Weickhardt,etal.Cancer.2012Dec20.doi:10.1002/cncr.27913Total1857陽性913870陰性222621635價格便宜，適合于NSCLC患者的篩選操作流程簡單、易行判讀標(biāo)準(zhǔn)主觀操作流程需標(biāo)準(zhǔn)化優(yōu)勢IHC（3+）與FISH（+）符合率98%劣勢IHC（2+）與FISH（+）符合率63%IHC（+）與FISH（+）符合率10%IHC（-）與FISH（-）符合率100%ALK常規(guī)IHC與克唑替尼療效存在相關(guān)性EL.Kwak,etal.NEnglJMed2010;363:1693-1703IHC陽性，F(xiàn)ISH陰性克唑替尼治療有效54歲，女性，腺癌IHC陽性（左圖）FISH陰性（右圖）ROS1與cMET均陰性Crizotinib250mgbid治療有效，腫瘤PRJMSun,etal.JThoracicOncol,2012CaseReportIASLC/CAP/AMP，2013

肺癌分子檢測指南ALKIHC檢測，如經(jīng)過仔細(xì)確認(rèn)，可考慮作為ALKFISH診斷前的篩選方法NILindeman,etal.2012CAP,doi:10.5858/arpa.2012-0720-OA常規(guī)手動IHC注意事項及判讀標(biāo)準(zhǔn)“采用IHC法需注意以下兩點(diǎn)。第一，由于ALK的蛋白表達(dá)與神經(jīng)外胚層的分化有關(guān)，故其可能在小細(xì)胞肺癌和正常人的腦組織中存在表達(dá)。因此，不建議在小細(xì)胞肺癌中使用ALK融合蛋白的IHC檢測。第二，IHC的陽性標(biāo)準(zhǔn)判定尚未統(tǒng)一。常規(guī)IHC判讀標(biāo)準(zhǔn)如下：IHC3+：>5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒狀細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)著色；IHC2+：>5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)中度細(xì)胞質(zhì)著色；IHC1+：>5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)微弱或模糊的細(xì)胞質(zhì)著色或≤5%的腫瘤細(xì)胞有任何程度的著色；IHC0：腫瘤細(xì)胞無著色?！盓Thunissen,etal.VirchowsArch(2012)461:245-257NSCLC活檢組織標(biāo)本陰性或未知；據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)§新鮮標(biāo)本VentanaIHC常規(guī)IHC檢測*

陽性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突變且使用EGFR-TKIs后出現(xiàn)原發(fā)或繼發(fā)耐藥的患者石蠟標(biāo)本3+/2+/1+陰性ALK陽性非小細(xì)胞肺癌EGFR突變檢測ALK分離探針FISH原理3-ALK探針雜交端粒的斷點(diǎn)大約是300KB，并用橘色熒光標(biāo)示。5-ALK探針雜交著絲粒的斷點(diǎn)大約是442kb，并用綠色熒光標(biāo)示。VysisALKBreakApartFISHProbeKit.06N38-020,30-608495/R2FISH診斷橘紅色與綠色探針相互臨近或粘合：ALK陰性橘紅色與綠色探針相互分離或單個橘紅色探針：ALK陽性FISH檢測的局限性結(jié)果判讀需標(biāo)準(zhǔn)化，必需經(jīng)過培訓(xùn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行判讀晚期患者小活檢標(biāo)本(2mm)，很難保證每個視野存在50個癌細(xì)胞價格昂貴，2600元左右/例，無法適用于篩選FISH檢測的優(yōu)勢目前，臨床研究的結(jié)果均是以FISH為檢測手段Falsepositivityvsfalsenegativity....Split-signalFISH:Fusion-signalFISH:Translocation-positiveTranslocation-negativeFalse-positiveFalse-negativeMicroscope:Sle/nucleus:Slide:在ALK融合陰性的患者，免疫組化顯示無ALK表達(dá)。RT-PCRFISH：進(jìn)行VysisLSIALK雙色打散FISH探針檢測到ALK融合（分裂的紅色和綠色信號）。對AmoyDxEML4-ALK融合基因檢測，實時RT-PCR顯示deltaRn對PCR循環(huán)數(shù)的變化。在ALK融合陽性的患者，免疫組化顯示ALK表達(dá)。RT-PCR臨床檢測數(shù)據(jù)：腺癌發(fā)生率7.7%CharacteristicsEML4-ALKMutation,N(%)Wildtype,N(%)PAge,years≥60<609(3.6)19(7.9)240(96.4)220(92.1)0.040SexMaleFemale9(3.1)19(9.8)286(96.9)174(90.2)0.002StageIAIBIIAIIBIIIAIIIBIV12(9.0)4(2.9)2(33.3)1(2.3)9(5.5)00122(91.0)132(97.1)4(66.7)42(97.7)156(94.5)130.036bHistopathologyADSCCAD-SCCeOthers25(7.2)2(2.0)1(5.6)0324(92.8)99(98.0)17(94.4)200.053dDifferentiationPoorGoodUnidentified8(6.3)17(5.0)3(12.5)119(93.7)320(95.0)21(87.5)0.594SmokingstatusNoYesUnknown21(8.2)4(2.6)3(4.0)236(91.8)152(97.4)72(96.0)0.021fProbailityofdisease-freesurvival1.00.80.60.40.20.06.018.012.024.0Time(months)Logrank,P=0.006ALK–positiveALK–negativeJ.X.Zhou，etal.AnnalsofOncology00:1–7,2012doi:10.1093/annonc/mds626多重RT-PCR測序EML4-ALK變異體的多種引物，GAPDH作為對照GLCI內(nèi)部數(shù)據(jù)：所有12個ALK融合陽性樣品均通過多路RT-PCR測序技術(shù)得以證實。國家藥品食品管理局（SFDA）已批準(zhǔn)的可用于臨床的ALK融合基因檢測的試劑盒（人類EML4-ALK融合基因檢測試劑盒，熒光PCR方法）VentanaIHC試劑設(shè)計ALK融合蛋白:無ALK重排的NSCLC不表達(dá)ALK融合蛋白部分ALK融合蛋白表達(dá)較低VentanaIHC的原理:使用具有高度敏感性和特異性的一抗——D5F3全自動儀操作，充分保證特異性獨(dú)有Optiview擴(kuò)增技術(shù)，充分保證敏感性D5F3rabbittmonoclonalantibodyOptiviewDABIHCDetectionOptiviewAmplificationKitFISH陽性標(biāo)本使用IHC檢測全自動VentanaIHC：信號擴(kuò)增常規(guī)IHC：無信號擴(kuò)增D5F3rabbitmAbControlrabbitmAbALK-positiveNSCLCbyVysisFISHandVentanaALKIHCALK(+)病例全自動VentanaIHC判讀標(biāo)準(zhǔn)簡單，僅存在陰性or陽性的判讀IHC陽性=FISH陽性ECMinca,etal.JMolDiag,2013全自動VentanaIHC價格便宜，可同時用于ALK的篩選和診斷EMEA（歐盟）批準(zhǔn)VentanaIHC用于診斷ALK陽性NSCLC，從而幫助確定可使用克唑替尼的患者中國患者檢測價格預(yù)估<250元/例ALK陽性NSCLC診斷方法專家推薦ALKFISH、VentanaIHC或基于序列特異性的PCR技術(shù)均可作為ALK陽性肺癌的診斷技術(shù)，檢測實驗室應(yīng)該根據(jù)組織標(biāo)本類型選擇合適的檢測技術(shù)。當(dāng)懷疑一種技術(shù)的可靠性時（如FISH的腫瘤細(xì)胞融合率接近15％時），可以考慮采用另一種技術(shù)加以驗證。日本肺癌協(xié)會ALK診斷共識YoshikoMurakami,etal.FrontiersinOncology.2012;doi:10.3389/fonc.2012.00024歐洲11家中心病理科ALK診斷共識ThunnissenE,etal.VirchowsArch.2012;461:245–257中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識ALK檢測流程圖總體原則：可考慮非排他性地優(yōu)先檢測部分潛在ALK陽性率較高的病理學(xué)特征富集的肺癌患者（如粘液型或含印戒細(xì)胞腺癌患者、EGFR基因狀態(tài)為野生型的腺癌）對于適合檢測的腫瘤標(biāo)本可選擇直接采用FISH或RT-PCR方法或VentanaIHC進(jìn)行分子檢測診斷對于EGFR基因狀態(tài)未知，或EGFR突變患者在EGFR-TKIs治療后原發(fā)或繼發(fā)耐藥的患者，由于存在EGFR和ALK雙陽性的可能，因此也建議行ALK融合的檢測中國ALK陽性非小細(xì)胞肺癌診斷專家共識ALK檢測流程圖總體原則：可考慮非排他性地優(yōu)先檢測部分潛