第8章 酵母基因工程課件

第八章

酵母基因工程第8章酵母基因工程主要內(nèi)容第一節(jié)

酵母基因工程表達體系酵母基因表達宿主系統(tǒng)酵母菌表達載體酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第二節(jié)

常見的酵母基因表達系統(tǒng)第三節(jié)

影響外源基因表達的因素第四節(jié)

酵母基因工程應用舉例第8章酵母基因工程第一節(jié)酵母基因表達體系——宿主系統(tǒng)酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔子菌綱、半知菌類，共由56個屬和500多個種組成。酵母菌是比較成熟的真核生物表達系統(tǒng)。第8章酵母基因工程作為宿主細胞的酵母需滿足的基本要求①安全無毒，沒有致病性。②遺傳背景清楚，容易進行遺傳操作。③外源DNA容易導入宿主細胞，轉(zhuǎn)化效率高。④培養(yǎng)條件簡單，容易進行高密度發(fā)酵。⑤有較強的蛋白質(zhì)分泌能力。⑥有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工能力。第8章酵母基因工程酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢①全基因組測序，基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作簡便②能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中③具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)④大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉⑤不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認定為安全的基因工程受體系統(tǒng)⑥酵母菌是最簡單的真核模式生物第8章酵母基因工程常用的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達和研究的酵母菌包括：釀酒酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵亞母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）假絲酵母屬如產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe），解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）其中釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達外源基因最理想。第8章酵母基因工程酵母菌表達宿主系統(tǒng)（1）釀酒酵母優(yōu)點：釀酒酵母長期廣泛地應用于食品工業(yè)，不產(chǎn)生毒素，安全性好，已被FDA認定為安全性生物，其表達產(chǎn)物不需經(jīng)過大量宿主安全性實驗生長迅速，工藝簡單，成本低是真核生物，可以對蛋白進行翻譯后加工表達產(chǎn)物可分泌表達，易于純化遺傳背景清楚，易進行操作第8章酵母基因工程酵母菌表達宿主系統(tǒng)釀酒酵母的缺點：發(fā)酵時會產(chǎn)生乙醇，難以進行高密度發(fā)酵，直接導致外源基因很難達到很高的水平缺乏強有力的受嚴格調(diào)控的啟動子，分泌的蛋白質(zhì)能力較差釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌表達菌株傳代不穩(wěn)定，表達質(zhì)粒易丟失分泌效率低，大于30KD的蛋白質(zhì)幾乎不分泌第8章酵母基因工程酵母菌表達宿主系統(tǒng)（2）乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng)可以高密度發(fā)酵，不需要甲醇防爆裝置，工業(yè)化生產(chǎn)時不降低生產(chǎn)率及酵母菌的再繁殖能力。乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達系統(tǒng)。第8章酵母基因工程酵母菌表達宿主系統(tǒng)（3）產(chǎn)朊假絲酵母食品及藥品工業(yè)的安全生物不具有酵解抑制有氧氧化效應，因而在嚴格好氣的條件下不會產(chǎn)生乙醇發(fā)酵密度高，在高密度發(fā)酵中細胞干重可以達到92g/L在廉價的糖蜜中就能生產(chǎn)，成本低第8章酵母基因工程酵母菌表達宿主系統(tǒng)（4）栗酒裂殖酵母裂殖酵母是子囊菌真核單細胞生物，是一類不能出芽生殖而只能以分裂和產(chǎn)孢子的方式繁殖的一類酵母。與其他酵母相比，它具有更多的與高等真核生物相似的特性：線粒體結(jié)構，啟動子結(jié)構，轉(zhuǎn)錄機制，對蛋白N-端乙?；δ芫咏诓溉閯游锛毎Ｒ延卸喾N蛋白利用此系統(tǒng)進行了表達，如人蛋白凝血因子VIIIa，人白細胞介素IL-6等。第8章酵母基因工程酵母菌表達宿主系統(tǒng)（5）巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在甲醇培養(yǎng)基中生長，甲醇可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達。表達系統(tǒng)優(yōu)勢：生長迅速、強啟動子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可誘導表達。由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復制型載體，所以外源基因序列一般整合入受體的染色體DNA上。其外源基因的高效表達在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有20余種具有經(jīng)濟價值的重組蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達。第8章酵母基因工程酵母表達載體酵母質(zhì)粒載體既可以在大腸桿菌復制與擴增、又可以在酵母系統(tǒng)中復制與擴增，故此類載體又稱為穿梭載體（shuttlevector）。酵母菌-大腸桿菌穿梭表達載體是由來自酵母的部分核酸序列和細菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復制的起點序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，這兩個部分主要是作為在大腸桿菌宿主時增殖和篩選組分。酵母部分包括酵母轉(zhuǎn)化子的篩選組分，主要是與宿主互補的營養(yǎng)缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及編碼特定蛋白的基因啟動子和終止子序列。第8章酵母基因工程酵母表達載體1．酵母載體的基本結(jié)構DNA復制起始區(qū)：通常來自于2μ質(zhì)粒的復制起始區(qū)及酵母基因組的自主復制序列篩選標記：營養(yǎng)缺陷型篩選或者抗性篩選整合介導區(qū):能有效介導載體與宿主之間發(fā)生同源重組有絲分裂穩(wěn)定區(qū)表達盒：啟動子，分泌信號序列，終止子第8章酵母基因工程酵母表達載體釀酒酵母中的2μ環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達50至100個。IRs反向重復序列，600bpFLP編碼產(chǎn)物驅(qū)動IRs的同源重組REP編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性STBREP的結(jié)合位點接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等均與2μ質(zhì)粒類似。第8章酵母基因工程酵母表達載體2．酵母載體的種類酵母載體按照用途不同可分為克隆載體和表達載體兩類酵母克隆表達載體根據(jù)其在酵母中復制形式來分類。分為下列五類：酵母整合型質(zhì)粒YIp酵母附加體質(zhì)粒YEp酵母復制型質(zhì)粒YRp酵母著絲粒質(zhì)粒YCp酵母人工染色體YAC第8章酵母基因工程酵母表達載體（1）酵母整合型質(zhì)粒YIp：缺乏酵母的復制起始位點，不能在酵母中自主復制，含有酵母的篩選標記ura3基因。具有整合介導區(qū)，所以，它只有整合到酵母染色體中才能穩(wěn)定。

含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構建在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標記基因，構建出來的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。第8章酵母基因工程酵母表達載體（2）酵母附加體質(zhì)粒YEp：含有釀酒酵母2μ質(zhì)粒DNA復制有關的序列，該載體在酵母細胞中穩(wěn)定，拷貝數(shù)可達60-100。轉(zhuǎn)化效率高。（3）酵母復制型質(zhì)粒YRp：含有來源于酵母的DNA復制起始區(qū)(ARS)，能在酵母染色體外自主復制的一種自主復制型載體，雖然其轉(zhuǎn)化效率高，在宿主的拷貝數(shù)可以達上百個。ARS為酵母菌中的自主復制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。以ARS為復制子的質(zhì)粒稱為YRp，以2μ質(zhì)粒上的復制元件為復制子的質(zhì)粒稱為YEp上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達200個，但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。第8章酵母基因工程酵母表達載體（4）酵母著絲粒質(zhì)粒YCp：含有酵母染色體著絲粒的DNA片段，這種載體在細胞分裂過程中，在母細胞和子細胞之間平均分配，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性(d)。CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關的序列,將CENDNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp.YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1-5個。第8章酵母基因工程酵母表達載體（5）酵母人工染色體YAC：酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。YAC具有自主復制序列（ARS）、著絲粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標記基因。YAC載體在宿主細胞中以線性雙鏈DNA存在，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點?？山邮?00-1000kb的外源DNA片段。第8章酵母基因工程酵母表達載體YAC主要結(jié)構：①兩個可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌著絲粒序列(centromere4,CEN4)；③一個自主復制序列(ARS1)；④兩個來自嗜熱四膜蟲(Tetrahymennathermophilp)的末端重復序列(TEL)，以保持重組YAC為線狀結(jié)構；⑤在兩個末端序列中間，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在細菌細胞中穩(wěn)定擴增；⑥Ampr抗性及細菌質(zhì)粒復制原點；⑦一個EcoRⅠ克隆位點，該位點位于酵母菌Sup4tRNA基因內(nèi)。第8章酵母基因工程酵母菌轉(zhuǎn)化方法原生質(zhì)球法：酶解酵母細胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，原生質(zhì)體在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允許DNA進入，然后使原生質(zhì)球再生新的細胞壁?？梢詫崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子可達原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。

Li+鹽轉(zhuǎn)化方法：釀酒酵母的完整細胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）處理后，在PEG存在下和熱休克之后可高效吸收質(zhì)粒DNA。醋酸鋰對釀酒酵母有效，對畢赤酵母無效，畢赤酵母轉(zhuǎn)化一般用氯化鋰有效優(yōu)點：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA（相差80倍）第8章酵母基因工程酵母菌轉(zhuǎn)化方法電擊轉(zhuǎn)化法：原理是通過利用高壓電脈沖作用，造成細胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，形成可逆的瞬間通道，不僅有利于離子和水進入細胞，也有利于外源DNA等大分子進入優(yōu)點：不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件；適用范圍廣；轉(zhuǎn)化率高（達105/μgDNA）。PEG轉(zhuǎn)化法：PEG1000聚乙二醇英文名polyethyleneglycol化學結(jié)構：第8章酵母基因工程酵母菌轉(zhuǎn)化方法用于轉(zhuǎn)化子篩選的標記基因(1)營養(yǎng)缺陷型的互補基因營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA等但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難(2)顯性標記基因——其編碼產(chǎn)物主要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白第8章酵母基因工程酵母菌轉(zhuǎn)化方法:顯性標記基因標記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型aph氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶抗G418cat氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗氯霉素dhfr二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1銅離子螯合物耐受銅離子suc2蔗糖轉(zhuǎn)化酶耐受高濃度蔗糖ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑第8章酵母基因工程第二節(jié)常見的酵母基因表達系統(tǒng)一、釀酒酵母表達系統(tǒng)1．啟動子組成型表達的啟動子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）啟動子、甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH或GAPl）啟動子可控性啟動子：半乳糖啟動子（GAL）、酸性磷酸酶啟動子（PHO）、乙醇脫氫酶（ADH2）啟動子、Cu2+螯合蛋白啟動子（CUPI）以及交配a型阻遏系統(tǒng)（MATa/a）第8章酵母基因工程第8章酵母基因工程釀酒酵母表達載體目前已建立的釀酒酵母表達載體有（1）酵母附加體質(zhì)粒(YEp)（見右圖）；（2）酵母復制型質(zhì)粒(YRp)；（3）酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp)；（4）酵母整合型質(zhì)粒(YIp)；（5）酵母人工染色體(YAC)。前三類統(tǒng)稱為游離自主復制型質(zhì)粒載體。含有來自酵母基因組的復制起始區(qū)ARS或者酵母天然質(zhì)粒2μ復制起點序列，能夠自主復制，通常為多拷貝數(shù)第8章酵母基因工程釀酒酵母宿主——突變株有些蛋白酶缺陷有利于重組異源蛋白的穩(wěn)定表達。如pep4-3突變株中蛋白酶的活性顯著降低，對外源基因表達產(chǎn)物的降解作用較小。為了減少目的蛋白的過度糖基化，目前已從野生型的釀酒酵母中分離出許多類型的糖基化途徑突變株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突變株、天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷的alg突變株以及外側(cè)糖鏈缺陷型的och突變株等。在這些突變株中，具有重要實用價值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因為它們不能在異源蛋白的天門冬酰胺側(cè)鏈上延長甘露多聚糖長鏈。第8章酵母基因工程提高重組蛋白表達產(chǎn)率的突變宿主菌突變類型生物效應作用位點ssc1改善重組蛋白分泌鈣離子依賴型的ATP酶ssc11改善重組蛋白分泌羧肽酶Yssc2提高重組蛋白表達轉(zhuǎn)錄后加工rgr1提高重組蛋白表達轉(zhuǎn)錄水平ose1提高重組蛋白表達轉(zhuǎn)錄水平rho-提高重組蛋白表達轉(zhuǎn)錄水平第8章酵母基因工程抑制超糖基化作用的突變宿主菌許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。能抑制超糖基化的突變類型突變類型生物效應mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型och外側(cè)糖鏈添加缺陷型第8章酵母基因工程二、畢赤酵母表達系統(tǒng)

1.啟動子（1）AOX1和AOX2啟動子（2）三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldeyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）啟動子（3）甲醛脫氫酶（formaldehydedehydrogenase,FLD）啟動子第8章酵母基因工程2.畢赤酵母表達載體類型

胞內(nèi)表達載體pPICZαA,B,C分泌型表達載體pPICZαA,B,C第8章酵母基因工程3.載體的整合方式畢赤酵母表達載體上無酵母復制起點，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重組整合入酵母染色體DNA中，并隨酵母的生長傳代穩(wěn)定地存在。整合的方式可以是單交換插入，亦可雙交換插入，一般來說前一種方式更容易發(fā)生。第8章酵母基因工程4宿主常用的畢赤酵母受體菌株有：組氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16，其中SMD1168為蛋白酶缺陷型，以其作為宿主表達蛋白可以降低表達產(chǎn)物的降解。這些表達宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生來的。最常用的受體菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一個組氨醇脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含His4的載體而具有His+表型來篩選轉(zhuǎn)化子。根據(jù)對甲醇利用的情況，畢赤酵母可劃分為三種表型。菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長速率與野生型類似，稱為甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；當AOX1被其他基因取代，則需依賴AOX2，但其甲醛代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。當AOX基因全部缺失，則不能利用甲醇，稱為甲醇利用負表型（Mut-），如MC100-3。后兩者胞內(nèi)表達外源蛋白質(zhì)有時優(yōu)于野生株，且需甲醇較少。此外為增加分泌蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4,prb1)。第8章酵母基因工程第三節(jié)影響外源基因表達的因素一、轉(zhuǎn)錄水平控制——外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度二、表達載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性三、其他因素1.優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA的二級結(jié)構，提高外源基因mRNA的翻譯活性2.酵母菌對密碼子的偏愛性:在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個密碼子編碼3.避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的降解，選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主4.優(yōu)化工程菌發(fā)酵工藝第8章酵母基因工程第四節(jié)酵母基因工程應用實例利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗急慢性乙型肝炎誘因——乙型肝炎病毒（HBV）每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物第8章酵母基因工程乙型肝炎病毒的結(jié)構與性質(zhì)乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒呈乙型肝炎病毒的結(jié)構球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結(jié)構蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。此外，被乙肝病毒感染的人肝臟還能合成并釋放大量的22nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是各種未裝配的包裝蛋白的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽。第8章酵母基因工程乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因第8章酵母基因工程產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細胞膜上提取出來的。這種來源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。20世紀80年代開始選擇釀酒酵母表達重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達出具有免疫活性的重組蛋白，它在細胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結(jié)構和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒的最終產(chǎn)量可達細胞總蛋白量的1%-2%。進一步的研究表明，M多肽和L多肽對S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構成的復合型乙肝疫苗還可以誘導那些對S抗原缺乏響應的人群的免疫反應。第8章酵母基因工程產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母第8章酵母基因工程由于巴斯德畢赤酵母染色體DNA上還擁有第二個乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長。重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導HBsAg表達，最終S蛋白的產(chǎn)量可達細胞可溶性蛋白總量的3%。在大規(guī)模的生產(chǎn)過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬份乙肝疫苗。第8章酵母