食品生物技術(shù)導(dǎo)論蛋白質(zhì)工程與食品產(chǎn)業(yè)

食品生物技術(shù)導(dǎo)論蛋白質(zhì)工程與食品產(chǎn)業(yè)第一節(jié)、蛋白質(zhì)工程概述催化功能：酶調(diào)節(jié)功能：激素結(jié)構(gòu)功能：細胞骨架運輸功能：血紅蛋白免疫功能：免疫球蛋白運動功能：鞭毛、肌肉蛋白儲藏功能：酪蛋白生物膜功能及神經(jīng)傳導(dǎo)等蛋白質(zhì)的功能第2頁,共72頁，2024年2月25日，星期天維持生命所必須的基本物質(zhì)。用蛋白質(zhì)診斷和治療某些疾病。食品工業(yè)應(yīng)用蛋白質(zhì)制造各種產(chǎn)品。蛋白質(zhì)重要性第3頁,共72頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)分子量大，難于化學(xué)合成;蛋白質(zhì)功能要在生理條件下才能發(fā)揮；蛋白質(zhì)（酶）的專一性強。蛋白質(zhì)應(yīng)用受限的原因第4頁,共72頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其功能關(guān)系為基礎(chǔ)，通過基因修飾、蛋白質(zhì)修飾等分子設(shè)計，對現(xiàn)存蛋白質(zhì)加以改造，從而組建新型蛋白質(zhì)，或全新設(shè)計新的蛋白質(zhì)的現(xiàn)代生物技術(shù)。第5頁,共72頁，2024年2月25日，星期天基因水平蛋白質(zhì)水平化學(xué)改性物理改性蛋白質(zhì)工程的技術(shù)手段酶法水解或聚合改性理性分子設(shè)計和定位突變?nèi)诤系鞍准夹g(shù)體外定向進化全新蛋白設(shè)計改造現(xiàn)有蛋白第6頁,共72頁，2024年2月25日，星期天初級改造：個別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除、置換或插入高級改造：蛋白質(zhì)分子的剪裁，如結(jié)構(gòu)域的拼接從頭設(shè)計合成新型蛋白質(zhì)

基因水平的蛋白質(zhì)工程第7頁,共72頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系第二節(jié)理性分子設(shè)計和定位突變技術(shù)第8頁,共72頁，2024年2月25日，星期天中心法則蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA第9頁,共72頁，2024年2月25日，星期天一、理性分子設(shè)計及其基本步聚理性分子設(shè)計在已知蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，對一段最可能影響蛋白質(zhì)功能與性質(zhì)的基因序列進行定位突變，有目的地改變蛋白質(zhì)的某一兩個氨基酸殘基或模塊，從而構(gòu)建新的蛋白質(zhì)分子。第10頁,共72頁，2024年2月25日，星期天理性分子設(shè)計基本步聚(1)分離純化目的蛋白，使之結(jié)晶,了解其空間結(jié)構(gòu)的盡可能多的信息。(2)確定它的功能域。(3)分析結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系，找出關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和基團。

(4)圍繞這些關(guān)鍵的基團和結(jié)構(gòu)提出對蛋白質(zhì)進行改造的方案，并用基因工程的方法（定位突變）去實施。

(5)對經(jīng)過改造的蛋白質(zhì)進行功能性測定.第11頁,共72頁，2024年2月25日，星期天定位突變定位突變是在已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，在已知DNA序列中取代、插入或刪除選定的核苷酸，從而產(chǎn)生具有新性狀的突變蛋白質(zhì)分子的一種蛋白質(zhì)工程技術(shù)。

PCR介導(dǎo)的定位突變、寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變、盒式突變

二、定位突變第12頁,共72頁，2024年2月25日，星期天（一）寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變原理：用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下啟動DNA分子進行復(fù)制。包括：Kunkel突變法、基于抗生素的“抗性恢復(fù)”突變法、基于去除特定限制酶切點的突變法，第13頁,共72頁，2024年2月25日，星期天Kunkel突變法載體需改造的蛋白質(zhì)基因純化單鏈DNA第14頁,共72頁，2024年2月25日，星期天合成三種含突變堿基的引物ssrrsr基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變方法退火第15頁,共72頁，2024年2月25日，星期天基于去除特定限制酶切位點的突變第16頁,共72頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點是保真度比重組PCR突變法高，缺點是操作環(huán)節(jié)復(fù)雜，周期長，克隆待突變基因時會受到限制性酶切位點的限制。寡核苷酸引物介導(dǎo)的定位突變優(yōu)缺點第17頁,共72頁，2024年2月25日，星期天（二）PCR介導(dǎo)的定位突變法原理：利用PCR將插入和缺失的突變堿基均設(shè)計在引物中，先用兩對引物分別對核酸進行PCR擴增，通過重疊延伸產(chǎn)生帶有部分重疊序列的兩種PCR產(chǎn)物，這些產(chǎn)物經(jīng)過混合、變性、復(fù)性和鏈延伸后，再用一對與兩個待接片段外側(cè)互補的引物進行第二次擴增，從而產(chǎn)生全長的異源雜合雙鏈DNA。第18頁,共72頁，2024年2月25日，星期天水溶性灰分測定方法第19頁,共72頁，2024年2月25日，星期天插入第20頁,共72頁，2024年2月25日，星期天TCGTATGATGCGAAGCATACTACGCTAGCATACGCTTGCGATCGTATCGTATGCGAAGCATACGCTTCGTATGCGAAGCATACGCTAGCATTGCGATCGTATGCGAAGCATACGCTTCGTATGCGAAGCATACGCTTCGTATGCGA缺失第21頁,共72頁，2024年2月25日，星期天PCR介導(dǎo)的定位突變優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡單，突變成功率100%；缺點：保真性偏低；后續(xù)工作復(fù)雜。第22頁,共72頁，2024年2月25日，星期天（三）盒式突變盒式突變，又稱片段取代法，利用目標(biāo)基因序列中適當(dāng)限制酶切位點，插入各種合適的突變DNA片段，用以取代目標(biāo)基因中特定DNA片段。包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。

第23頁,共72頁，2024年2月25日，星期天盒式取代誘變第24頁,共72頁，2024年2月25日，星期天盒式突變優(yōu)缺點優(yōu)點：簡單易行，突變效率高；可以一次改變多個位點或一個片段。缺點：合成DNA片段成本高，要求合適的限制內(nèi)切酶位點。第25頁,共72頁，2024年2月25日，星期天酶制劑的改造目標(biāo)1.增強穩(wěn)定性.2.提高酶活力.3.改變酶的選擇性.三、定位突變技術(shù)在酶結(jié)構(gòu)改造中的應(yīng)用第26頁,共72頁，2024年2月25日，星期天消除酶的被抑制特性枯草芽胞桿菌蛋白酶：堿性蛋白酶1985年，美國的埃斯特爾借助寡核苷酸介導(dǎo)的定位突變技術(shù)，用19種其他氨基酸分別替代枯草芽孢桿菌蛋白酶分子第222位殘基上易氧化的Met，獲得了一系列活性差異很大的突變酶。其中用Cys置換的突變型在1mol/L雙氧水中可以保持一小時以上的酶活。第27頁,共72頁，2024年2月25日，星期天T4溶菌酶及其突變體酶的特性引入二硫鍵，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性第28頁,共72頁，2024年2月25日，星期天酶氨基酸及其位置半衰期/min野生型Asn14,Asn78,13AAsn14,Thr78,17BAsn14,Ile78,16CThr14,Ile78,25DAsp14,Asn78,11釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶及其突變酶在100℃下的穩(wěn)定性轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性第29頁,共72頁，2024年2月25日，星期天

改變酶的最適pH值條件堿性條件下，80℃時使高果糖漿焦化產(chǎn)生有害物質(zhì)，反應(yīng)只能在60℃進行。反復(fù)調(diào)節(jié)pH過程產(chǎn)生的鹽離子，去離子工序麻煩。采用盒式突變技術(shù)將葡萄糖異構(gòu)酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的區(qū)域置換為堿性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH值變?yōu)樗嵝裕纯稍诟邷叵逻M行反應(yīng)。第30頁,共72頁，2024年2月25日，星期天利用定點突變技術(shù)葡萄糖淀粉酶的催化特性。如將活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代時，突變體酶分解α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵的活性比例發(fā)生明顯改變修飾酶的催化特異性第31頁,共72頁，2024年2月25日，星期天利用基因工程原理可以在實驗室中模擬生物進化過程。

理論來源第三節(jié)體外定向進化（非理性分子設(shè)計）一、蛋白質(zhì)的體外定向進化第32頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共72頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的體外定向進化蛋白質(zhì)的體外定向進化又稱為分子進化，就是在實驗室條件下模擬自然進化機制，對編碼蛋白質(zhì)的基因進行誘變、重組，再通過高通量篩選方法選擇出性能更加優(yōu)良的蛋白質(zhì)。

不需要已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。第34頁,共72頁，2024年2月25日，星期天隨機突變+定向選擇＝目標(biāo)突變體細菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C最適生長溫度提高了！定向進化示意圖隨機突變+定向選擇＝目標(biāo)突變體第35頁,共72頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)體外進化的過程1.通過隨機突變或基因重組創(chuàng)造基因多樣性，建立突變文庫；2.突變體在適當(dāng)生物體內(nèi)表達；3.高通量篩選檢出陽性結(jié)果，供進一步進化；4.此過程不斷循環(huán)，直至獲得預(yù)期性狀的新型蛋白。第36頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共72頁，2024年2月25日，星期天定向進化與自然進化不同點1.進化動力不同2.進化方向不同3.進化速度不同第38頁,共72頁，2024年2月25日，星期天定向進化定點突變的區(qū)別定向進化：突變位點是隨機的，不確定的；突變位點的數(shù)目也是不確定的；突變的效應(yīng)更是不可預(yù)知的；理論上講，凡是能夠引起突變的因素（物理的，化學(xué)的，生物的）都可以應(yīng)用于定向進化中突變體的產(chǎn)生。定點突變：突變位點是確定的，突變的個數(shù)也是預(yù)知的；突變的效應(yīng)可能是已知的，也可能是未知的；定點突變的方法一般是以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的。第39頁,共72頁，2024年2月25日，星期天定向進化突變體庫產(chǎn)生方法重組：DNA改組、外顯子改組、隨機體外引發(fā)改組、合成改組突變：容錯PCR、隨機定位突變、交錯延伸等方法第40頁,共72頁，2024年2月25日，星期天DNA改組二、DNA改組將一群密切相關(guān)的DNA序列，在DNaseI作用下，隨機酶切成許多片段，這些小片段之間有部分重疊堿基序列，可通過自身引導(dǎo)PCR重新組裝成全長基因，從而建立分子多樣性文庫，對突變文庫進行篩選，選擇改良的突變體組成下一輪DNA改組模板，重復(fù)多次重排與篩選，直至獲得性狀較為滿意的突變體。第41頁,共72頁，2024年2月25日，星期天DNA重組裝原理圖1.DNaseI產(chǎn)生隨機片段；2.隨機片段變性；3.隨機片段復(fù)性；4.延伸反復(fù)重復(fù)2-4步后，可獲得全長DNA片段第42頁,共72頁，2024年2月25日，星期天容錯PCR三、容錯PCR容錯PCR是指在利用Taq聚合酶進行目的基因的PCR擴增的同時引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因隨機突變的一種DNA體外進化技術(shù)。第43頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共72頁，2024年2月25日，星期天高通量篩選方法舉例第45頁,共72頁，2024年2月25日，星期天四、定向進化技術(shù)在酶制劑改造中的應(yīng)用

L－天冬氨酸酶(提高酶耐熱性和酶活)。磷脂酶A1突變體（耐有機溶劑）乙內(nèi)酰脲酶（D－型底物突變成L－型底物）。第46頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)融合蛋白技術(shù)融合蛋白技術(shù)概念一、融合蛋白技術(shù)的概念和用途有目的地把兩段或多段編碼功能蛋白的基因編碼區(qū)首尾連接在一起，由同一調(diào)控序列控制所構(gòu)成的基因表達產(chǎn)物，進而表達所需的蛋白。第47頁,共72頁，2024年2月25日，星期天融合蛋白技術(shù)用途1.為解決在大腸桿菌等原核生物中表達出具有生物活性、折疊正確的組蛋白提供了可能。2.外源基因與宿主本身蛋白的部分序列構(gòu)成融合基因以融合蛋白的形式表達時會減低宿主細胞對產(chǎn)物的降解。3.融合蛋白技術(shù)的出現(xiàn)為研究出更多更好的基因工程靶向藥物提供了方便。第48頁,共72頁，2024年2月25日，星期天PCR介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子嵌合體形成二、融合蛋白技術(shù)的方法第49頁,共72頁，2024年2月25日，星期天內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子嵌合體形成合成肽巰基化合物第50頁,共72頁，2024年2月25日，星期天融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用三、融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用1.雙功能酶2.靶向藥物3.抗菌肽第51頁,共72頁，2024年2月25日，星期天 以往研究發(fā)現(xiàn)，在利用基因融合所構(gòu)建的大的酶分子中，如果用以構(gòu)成融合蛋白的各個酶分子的整個編碼序列均保留于新的酶分子中，則融合蛋白一般均保留所構(gòu)成的酶分子各自的酶活性。雙功能酶第52頁,共72頁，2024年2月25日，星期天 并且發(fā)現(xiàn)在這些新構(gòu)建的融合蛋白中，蛋白的正確折疊以及各個酶的活性部位均未受到影響，與單個酶相比，融合蛋白的酶的比活力為50%-100%，對于催化連續(xù)反應(yīng)的兩種或幾種酶，利用基因融合的方法構(gòu)成的融合蛋白可產(chǎn)生“鄰近效應(yīng)”（proximityeffect）。第53頁,共72頁，2024年2月25日，星期天

研究發(fā)現(xiàn)，

β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生NADH的速度是同時加入這兩種酶的反應(yīng)速度的兩倍以上。同時過渡態(tài)時間縮短近四倍。第54頁,共72頁，2024年2月25日，星期天定向藥物

定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結(jié)合的配基。通過融合蛋白技術(shù)將這兩部分融合在一起，即可構(gòu)成一個具有獨特構(gòu)象與功能的蛋白質(zhì)。第55頁,共72頁，2024年2月25日，星期天特點：它可以特異性地與靶細胞或致病因子結(jié)合，并把藥物引導(dǎo)至病灶處，從而大大提高藥物的效力?？梢赃x擇性地殺傷相應(yīng)的抗原相關(guān)細胞或受體相關(guān)細胞，對其他無關(guān)細胞影響較少或無影響。第56頁,共72頁，2024年2月25日，星期天

配基常是腫瘤特異性抗體、細胞因子或激素等導(dǎo)向物質(zhì)，藥物常是毒性分子（如動植物毒素、放療、化療藥物或細菌毒素等）。

第57頁,共72頁，2024年2月25日，星期天抗菌肽

肽類抗生素又名抗菌肽，機體天然產(chǎn)生的抗菌肽由于其對耐藥菌的強大抗菌作用而受到人們關(guān)注。它廣泛存在于動植物體內(nèi)，是由生物體特定基因編碼的一類陽離子小分子多肽，具有廣譜抗菌活性，是機體天然免疫的重要組成部分。第58頁,共72頁，2024年2月25日，星期天研究結(jié)果表明，抗菌肽可以在亞毒性濃度下抑制HIV-1的基因表達，減少HIV-1的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外，也具有抗病毒的特性，已有研究證實人源溶菌酶具有抗HIV-1的作用。 目前已有人構(gòu)建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表達載體。并成功表達出了具有抗菌和抗病毒雙重活性的重組蛋白。第59頁,共72頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)全新蛋白質(zhì)的設(shè)計和構(gòu)建全新蛋白質(zhì)設(shè)計是根據(jù)所希望的得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能設(shè)計氨基酸序列．稱反折疊研究。一、概念核心問題是要讓設(shè)計的序列要形成一個穩(wěn)定獨特的三維結(jié)構(gòu)。第60頁,共72頁，2024年2月25日，星期天假如我們選定的設(shè)計目標(biāo)是水溶性的球蛋白，基本結(jié)構(gòu)圖樣是由幾段螺旋區(qū)組成的螺旋束，那么首先就要提出一個草圖，包括α螺旋的數(shù)量和長度，相鄰的α螺旋相互平行或反平行排列？相鄰α螺旋之間的堆積及界面情況如何？提出基本結(jié)構(gòu)圖樣二、基本步聚第61頁,共72頁，2024年2月25日，星期天為了落實每個殘基位置上氨基酸，有優(yōu)先殘基的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)可供參考。對已知結(jié)構(gòu)進行調(diào)查和分析的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明，有些氨基酸對二級結(jié)構(gòu)片段中的特殊位置有優(yōu)選性。確定氨基酸順序第62頁,共72頁，2024年2月25日，星期天在初步選定了氨基酸順序之后，再用MonteCarlo法或分子動力學(xué)計算將它的三維模型優(yōu)化，繼之以能量極小計算，使構(gòu)象的能量水平達到最低和穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)優(yōu)化第63頁,共72頁，2024年2月25日，星期天血紅素結(jié)合蛋白、氧化還原活性蛋白質(zhì)、DNA結(jié)合蛋白及基于蛋白質(zhì)的高分子材料。三、取得的進展第64頁,共72頁，2024年2月2