第04章 遺傳信息的復制課件

基因組核酸的復制形式：

1、DNA復制（原核、真核、多數(shù)DNA病毒基因組）

2、DNA通過RNA中間體進行復制(少數(shù)DNA病毒)3、RNA復制（RNA病毒）

4、RNA通過DNA中間體進行復制（逆轉(zhuǎn)錄病毒）本章介紹內(nèi)容：

1、DNA復制

2、DNA損傷與修復

3、逆轉(zhuǎn)錄

4、RNA復制第四章遺傳信息的復制第04章遺傳信息的復制第一節(jié)DNA的復制Ithasnotescapedournoticethatthespecificpairingwehavepostulatedimmediatelysuggestsapossblecopyingmechanismforgeneticmaterial.WatsonandCrick1953定義：在細胞分裂過程中，以親代DNA為模板合成子代DNA的過程稱為DNA復制（DNAreplication)。第04章遺傳信息的復制

一、DNA復制的基本特點：（一）復制起始點和方向復制子(replicon):

基因組中能單獨進行復制的單位。1、復制起始點（originofreplication,ori)

定義：復制子中控制復制起始的位點。原核生物：只有一個起始點真核生物：有多個起始點第04章遺傳信息的復制2、復制方向的形式：1）兩個起始點，兩個相反方向，兩個復制叉例：腺病毒DNA復制（圖4-2a)2）一個起始點，一個方向，一個復制叉例：質(zhì)粒ColE13)一個起始點，兩個相反方向，兩個復制叉例：大腸桿菌DNA復制第04章遺傳信息的復制復制中的放射自顯影圖象復制叉復制叉：指雙鏈DNA從復制起始點打開后局部形成的Y型結(jié)構(gòu)。ori第04章遺傳信息的復制

圖:原核生物DNA雙向復制

A.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點

B.復制中的兩個復制叉

C.復制接近終止點(termination,ter)oriterABC第04章遺傳信息的復制(二）復制方式1、半保留復制

1958年

M.Meselson和F.Stahl以大腸桿菌為實驗材料證實半保留復制的模式

第04章遺傳信息的復制細菌培養(yǎng)DNASeCl密度梯度離心在含15N標記的培養(yǎng)液培養(yǎng)15代

15N-15N（重DNA）在普通培養(yǎng)液培養(yǎng)第一代

在普通培

養(yǎng)液培養(yǎng)14N-15N（雜合DNA）第二代

14N-14N（輕DNA）第04章遺傳信息的復制2、半不連續(xù)復制

第04章遺傳信息的復制（三）復制的基本過程

1、DNA雙鏈解開

2、RNA引物的合成

3、DNA鏈的延長

4、切除引物、填補空缺、連接相鄰DNA片段

5、切除和修復錯配堿基第04章遺傳信息的復制二、原核生物染色體DNA的復制（一）參與DNA復制的酶類與蛋白質(zhì)1、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)

指以dNTPs為底物，催化合成DNA的一類酶。酶IIIIII

酶5’3’聚合作用+++

活3’5’外切酶活性+++

性5’3’外切酶活性+--

功修復合成不詳復制能切除引物修正錯誤填補空缺第04章遺傳信息的復制

引物鏈模板鏈3’引物鏈模板鏈3’OOH2CA-----T-H2CA-----T-HHHH

OHH—PPiOH

O-

+PPiP--P—P=O

P=O

OOH2CT-----A-H2CT-----A-HHHH

OHHOHH聚合作用第04章遺傳信息的復制

圖：DNA聚合酶I的3’5’外切酶功能第04章遺傳信息的復制

圖：隨從鏈合成中PolI的作用——缺口平移第04章遺傳信息的復制polI

N5’3’外切酶

3’5’外切酶

聚合酶C

A~FG~R

枯草桿菌蛋白酶

5’3’外切酶

3’5’外切酶

聚合酶小片段大片段（Klenow)(36KD)(67KD)Klenow大片段是分子生物學研究常用的工具酶.第04章遺傳信息的復制2、引物酶（primase，DnaG蛋白)

催化RNA引物合成的一種RNA聚合酶作用：以４種NTP為原料，以解開的DNA鏈為模板按５’３’方向合成RNA引物

3’3’5’5’第04章遺傳信息的復制3、松弛螺旋與解鏈的酶及蛋白質(zhì)(1）DNA解鏈酶（DNAhelicase)

作用：在ATP參與下，解開DNA雙鏈種類：

II、III：延隨從鏈模板以5’3’方向移動延隨從鏈的模板以5’3’方向移動

Rep蛋白：延前導鏈的模板以3’5’方向移動

3’Rep3’IIIII5’5’第04章遺傳信息的復制(2）DNA拓撲異構(gòu)酶（DNAtopoisomerase，topo)拓撲性質(zhì)：指物體或圖象作彈性位移而又保持不變的性質(zhì)。拓撲異構(gòu)體：堿基順序相同但連環(huán)數(shù)/拓撲環(huán)數(shù)不同的兩個

DNA分子。拓撲異構(gòu)酶：催化DNA拓撲異構(gòu)體互變的一類酶。拓撲異構(gòu)酶分類：TopoI:

使負超螺旋松弛

1）切斷DNA雙螺旋中的一股鏈

2）互補鏈通過切口

3）斷端連接第04章遺傳信息的復制TopoII（旋轉(zhuǎn)酶）:1）無ATP時，切斷DNA雙螺旋中的兩股鏈，使超螺旋松弛。

2）有ATP時，已松弛的DNA分子轉(zhuǎn)變?yōu)樨摮菪?，增加超螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

(3）單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandDNAbindingprotein,SSB)

作用：1）與解開的DNA單鏈結(jié)合

2）保護DNA單鏈免受核酸酶的水解第04章遺傳信息的復制4、DNA連接酶（DNAligase)

作用：催化相鄰兩DNA片段的連接。連接酶

OHPO5’POH3’O--P-OOH3’O

連接酶

O5’PO-P-OOH3’O第04章遺傳信息的復制

第04章遺傳信息的復制（二）DNA復制過程1、復制的起始（1）復制的起始物的生成：大腸桿菌：DnaA識別起始點，促進其解鏈。原因：oriC中有兩個區(qū)域在復制起始中起重要作用

①13核苷酸（富含AT）的重復序列

②

9核苷酸的重復序列:與DnaA結(jié)合

3個13bp的重復序列4個9bp的重復序列一致性序列一致性序列

GATCTNTTNTTTTTTATCCACA第04章遺傳信息的復制(2)引發(fā)前體的形成：

DnaB/DnaC復合物進入局部解鏈區(qū)（3）解鏈酶解鏈：

DnaB（一種解鏈酶）使雙鏈DNA進一步解鏈,

拓撲酶II松弛雙螺旋,

SSB結(jié)合到打開的雙鏈DNA的單鏈上.（4）引物的合成：

引物酶加入到模板和蛋白質(zhì)復合體中組成引發(fā)體，以解開的DNA鏈為模板，合成RNA引物。（５）第一個磷酸二酯鍵的形成

DNA聚合酶III的β亞基辨認引物，催化第一個磷酸二酯鍵的形成

第04章遺傳信息的復制

DnaA：辨認起始點DNADnaB：解螺旋酶引發(fā)體

DnaC：輔助解螺旋酶DnaG(引物酶

)RNA引物

DDDPIIIdNTP新DNA鏈第04章遺傳信息的復制DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

引發(fā)體第04章遺傳信息的復制3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶引物第04章遺傳信息的復制

參與復制起始的各種物質(zhì)*

名稱功能

DnaA蛋白辨認起始點解鏈酶(DnaB,rep蛋白）解開DNA雙鏈

DnaC蛋白協(xié)助解螺鏈酶引物酶（DnaG蛋白）催化RNA引物生成

SSB穩(wěn)定解開的單鏈拓撲異構(gòu)酶理順DNA鏈

oriCE.coli的復制起始點第04章遺傳信息的復制２、DNA鏈的延長在DNA聚合酶催化下，自引物３’-OH端開始，沿５’３’方向逐個加入脫氧核苷酸。涉及：切除引物、填補空缺、連接相鄰DNA片段、切除和修復錯配堿基第04章遺傳信息的復制5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目錄第04章遺傳信息的復制

過程：

1、原核生物：DNA-polIII催化下，不斷生成磷酸二酯鍵。

2、按堿基互補原則，以DNA為模板，在RNA

引物3’-OH端加入dNTP。

3、合成鏈的方向：５’

→３’第04章遺傳信息的復制特點：

1、半不連續(xù)復制

DNA合成中：一條鏈：是順解鏈方向連續(xù)合成的——領頭鏈（以3’

→5’方向鏈為模板）一條鏈：是逆解鏈方向不連續(xù)合成的——隨從鏈（以5’

→3’方向鏈為模板）2、岡崎片斷（Okazakifragment)1968年日本科學家岡崎利用電鏡和放射自顯影技術(shù)發(fā)現(xiàn)：在DNA復制過程中，出現(xiàn)一些不連續(xù)的DNA片段。

第04章遺傳信息的復制領頭鏈的合成目錄第04章遺傳信息的復制隨從鏈的合成目錄第04章遺傳信息的復制目錄第04章遺傳信息的復制復制過程簡圖目錄第04章遺傳信息的復制復制過程動畫第04章遺傳信息的復制３、復制的終止線性DNA：復制叉到達分子末端，復制終止

環(huán)狀DNA：兩個復制叉的匯合點

(TerD、A、C、B)Tus蛋白識別和結(jié)合與終止位點第04章遺傳信息的復制

圖:顯示Ter

位點位置的大腸桿菌染色體圖譜第04章遺傳信息的復制５’３’解鏈酶拓撲酶引發(fā)體

SSB引物酶

DNApolIII

引物

DNApolI,連接酶

前導鏈隨從鏈3’５’3’5’第04章遺傳信息的復制

小結(jié)

原核生物DNA復制的基本過程

1、起始階段：

DNA雙鏈解旋（拓撲酶）解鏈（解鏈酶）

RNA引物的合成（引物酶）

2、DNA鏈的延長：前導鏈和岡崎片段（DNApolIII)3、終止階段：切除引物、填補空缺(DNApolI)、連接DNA片段(DNA連接酶）第04章遺傳信息的復制三、其它環(huán)狀DNA分子的復制1、θ復制（replication)——Carins復制環(huán)狀DNA在復制起始點解開成單鏈狀態(tài)，分別以兩條鏈作為模板，各自合成其互補鏈。由于其形態(tài)像希臘字母θ，故名。存在：革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒、多瘤病毒如：大腸桿菌DNA復制

第04章遺傳信息的復制

圖原核生物DNA雙向復制

A.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點

B.復制中的兩個復制叉

C.復制接近終止點(termination,ter)oriterABC第04章遺傳信息的復制2、滾環(huán)復制（rollingcirclereplication)

簡單低等生物或染色體外的DNA進行復制的方式。如

X174和M13噬菌體等。第04章遺傳信息的復制3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滾環(huán)復制5'

5

3

3

5

目錄第04章遺傳信息的復制dNTPDNA-polγ

3、D環(huán)復制(D-loopreplication)

是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復制形式。

第04章遺傳信息的復制四、真核生物染色體DNA復制的特點（一）復制有時序性：

即復制子以分組方式激活而不是同步起動。（二）復制起始點及方向

1、多個復制起始點：

復制起始點較原核的oriC短

2、雙向復制第04章遺傳信息的復制（三）DNA聚合酶有四種類型：都具有5’→3’方向的聚合作用。

α:參與核DNA的復制、參與鏈合成的引發(fā)

β:具有外切核酸酶活性、具有修復和校正功能

δ:參與核DNA的復制、參與鏈合成的延長切除引物和填補空缺的作用

γ:參與線粒體DNA的復制第04章遺傳信息的復制（四）增殖細胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)

在復制起始和延長中起關(guān)鍵作用。（五)細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關(guān)鍵點。

G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。

(六）蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調(diào)控作用。第04章遺傳信息的復制3

5

5

3

領頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體復制的延長DNAPol-δDNApol-αPCNA第04章遺傳信息的復制

真核生物與原核生物DNA復制的異同

真核生物原核生物底物dNTPdNTPDNApolα領頭鏈的延長I修復、填補空缺

δ

隨從鏈的延長III復制合成

ε

校讀、修復、填補空缺岡崎片段100~200個1000~2000個引物10個數(shù)十個起始點多個一個復制速度50個核苷酸/秒500個核苷酸/秒復制方式半不連續(xù)復制θ

復制末端空缺有無第04章遺傳信息的復制（三）末端復制與端粒酶端?！婧松锞€性染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)特點:由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。末端DNA序列是多次重復的富含T、C堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…第04章遺傳信息的復制端粒酶——一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的酶。在端粒合成中以其自身攜帶的RNA為模板合成互補鏈?？煽醋魇且环N特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶。端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成:第04章遺傳信息的復制端粒DNA合成過程——“爬行模型”1、結(jié)合：端粒酶結(jié)合在端粒TG引物（3’-OH）上。2、聚合、雜交：端粒酶以自身RNA為模板，以dGTP

和dTTP為原料在染色體末端進行聚合作用（逆轉(zhuǎn)錄）。3、移位：繼續(xù)加入T、G進行聚合。4、終止：合成達到一定長度，伸長的DNA末端與

RNA模板解開。5、端粒合成。第04章遺傳信息的復制

端粒酶催化端區(qū)TG鏈的合成

5’—TTTTGGGGTTTTG-OH3’

CAAAACCCCAAAA端粒酶

GCGA3’AA5’

結(jié)合、聚合、雜交

5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg3’

CAAAACCCCAAAACGAGA3’5’

第04章遺傳信息的復制

TTTT

移位

GGGgGgGg5’—TTTTttttg3’

CAAAACCCCAAAACGAGA3’5’

終止

5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg

gggttttg-OH3’第04章遺傳信息的復制5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg

gggttttg-OH3’3‘—

5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg

gggtt

3’—HO-ggggttDNApol5’—TTTTGGGGTTTTGgggttttg

gggtt

3’—AAAACCCCAAAACCCCAAAAggggtt第04章遺傳信息的復制第二節(jié)DNA的損傷與修復

(DNADamageandRepair)

一、DNA的損傷（DNAdamage)定義：復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷。引起損傷的因素：

1、自發(fā)性突變——內(nèi)因

DNA復制中發(fā)生錯配堿基,發(fā)生頻率10-9左右

DNA聚合酶可修正錯誤.2、誘發(fā)性突變——外因外界因素所導致的突變物理因素：紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射化學因素:烷化劑第04章遺傳信息的復制常見損傷的方式：1、點突變：

1）轉(zhuǎn)換：由一種嘧啶（嘌呤）轉(zhuǎn)換為另一種嘧啶（嘌呤）

2）顛換：原為嘧啶（嘌呤）突變后換成嘌呤（嘧啶）2、移碼突變：丟失或插入一個或一段核苷酸，使下游DNA的編碼發(fā)生改變。3、鏈內(nèi)或鏈間發(fā)生共價連結(jié)第04章遺傳信息的復制鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因點突變例子:第04章遺傳信息的復制谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變第04章遺傳信息的復制二、DNA損傷的修復1、光修復(lightrepairing)2、切除修復(excisionrepairing)3、重組修復(recombinationrepairing)4、SOS修復第04章遺傳信息的復制（一）光修復

光修復酶催化的反應

UV

（300~600nm)

光修復酶第04章遺傳信息的復制（二）切除修復(excisionrepair)

定義：指對DNA損傷的部位先進行切除，隨后再進行正確的合成，補充被切除的片段。此種方式可修復DNA雙螺旋中發(fā)生的幾乎所有類型的損傷。是細胞內(nèi)最重要和有效的修復機制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。第04章遺傳信息的復制UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHP

DNA連接酶ATPE.coli的切除修復機制目錄損傷DNAUvrA、UvrB辨認結(jié)合在損傷部位切除損傷填補空缺、連接缺口

第04章遺傳信息的復制真核細胞也存在切除修復系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)基因：XPA、XPB、XPC、XPF、XPG表達蛋白活性：1、結(jié)合損傷DNA2、解旋酶切除損傷DNA3、核酸酶空缺由DNA-polδ及ε加以修復。著色性干皮?。▁erodermapigmentosis,XP）

——遺傳性疾病病因：患者修復系統(tǒng)缺陷。故紫外線照射后易發(fā)生皮膚癌。第04章遺傳信息的復制切除修復動畫第04章遺傳信息的復制（三）重組修復（recombinationalrepair）

DNA復制過程中子代DNA發(fā)生損傷時，可以從親代DNA分子中得到所需的正確片段。片段交換復原參與重組修復的酶有多種，RecA、RecB、RecC。此種修復不能完全去除損傷，只是使損傷鏈“稀釋”。第04章遺傳信息的復制

圖：重組修復第04章遺傳信息的復制（四）SOS修復

指DNA損傷時，應急而誘導產(chǎn)生的修復作用。DNA損傷

+RecALexA(調(diào)控蛋白）水解（重組酶）誘導

SOS修復基因活化修復酶表達參與DNA修復第04章遺傳信息的復制三、DNA損傷的主要檢測技術(shù)（一）堿基損傷的檢測方法

損傷檢測方法

酶敏感位點核酸內(nèi)切酶V探針法無嘌呤/無嘧啶位點堿基不穩(wěn)定位點核酸內(nèi)切酶和DNA-糖基化酶探針法

5-羥甲基脫氧尿嘧啶核苷免疫化學法

5,6-二羥基二氫胸腺嘧啶離子交換法多種堿基損傷高效液相色譜法分析第04章遺傳信息的復制（二）DNA單鏈斷鏈和雙鏈斷鏈的主要檢測1、單鏈斷裂的檢測方法1）堿性蔗糖梯度離心：

DNA在堿性介質(zhì)中解螺旋，不同長度的DNA片段在蔗糖梯度離心時沉降速度不同。2）堿性洗脫：在一定孔徑的微孔濾膜上用去垢劑使細胞溶破，DNA裸露，然后用堿性、中性緩沖液洗脫，斷裂越多，洗脫越快。3）羥基磷石灰吸附

DNA吸附在羥基磷石灰柱上，用不同離子強度的PBS使單鏈DNA和雙鏈DNA依次分開。第04章遺傳信息的復制4）DNA解螺旋熒光測定溴乙啶嵌入DNA螺旋，產(chǎn)生一定程度的熒光，鏈斷裂時解鏈程度不同，溴乙啶嵌入速度不同，熒光有差異。2、雙鏈斷裂1）中性蔗糖梯度密度離心在中性介質(zhì)中操作，DNA不解螺旋，DNA片段以不同速度沉降。2）中性洗脫第04章遺傳信息的復制（三）DNA交聯(lián)的主要測定方法1、DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)(DPC)的測定方法1）SDS-KCl沉淀利用DPC在SDS溶液和SDS-KCl溶液中的沉降行為不同。2）膜結(jié)合利用膜對DNA的特殊親和性，將DPC分離。3）羥基磷灰石吸附雙鏈DNA吸附在羥基磷灰石柱上，由于DPC形成，蛋白質(zhì)也被掛在柱上，可進一步分離。第04章遺傳信息的復制4）凝膠電泳利用高鹽和尿素除去雜蛋白，然后進行凝膠電泳，結(jié)合蛋白酶處理。5）堿性洗脫

DPC形成時，微孔濾膜上DNA存留率下降。2、DNA-DNA鏈間交聯(lián)（ISC）的檢測第04章遺傳信息的復制（四）嘧啶二聚體的檢測方法1、紙層析法放射性同位素標記細胞DNA