第十一章 DNA的復制課件

第十一章

DNA的復制第一節(jié) 半保留復制的驗證半保留模型（semioconservetivemodel）

全保留復制模型(conservetivemodel)

分散模型(Dispersivemodel)。第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制驗證半保留復制的實驗一、Meselson-Stahl實驗

二、Taylar實驗

三、姐妹染色單體差別染色方法（sister-chromatiddifferentialstaining）

5溴脫氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，簡稱BUdR）斑色染色體（Harlequinchromosome）四、Cairns復制模型—θ型復制

第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制

圖11-4Taylor蠶豆根尖放射自顯影實驗。

(a)按半保留復制預期DNA在復制過程中標記情況；(b)實驗結果染色體放射自顯影的圖示。第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制第二節(jié)

復制的起點、方向和終點

一.研究方法：

1.用同位素標記電鏡觀察及變性法2.用噬菌體插入標記法同步培養(yǎng)不同步培養(yǎng)

3.變性定性法（denaturationmapping）

4.雙向電泳法第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制圖11-11不同步培養(yǎng)時各標記的拷貝數(shù)不同

復制起點標記的拷貝數(shù)應最多第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制二、原核的復制起點和方向

E.coli定點、雙向對稱復制。

T7在近一端的17％處開始，向兩端延伸?？莶輻U菌有固定的起始點，雙向不對稱復制。質(zhì)粒R6K早期為單向復制，復制了約1/5基因組進行時雙向復制。質(zhì)粒ColE1有固定起始點，但卻為單向復制。

mtDNA進行D（displacedloop）環(huán)復制

真核有多個復制起點（i），雙向等速復制。第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制D環(huán)復制第十一章DNA的復制第三節(jié)

DNA復制突變型的篩選根據(jù)溫度敏感性篩選同位素標記法篩選5－溴尿嘧啶摻入法質(zhì)粒溫度敏感性的篩選根據(jù)抗藥性篩選根據(jù)與突變有關的生物學功能篩選快停突變與慢停突變第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制第四節(jié)

原核生物復制的酶系統(tǒng)DNA合成酶

DNA聚合酶的共同特點是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3'－OH；（3）合成的方向都是5‘→3’（4）除聚合DNA外還有其它功能。第十一章DNA的復制

表11-1E.coli中的三種DNA多聚酶

DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ結構分子量

109KD90KD900KD構成

單體單體異多聚體分子數(shù)/細胞

400？10-20酶活性：5→3`聚合酶

+++3`→5`外切酶

+++5`→3`外切酶

+－－(可切單鏈)突變體突變位點polApolBpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dnaT突變表型修復有缺陷能修復阻止復制

第十一章DNA的復制(一).DNA聚合酶I的結構DNA聚合酶有6個結合位點：(1)模板結合位點；(2)引物結合位點；(3)引物3‘－OH結合位點；(4)底物dNTP結合位點；(5)5‘→3’外切酶結合位點；(6)3'→5'校正位點。第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制(二).DNA聚合酶Ⅰ的功能

1.5‘→3’聚合功能

2.3‘→5’外切活性

3.5‘→3’外切活性

(1)切口平移（nicktranslation）；

(2)鏈的置換；

(3)模板轉換（template-switching）

4.內(nèi)切酶活性第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制(三)DNA多聚酶Ⅲ的結構第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制全酶在DNA上的裝配分為三個階段：（1）一個β二聚體加上一個γ復合體識別引物模板形成一種前起始復合物。（2）DNA在于β,γ復合體結合的位點構象發(fā)生改變，而對核心酶產(chǎn)生了高親和。使核心酶能與DNA結合。（3）τ二聚體結合核心聚合酶，使其二聚化。第十一章DNA的復制二.DNA連接酶

其作用機制是分三步進行：1、E＋ATP→E－AMP＋ppi

在E.coli中，

E＋NAD→E－AMP＋NMN（煙酰胺單核苷酸）2、E-AMP上的AMP轉移到DNA的5‘-PO4上使其活化3、活化的5‘－PO4與相鄰的3’－OH作用形成3‘－5’

磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。第十一章DNA的復制三.單鏈結合蛋白又稱為雙螺旋去穩(wěn)定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177個aa組成在E.coli中以四聚存在分子量為74KDa在原核中SSB與DNA結合表現(xiàn)出協(xié)同效應。（1）SSB之間的相互作用；（2）第一個SSB和DNA的結合改變了DNA的結構。第十一章DNA的復制四.解旋酶(helicase)第十一章DNA的復制第五節(jié)原核生物，噬菌體和病毒的復制起

始和終止一.環(huán)狀DNA的復制第十一章DNA的復制第十一章DNA的復制復制起始區(qū)的結構特點是：（1）富含A－T，這可能和雙鏈易于解開起始復制有關；（2）含有多個回文結構（9－14個GATC）

8個GATC較保守,CATC中的“A”已甲基化;（3）具有4個反向重復順序，作為蛋白結合位點；（4）此順序的右側毗鄰區(qū)域有兩個起動子，其可能的作用是：①轉錄產(chǎn)生引物；②產(chǎn)生復制必要的蛋白；③產(chǎn)生調(diào)節(jié)功能的RN