食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)1、總則

食品安全關(guān)系到每一個(gè)消費(fèi)者的健康和利益，對(duì)國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定具有重大意義。特別是近年來(lái)，伴隨著經(jīng)濟(jì)全球化的進(jìn)程，全球性食品貿(mào)易的快速增長(zhǎng)及世界各國(guó)人民的飲食習(xí)慣各有不同，因此在相互貿(mào)易中，易產(chǎn)生認(rèn)識(shí)上的差異，致使國(guó)際間的貿(mào)易，常常發(fā)生摩擦。為了改善這種情況近年來(lái)世界各國(guó)政府、國(guó)際組織等積極創(chuàng)造條件，提出各種建議，進(jìn)行交流，以期達(dá)到漸趨一致的目的。相關(guān)體系國(guó)際微生物學(xué)會(huì)（IAMS）國(guó)際食品微生物規(guī)格委員會(huì)(ICMSF)世界糧農(nóng)組織(FAO)美國(guó)食品藥品管理局（FDA）1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)總則。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品樣品的采樣。第2頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、菌落總數(shù)測(cè)定

1、范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中菌落總數(shù)的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中菌落總數(shù)的測(cè)定。2、規(guī)范性引用文件。第3頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、菌落總數(shù)測(cè)定3術(shù)語(yǔ)和定義菌落總數(shù)食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、PH、需氧性質(zhì)等）所得1ml（g）檢樣中所含菌落的總數(shù)。本方法規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫需氧的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。

cfu：colony-formingunits菌落形成單位，一個(gè)細(xì)菌在平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成肉眼可見(jiàn)的菌落。第4頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、菌落總數(shù)測(cè)定4、設(shè)備和材料第5頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、菌落總數(shù)測(cè)定8菌落總數(shù)測(cè)定中的一些要求和規(guī)定（1）檢驗(yàn)中所用器皿滅菌前徹底洗滌干凈。（2）稀釋液可用滅菌生理鹽水、蒸餾水或磷酸鹽緩沖稀釋液。（3）樣品處理

A、液體樣品要充分混勻。含二氧化碳的酒類和飲料，要打開(kāi)待氣體全部逸出后方可檢驗(yàn)。酸性樣品用1mol/LNaoH,堿性樣品用1mol/LHcl調(diào)節(jié)PH7.0-7.2。

B、固體樣品，含鹽分高的食品用無(wú)鹽稀釋液，魚(yú)、肉類樣品用菌質(zhì)器研磨均勻（4）空白對(duì)照

A、樣品所用的稀釋液，每批都要有空白對(duì)照。

B、有顆粒的食品（特別是10-1的稀釋液）可同時(shí)作一塊平皿4℃環(huán)境放置，計(jì)數(shù)時(shí)用作對(duì)照。

C、做樣品的同時(shí)凈化室或凈化臺(tái)空氣暴露時(shí)間作一塊平皿對(duì)照。（5）培養(yǎng)溫度、時(shí)間樣品加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝固后，一定要翻轉(zhuǎn)平皿放36℃培養(yǎng)48小時(shí)，魚(yú)、蝦類水產(chǎn)品生活環(huán)境水溫較低，多采用30℃培養(yǎng)72小時(shí)。（6）菌落計(jì)數(shù)選取30-300之間作為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，1個(gè)稀釋度取2個(gè)平板取平均數(shù)，如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，一條鏈為一個(gè)菌落，來(lái)源不同的幾條鏈每條為一菌落。如乳酸桿菌和酵母菌應(yīng)排除不計(jì)。

(7)稀釋度的選擇a選取30-300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告b2個(gè)稀釋度都在30-300之間的視二者之比報(bào)告，比值＞2報(bào)告其中較小的數(shù)，比值≤2報(bào)告其平均數(shù)。c所有的稀釋度平均數(shù)都＜30，按稀釋度最低的報(bào)告。d所有的稀釋度均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，結(jié)果＜1，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。e如果幾個(gè)稀釋度都多不可計(jì)，按稀釋度最高的乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。(8)菌落數(shù)的報(bào)告（見(jiàn)表）

第6頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸菌群大腸菌群測(cè)定GB/T4789.3-20031范圍2規(guī)范性引用文件3術(shù)語(yǔ)與定義4設(shè)備和材料5培養(yǎng)基和試劑6檢驗(yàn)程序7操作步驟8大腸菌群測(cè)定中的一些要求和規(guī)定第7頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸菌群

1、范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中大腸菌群的測(cè)定。2、規(guī)范性引用文件3、術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)大腸菌群：一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以100ml(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示第8頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸菌群測(cè)定7操作步驟（1）樣品稀釋（2）乳糖發(fā)酵試驗(yàn)（3）分離培養(yǎng)（4）證實(shí)試驗(yàn)（5）結(jié)果報(bào)告第9頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸菌群測(cè)定

8大腸菌群測(cè)定中的一些要求和規(guī)定（1）檢驗(yàn)步驟（2）抑菌劑（3）挑選菌落（4）產(chǎn)氣量（5）MPN檢索表第10頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸菌群

菌落色澤與檢出率的關(guān)系培養(yǎng)基

黑紫色有金屬光澤無(wú)金屬光澤

粉紅色粉色EMB平板30/30(100)133/153(86.9)53/95(55.8)37/69(53.6)第11頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天糞大腸菌群測(cè)定

定義：系指一群在44.5℃條件下能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。第12頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天糞大腸菌群測(cè)定

操作程序：乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)氣→轉(zhuǎn)種EC肉湯44.5℃24±2h→產(chǎn)氣管劃線轉(zhuǎn)種EMB平皿36℃18~24h→有典型菌落者，證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。第13頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌大腸桿菌測(cè)定1初發(fā)酵2復(fù)發(fā)酵3平板分離4營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面5生化實(shí)驗(yàn)6結(jié)果報(bào)告第14頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌

革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，若在水和食品中檢出此菌，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)，從而可能有腸道病原菌的存在。

第15頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天染色法、培養(yǎng)基和試劑細(xì)菌的染色常用染料人工合成含苯的化合物，帶有染色基團(tuán)及助色基團(tuán)。染色基團(tuán)可使細(xì)菌著色，助色基團(tuán)增加兩者之間的親和力決定染料的酸堿性。

堿性染料：結(jié)晶紫、美蘭、堿性復(fù)紅。酸性染料：伊紅、剛果紅。中性染料：姬母薩、瑞氏。第16頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用染色方法簡(jiǎn)單染色第17頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用染色方法復(fù)合染色第18頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天特殊染色第19頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天①革蘭氏染色法：革蘭氏染色法是細(xì)菌細(xì)胞的復(fù)合染色法，由丹麥醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立的染色方法，它包括初染、媒染、脫色、復(fù)染較復(fù)雜的鑒別染色?；静襟E：涂片固定——結(jié)晶紫初染1min——碘液媒染1min——95%乙醇脫色0.5min——沙黃復(fù)染1min結(jié)果:

革蘭氏陽(yáng)性菌——紫色；

革蘭氏陰性菌——紅色。第20頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天

影響革蘭氏染色因素操作技術(shù)因素染液的因素細(xì)菌自身因素第21頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天

革蘭氏染色的結(jié)果，可受許多因素影響，造成錯(cuò)誤的染色反映，導(dǎo)致錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果。(1)操作技術(shù)因素

涂片不要過(guò)厚，應(yīng)保持細(xì)菌分散均勻，固定時(shí)應(yīng)避免菌體過(guò)分受熱，脫色時(shí)間應(yīng)反復(fù)實(shí)踐積累經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)本性質(zhì)而靈活掌握。一般以流下的脫色劑不帶有顏色即可。(2)染液的因素

所用染液均應(yīng)防止水分蒸發(fā)而影響濃度，特別是碘液存放太久或受光的作用而形成碘酸，而失去媒染的作用，故應(yīng)保存于棕色磨口滴瓶中，若發(fā)現(xiàn)碘色已淡則應(yīng)棄取。脫色酒精濃度95%為好，如果濃度不夠或涂片上積水過(guò)多均可影響脫色不好。(3)細(xì)菌本身因素

注意菌齡，一般以18-24h培養(yǎng)效果較好，如細(xì)菌過(guò)于衰老或死亡，G+菌結(jié)果可呈G-菌反應(yīng)。

影響革蘭氏染色因素第22頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基

根據(jù)各種微生物生長(zhǎng)的需要，用人工的方法將多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)配合制成的一種混合營(yíng)養(yǎng)料。第23頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天

配制培養(yǎng)基的原則

根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基，如自型微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應(yīng)該）由簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物質(zhì)組成。異養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機(jī)物質(zhì)。按微生物的主要類群來(lái)說(shuō)，又有細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌之分。它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同，分別稱為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基，麥芽汁培養(yǎng)基等。第24頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度與配比

營(yíng)養(yǎng)物的濃度：在一般情況下，濃度合適的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)才對(duì)微生物表現(xiàn)出良好作用，濃度大時(shí)對(duì)微生物生長(zhǎng)起抑制作用，濃度小時(shí)不能滿足微生物生長(zhǎng)的需要。各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度比：培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度比直接影響微生物的生長(zhǎng)與繁殖和（或）代謝產(chǎn)物的形成與積累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培養(yǎng)基中元素碳與元素氮的比值，有時(shí)也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白兩種成分含量之比）的影響更為明顯。例如在微生物的谷氨酸發(fā)酵中，培養(yǎng)基的C／N為4：l時(shí)，菌體大量繁殖，谷氨酸積累少；當(dāng)C／N為3：1時(shí)，菌體繁殖受到抑制，而谷氨酸大量增加。第25頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天控制培養(yǎng)基的PH值各類微生物生長(zhǎng)的最適pH各不相同，細(xì)菌與放線菌生長(zhǎng)的pH在7—7.5之間，酵母菌與霉菌生長(zhǎng)的pH值在4-5之間。在微生物的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，常會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值，為了維持培養(yǎng)基pH值的相對(duì)恒定，通常采用下列兩種方式：內(nèi)源調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。外源調(diào)節(jié)：按實(shí)際需要加酸或加堿。第26頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的種類按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類按培養(yǎng)基的功能分類按培養(yǎng)基的組成成分分類第27頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的物理狀態(tài)

液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基不含任何凝固劑，它常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)以及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物生理代謝等基本理論的研究工作。半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2-0.7％的瓊脂構(gòu)成的培養(yǎng)基。常用來(lái)觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的特征，以進(jìn)行菌種鑒定和噬菌體效價(jià)滴定等方面的實(shí)驗(yàn)工作。

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入1.5-2.0%的凝固劑制成的呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。常用于微生物的分離、純化、計(jì)數(shù)等方面的研究?？蒲信c生產(chǎn)中常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠三種，除在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑之外，一些由天然的固體基質(zhì)制成的培養(yǎng)基也屬于固體培養(yǎng)基第28頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的用途及功能1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基:含有細(xì)菌生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)成分，碳源、氮源及生長(zhǎng)素，最常用的是肉浸液。

2、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是指在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里加過(guò)葡萄糖、血液和生長(zhǎng)因子等一些特殊成分，常用是血瓊脂平板。3、鑒別培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入特定的作用底物指示劑，利用細(xì)菌分解糖類和蛋白質(zhì)的能力及代謝產(chǎn)物的不同來(lái)鑒別細(xì)菌。4、選擇培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)及抗生素，抑制一些細(xì)菌生長(zhǎng)，有助于需要的細(xì)菌種類的生長(zhǎng)。5、特殊培養(yǎng)基：包括厭氧菌培養(yǎng)和細(xì)菌L型培養(yǎng)，加入合適的營(yíng)養(yǎng)成分及還原劑等。第29頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基組成成分

合成培養(yǎng)基：由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基，該類培養(yǎng)基的組成成分精確、重復(fù)性強(qiáng)，但微生物生長(zhǎng)較慢，且價(jià)格昂貴，故一般適于在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)，研究生物營(yíng)養(yǎng)需要、代謝、分類鑒定、生物測(cè)定以及菌種選育、遺傳分析等方面的研究工作。天然培養(yǎng)基：利用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物質(zhì)(豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等）制成的培養(yǎng)基，天然培養(yǎng)基比較經(jīng)濟(jì)，除實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用外，更適宜于在生產(chǎn)上用來(lái)大規(guī)模地培養(yǎng)微生物和生產(chǎn)微生物產(chǎn)品。第30頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的基本成分1、1，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（1）蛋白胨氮源，是動(dòng)物或植物