限制性內(nèi)切酶第二章

限制性內(nèi)切酶第二章基因工程的基本流程第2頁,共90頁，2024年2月25日，星期天TOOLSFORGENECLONINGSCISSORS:RESTRICTIONENZYMESGLUE:DNALIGASEVEHICLE:PLASMIDORVIRALVECTORS第3頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第二章

基因工程中常用的工具酶

第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接第三節(jié)

其他工具酶第4頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第5頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和細(xì)菌的限制—修飾作用1、細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)1950年代初期，兩組科學(xué)家?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了限制修飾現(xiàn)象，當(dāng)時稱為宿主專一性:1952年，Luria,Humann等：T偶數(shù)噬菌體,

1953年，Bertani,Weigle等：λ和P2噬菌體。大量的研究結(jié)果證實λ噬菌體所表現(xiàn)的宿主限制和修飾現(xiàn)象更具普遍性和代表性。第6頁,共90頁，2024年2月25日，星期天E.coli-λ噬菌體的限制修飾模式

噬菌體在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時會受到限制。仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB對λ(K)進(jìn)行了修飾。第7頁,共90頁，2024年2月25日，星期天1959年，瑞士塞爾生物研究中心Arber提出限制一修飾理論：

核酸內(nèi)切酶降解細(xì)菌外源DNA,

修飾酶保護(hù)自身DNA2.細(xì)菌的限制—修飾理論的提出侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA（非甲基化），能被限制性內(nèi)切酶識別和降解，細(xì)菌通過這種方式進(jìn)行自我保護(hù)。第8頁,共90頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌自身的DNA可被甲基化酶修飾，①Dam甲基化酶--在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。②Dcm甲基化酶--在CCAGG序列的第2個胞嘧啶C5位引入甲基。2.細(xì)菌的限制—修飾理論第9頁,共90頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌自身的DNA可被甲基化酶修飾，從而防止限制性內(nèi)切酶的識別和水解。第10頁,共90頁，2024年2月25日，星期天WernerArber于1962-1968年發(fā)現(xiàn)限制與修飾體系，1968年分離得到I型限制酶EcoB.1970年，H.Smith首次從流感嗜血桿菌（H.influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到II型限制酶HindⅡ.1971年，D.Nathans用HindII繪制了猿猴病毒SV40的限制酶譜。

Arber,Smith和Nathans獲得了1978年Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。3.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第11頁,共90頁，2024年2月25日，星期天到1986年下半年，發(fā)現(xiàn)615種限制酶和98種甲基化酶。到2006年2月，共發(fā)現(xiàn)4583種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3773種，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有68、3692、10種。3.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第12頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第13頁,共90頁，2024年2月25日，星期天限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)中有兩個部分組成：1.核酸酶2.甲基化酶?來源：細(xì)菌染色體、噬菌體/病毒?限制性內(nèi)切酶不僅受病毒感染的影響，還可隨DNA的連接、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染而傳給其他個體二、限制性核酸內(nèi)切酶的定義?限制性內(nèi)切酶是一組可以特異性地識別DNA上的某一特定序列，并將之水解的核酸酶。第14頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

限制性核酸內(nèi)切酶，是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。第15頁,共90頁，2024年2月25日，星期天限制酶裂解DNA雙鏈的磷酸二酯鍵酶切得到5`-P和3`-OH第16頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第17頁,共90頁，2024年2月25日，星期天三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名①第1個字母大寫，表示來源物種屬名的第一個字母。②第2、3個字母小寫，表示來源物種種名的前二個字母。③如果細(xì)菌有不同的血清型，則有第四個字母，小寫，且與前3個字母緊緊排在一起。HindⅢ：Haemophilusinfluensaed④當(dāng)控制宿主的限制、修飾系統(tǒng)的遺傳因子位于病毒和質(zhì)粒上時，需要在名稱中標(biāo)出遺傳成分。EcoRI：EscherichiacoliR⑤若從一種細(xì)菌中分離出幾種不同的酶，則根據(jù)發(fā)現(xiàn)順序用羅馬數(shù)字表示。Sac

I(II)：StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)第18頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第19頁,共90頁，2024年2月25日，星期天性質(zhì)酶Ⅰ酶Ⅱ酶Ⅲ結(jié)構(gòu)與功能三亞基多功能酶單一功能的酶同型二聚體二亞基雙功能的酶限制與修飾酶蛋白同時具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同時具有甲基化作用限制作用的輔助因子ATP,Mg2+,SAM（S-腺苷甲硫氨酸）Mg2+ATP,Mg2+,SAM寄主特異性位點序列特異性,非對稱序列特異性,旋轉(zhuǎn)對稱序列特異性,非對稱序列切割位點在距寄主特異性位點至少1kb的地方位于寄主特異性位點或其附近在距寄主特異性位點3′端24~26bp處切割方式隨機(jī)切割特異切割特異切割甲基化作用位點寄主特異性的位點寄主特異性的位點寄主特異性的位點在DNA克隆中的用途無十分有用有用四、限制性核酸內(nèi)切酶的分類及主要特征第20頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第21頁,共90頁，2024年2月25日，星期天五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性?是用途最廣、最簡單的一種限制性內(nèi)切酶。?II型限制性內(nèi)切酶的形式多樣，從大小上來說，它們可以小到如PvuII(157個氨基酸)，也可以比1250個氨基酸的CjeI更大。在已純化分類的3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過250種的特異識別序列。第22頁,共90頁，2024年2月25日，星期天?根據(jù)酶的作用特點，II型限制性內(nèi)切酶分為3類：A.最普遍的是HhaI、HindIII和NotI這樣在識別序列中進(jìn)行切割的酶。有以下4種情況：

a)大部分這類酶都以同源二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識別的是對稱序列；b)但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。c)一些酶識別連續(xù)的序列(如EcoRI識別GAATTC)d)而另一些識別不連續(xù)的序列(如BglI識別GCCNNNNNGGC)1、根據(jù)酶作用特點進(jìn)行的分類五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性第23頁,共90頁，2024年2月25日，星期天B.IIS型酶?另一種比較常見的酶是所謂的IIS型酶，比如FokI和AlwI，它們在識別位點之外切開DNA。這些酶的大小居中，約為400-650個氨基酸左右；它們識別連續(xù)的非對稱序列，有一個結(jié)合識別位點的域和一個專門切割DNA的功能域。一般認(rèn)為這些酶主要以單體的形式結(jié)合到DNA上，但與臨近的酶結(jié)合成二聚體，協(xié)同切開DNA鏈。因此一些IIS型的酶在切割有多個識別位點的DNA分子時，活性可能更高。第24頁,共90頁，2024年2月25日，星期天C.第三種II型限制性內(nèi)切酶?第三種II型限制性內(nèi)切酶(有時也被稱為IV型限制性內(nèi)切酶)是一類較大的、集限制和修飾功能于一體的酶，通常由850-1250個堿基組成，在同一條多肽鏈上同時具有限制和修飾酶活性。有些酶識別連續(xù)序列，并在識別位點的一端切開DNA鏈；而另一些酶識別不連續(xù)的序列(如BcgI：CGANNNNNNTGC)，并在識別位點的兩端切開DNA鏈，產(chǎn)生一小段含識別序列的片段。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結(jié)構(gòu)組成是一致的。他們在N端由一個負(fù)責(zé)切開DNA的功能域，這個域又與DNA修飾域連接；此外還有一到兩個識別特異序列的功能域構(gòu)成C端，或以獨立的亞基形式存在。當(dāng)這些酶與底物結(jié)合時，它們或行使限制性內(nèi)切酶的功能切開底物，或作為修飾酶將其甲基化。第25頁,共90頁，2024年2月25日，星期天識別位點與酶切位點高度一致，具有高度特異性極為穩(wěn)定輔酶:Mg2+2、II型限制性內(nèi)切酶的特點五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性第26頁,共90頁，2024年2月25日，星期天（1）限制酶識別序列的長度限制性內(nèi)切酶在雙鏈DNA上能夠識別的特殊核苷酸序列被稱為識別序列。識別序列的長度一般為4～8個堿基，最常見的為6個堿基。切割頻率理論上為1/4n（n為識別序列長度），實際上與序列有關(guān)。3、識別序列MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外側(cè)，產(chǎn)生５’-端突起五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性第27頁,共90頁，2024年2月25日，星期天（3）限制酶識別序列的結(jié)構(gòu)限制酶識別序列大多具有回文對稱結(jié)構(gòu)

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

有些限制酶的識別序列不對稱AccBSⅠCCG↓CTCGGC↑GAG（2）富含GC第28頁,共90頁，2024年2月25日，星期天Ⅱ型酶識別回文序列第29頁,共90頁，2024年2月25日，星期天有些限制酶可識別多種序列

有些限制酶識別的序列呈間斷對稱，對稱序列之間含有若干個任意堿基。

AlwNⅠCAGNNNCTGGTCNNNGAC

AccⅠGTMKACCAKMTGM=A、CK=G、T第30頁,共90頁，2024年2月25日，星期天（4）限制酶切割的位置限制酶對DNA的切割位置大多數(shù)在識別序列內(nèi)部，但也有在外部的。（5）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是５’-Ｐ和３’-ＯＨ第31頁,共90頁，2024年2月25日，星期天4．末端種類(切割方式)（1）5’-黏性末端和3’-黏性末端（cohesiveend）識別位點為回文對稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為黏性末端，這樣形成的兩個末端是相同的，也是互補的。（2）平末端（Bluntend）在回文對稱軸上同時切割DNA的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端。如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性第32頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共90頁，2024年2月25日，星期天粘性末端的意義連接方便不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。第34頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共90頁，2024年2月25日，星期天5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。3’末端標(biāo)記凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。補平成平齊末端粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。粘性末端的意義第39頁,共90頁，2024年2月25日，星期天部分常用的限制性內(nèi)切酶第40頁,共90頁，2024年2月25日，星期天（3）非互補黏性末端(不對稱末端)當(dāng)識別序列為非對稱序列時，切割的DNA產(chǎn)物的末端是不同的。

BbvCⅠ

CCTCAGCGGAGTCGCCTCAGCGGAGTCG第41頁,共90頁，2024年2月25日，星期天能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

第42頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共90頁，2024年2月25日，星期天(1).識別不同，切割不同

eg:BamHIEcoRI

-GGATC

C- -A

GATCT-

-C

CTAGG--TCTAG

A-

(2).識別不同，切割產(chǎn)生末端相同(同尾酶)

eg:BamHI Bg1Ⅱ

-A

GATCT-G

GATCC

-TCTAG

A-CCTAG

G5.識別位點與切割方式之間的關(guān)系五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性第44頁,共90頁，2024年2月25日，星期天(3).識別相同，切割不同

eg:SmaI XmaI-CCC

GGG- -C

CCGG

-GGG

CCC--GGGCC

C-

(4)．識別相同，切割相同──同工酶

同裂酶

eg:HpaⅡ MspⅠ

-CC

GG- -C*C

GG-

-GG

CC- -GG

CC-

第45頁,共90頁，2024年2月25日，星期天同裂酶（isoschizomers）

概念用途

有一些同裂酶對于切割位點上的甲基化堿基的敏感性有所差別，所以可以用來研究DNA甲基化作用。KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

有一些來源不同的限制性酶識別的是相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。第46頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

用途

如：限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對同裂酶，共同的靶序列是CCGG。當(dāng)其靶序列中含有一個5-甲基胞嘧啶（CCGG，*號表示甲基化的堿基），HpaⅡ不能夠切割它，而MspⅠ對于這個核苷酸的甲基化作用的反應(yīng)則是中性的，它不管C殘基甲基化與否都能夠切割之。*

現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)，許多動物DNA中90%以上的甲基，都是在序列CG處以5-甲基胞嘧啶的形式出現(xiàn)。所以，通過比較HpaⅡ和MspⅠ的DNA消化產(chǎn)物就可以檢測出甲基化的存在。第47頁,共90頁，2024年2月25日，星期天同尾酶（isocaudamer）

概念

常用的限制酶BamHⅠ、BacⅡ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一組同尾酶，它們切割DNA后都形成由GATC4個核苷酸組成的粘性末端。

舉例與同裂酶對應(yīng)的一類限制性酶，它們雖然來源各異，識別的靶序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端，這類酶稱為同尾酶。第48頁,共90頁，2024年2月25日，星期天BamHI

5′...G^GATCC...3′3′...CCTAG^G...5′

BglII5′...A^GATCT...3′3′...TCTAG^A...5′Sau3A5′...^GATC...3′3′...CTAG^...5′

第49頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

用途由于同尾酶切割DNA后產(chǎn)生的是粘性末端，因此，可以通過粘性末端之間的互補作用而彼此連接起來，這在基因克隆實驗中是很有用處的。由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價結(jié)合形成的位點，特稱為雜種位點（hybridsite）同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后，形成的新位點，不能再被原來的酶所識別。第50頁,共90頁，2024年2月25日，星期天5’-G

3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A同尾酶的粘性末端結(jié)合形成的新位點不能再被原來的酶識別BamHIGGATCCBglII

AGATCTMboI,Sau3AINGATCN第51頁,共90頁，2024年2月25日，星期天6、酶切位點在DNA上出現(xiàn)的頻率?II型限制性內(nèi)切酶的酶切位點在DNA上出現(xiàn)的頻率受DNA的長度、識別位點的長度以及GC含量的影響。?當(dāng)GC：AT＝1：14bp的識別位點：1/44＝256bp如：HaeIIIGGCC6bp的識別位點：1/46＝4096bp?因此當(dāng)一個酶的識別位點為6bp時，在DNA上每4000bp才會出現(xiàn)一次。五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性第52頁,共90頁，2024年2月25日，星期天?

另外一些不常見的酶識別位點相對較長，在DNA鏈上出現(xiàn)頻率也相對較低。①如FseIGGCCGGCC，出現(xiàn)頻率為1/48。?實際上由于不同生物體的DNA堿基含量不同，酶的識別位點的分布和頻率也不同。②大腸桿菌基因組中AT含量較豐富，所以富含AT的識別序列(如DraI：TTTAAA；PshBI：ATTATT；SspI：AATTAA)較為頻繁的出現(xiàn)；③鏈霉菌基因組因GC含量高，相應(yīng)的富含GC堿基對的識別序列(NaeI：GCCGGC；SmaI：CCCGGG-；SacII：CCGCGG)較常見。?真核生物中，DNA中的CG:GC=1:3，這也影響酶切位點的出現(xiàn)頻率。第53頁,共90頁，2024年2月25日，星期天7五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性第54頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共90頁，2024年2月25日，星期天8、對寡核苷酸的活性?盡管是雙鏈、有識別位點，但因為太短，酶不能與DNA有效結(jié)合，所以不能切割。?當(dāng)2個酶切位點距離非常近的時候，它們之間由于競爭結(jié)合位點，所以也會相互干擾。五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性第56頁,共90頁，2024年2月25日，星期天9.其它特異性的內(nèi)切酶及其用途1.λ末端酶（λterminase）：

5’-GGGCGGCGACCTN--3’N--5’，出現(xiàn)的頻率約412

分子量為

117,000=1A（74,000）+2Nul（21,000）2.Omega核酸酶（I-SceI）：

由內(nèi)含子編碼，用于rRNA的剪切，出現(xiàn)的頻率約418=6.9X1010bp，其識別順序為

5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’

TATT

3.I-PpoI：來自于Physarumpolycephalum

識別序列：CTCTCTTAAGGTAGC

AATT4.用途:遺傳標(biāo)記，構(gòu)建載體五、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性第57頁,共90頁，2024年2月25日，星期天一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第58頁,共90頁，2024年2月25日，星期天Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件第59頁,共90頁，2024年2月25日，星期天五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素

酶的純度

DNA樣品的純度

DNA的甲基化程度酶切反應(yīng)的溫度和時間

DNA分子的結(jié)構(gòu)限制性內(nèi)切核酸酶的反應(yīng)緩沖液六、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素第60頁,共90頁，2024年2月25日，星期天高質(zhì)量的限制性核酸內(nèi)切酶，要求:

不存在其他核酸內(nèi)切酶或外切酶的污染;

長時間酶解不出現(xiàn)識別順序特異性的下降;

酶解的DNA片段連接后能重新被識別和切割等.

酶的純度第61頁,共90頁，2024年2月25日，星期天1.DNA制劑中可能抑制限制性核酸內(nèi)切酶活性的物質(zhì):

蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精乙二胺四乙酸（EDTA）十二烷基硫酸鈉（SDS）高濃度的鹽離子等

DNA樣品的純度第62頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2.提高限制性內(nèi)切核酸酶對低濃低純度DNA制劑反應(yīng)效率的方法①純化DNA；②增加核酸內(nèi)切酶的用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些；③擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇豁憫?yīng)地稀釋；④延長酶催化反應(yīng)的保溫時間。第63頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

DNA的甲基化1.原核生物的限制-修飾系統(tǒng)的組成成分是：甲基化酶：對自身DNA起修飾作用，從而使限制性內(nèi)切核酸酶不能識別，保護(hù)自身DNA免受降解。限制性內(nèi)切核酸酶：破壞入侵的外源DNA，防御異源遺傳信息進(jìn)入體內(nèi)。因此，甲基化作用直接影響限制性內(nèi)切核酸酶的活性第64頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

?大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一個胞嘧啶C-5位置上引入甲基。部分限制性內(nèi)切酶對甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等。而要解除這種限制修飾作用通常有兩種方法：①選用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA識別切割位點與MboI相同；但不受甲基化影響；

DNA的甲基化第65頁,共90頁，2024年2月25日，星期天第66頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

?解除限制修飾作用的方法：②利用甲基化酶缺失的受體細(xì)胞進(jìn)行DNA的制備，如E.coliJM110和鏈霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而后者細(xì)胞內(nèi)本就沒有甲基化酶，從這些細(xì)胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。

DNA的甲基化第67頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

酶切反應(yīng)的溫度

DNA酶切反應(yīng)的溫度是影響限制性內(nèi)切核酸酶活性的另一個重要因素。不同的核酸內(nèi)切酶，具有不同的最適溫度，而且彼此之間有很大的變動范圍。但是大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃。第68頁,共90頁，2024年2月25日，星期天酶反應(yīng)溫度（℃）ApaⅠBanⅠBstEⅡMaeⅠMaeⅡMaeⅢSmaⅠTaqⅠ3050604550552565部分限制性內(nèi)切核酸酶的最適反應(yīng)溫度第69頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

DNA分子結(jié)構(gòu)DNA分子的不同的構(gòu)型對限制性內(nèi)切核酸酶的活性也有很大的影響。

某些核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA高出許多倍，最高的可達(dá)20倍。第70頁,共90頁，2024年2月25日，星期天DNA末端長度對限制酶切割的影響:限制酶切割DNA時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。

DNA分子結(jié)構(gòu)第71頁,共90頁，2024年2月25日，星期天近末端的切割：

eg:AccIGGTCGACC

切不動

CGGTCGACCG 切不動

CCGGTCGACCGG切不動

eg:EcoRIGGAATTCC CGGAATTCCG

2小時內(nèi)90%完全酶切

eg:PmeIGTTTAAAC 20小時不能切

GGTTTAAACC20小時，25%切開

GGGTTTAAACCC20小時，50%切開

AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG20小時，90%切開第72頁,共90頁，2024年2月25日，星期天位點偏愛（Sitepreference）某些限制酶對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點偏愛。λ噬菌體DNA全長48,502bp，有5個EcoRⅠ酶切位點。切割時并非在5個位點隨機(jī)進(jìn)行，靠近右端的位點比分子中間的位點切割快10倍。

DNA分子結(jié)構(gòu)一般來說，一種限制性內(nèi)切核酸酶對其不同識別位點切割速率的差別最多不會超過10倍。第73頁,共90頁，2024年2月25日，星期天造成位點偏愛現(xiàn)象的原因

限制酶在切割DNA之前需要同時與兩個識別位點作用；限制酶對要求作用的DNA序列有兩個明顯不同的結(jié)合位點，其中一個是為DNA切割時激活另一個的變構(gòu)位點。

DNA分子結(jié)構(gòu)第74頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液1.緩沖液的主要成分Tris-Cl：使反應(yīng)混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值范圍內(nèi)。對絕大數(shù)限制酶來說，最佳pH=7.4。MgCl2：保證酶活性的正常發(fā)揮。NaCl或KCl：同上。35第75頁,共90頁，2024年2月25日，星期天β-巰基乙醇：防止限制酶的氧化，保持酶的穩(wěn)定性（但也可能有利于潛在污染雜質(zhì)的穩(wěn)定性）。牛血清白蛋白（BSA）：對某些限制酶是必需的，它是一種中性蛋白，可防止酶在低濃度蛋白質(zhì)溶液中變性。

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液1.緩沖液的主要成分第76頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2.緩沖液的分類

不同酶對緩沖液的離子強度要求不同，據(jù)此緩沖液可分為如下三種：低鹽緩沖液（L）：10mmol/LNaCl

中鹽緩沖液（M）：50mmol/LNaCl

高鹽緩沖液（H）：100mmol/LNaCl

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液第77頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液3.限制性內(nèi)切核酸酶的多酶聯(lián)合酶解對鹽濃度要求相同的酶，原則上可同時酶切第78頁,共90頁，2024年2月25日，星期天對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：①低鹽酶先切，然后補加NaCl，再用高鹽酶切②一種酶先切，然后用乙醇沉淀酶解產(chǎn)物，再重懸于另一種緩沖液中用另一種酶切。③使用適合所有限制酶的通用緩沖液，如KGB（谷氨酸鉀緩沖液）

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液3.限制性內(nèi)切核酸酶的多酶聯(lián)合酶解第79頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液4.星號活性（staractvity）

限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點是在特定的消化條件下測定的，當(dāng)條件改變時，有些酶的識別位點也隨之改變，可能切割一些與特異識別序列相類似的序列，這種現(xiàn)象稱為星號活性。①概念實際上星號活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點。第80頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液4.星號活性（staractvity）①概念（以EcoRⅠ為例）

EcoRⅠ在正常條件下識別并切割GAATTC，但在甘油濃度超過5%（V/V）時，也可切割NAATTN（其中N=A、T、C、G），用EcoRⅠ*表示。第81頁,共90頁，2024年2月25日，星期天

限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液4.星號活性（