染色體工程概述

染色體工程主要內(nèi)容定義多倍體育種單倍體育種：動物的單體生殖雌、雄核發(fā)育：人工單性生殖人工染色體(YAC)染色體顯微鏡操作技術(shù)染色體微克隆染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)第一部分Part

One染色體工程的定義染色體工程是指人們按設(shè)計有計劃削減、添加和代換同種或異種染色體的方法和技術(shù)。也稱為染色體操作。染色體工程的基本程序是人工雜交，細(xì)胞學(xué)鑒定，在雜種或雜種后代中篩選所需要的材料。以普通小麥為例，常用的材料如下：單體與缺體系統(tǒng)；三體系統(tǒng)；異附加系；異代換系；易位系。多倍體育種(1)定義：多倍體育種是利用人工誘變或自然變異篩選等途徑，獲得多倍體材料，用以選育多倍體新品種的技術(shù)。(2)歷史背景植物領(lǐng)域：巨大月見草為第一個多倍體。三倍體歐洲山楊是最早林木多倍體。動物領(lǐng)域：1939年，F(xiàn)ankhauser和Griffiths首先成功培育兩棲類三倍體。多倍體育種的優(yōu)勢多倍體草莓多倍體植物的性狀比原來的二倍體氣孔、花、果實(shí)和種子比二倍體者為大，葉肉較厚，莖稈也較粗壯。四倍體鯽魚多倍體動物如兩棲類、魚類、貝類都具有良好的生存力和生長率。多倍體技術(shù)方法秋水仙素法培育無籽西瓜010203生物誘變法：動物通過雜交方法尤其是種間雜交獲得異源多倍體。種間雜交導(dǎo)致第二極體不排出。植物包括胚乳培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交等?；瘜W(xué)誘變法：利用化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)多倍體。常用的化學(xué)物質(zhì)有：細(xì)胞松弛素B、秋水仙素，還有麻醉劑、聚乙二醇。物理誘變法：溫度激變（溫度休克法）、機(jī)械損傷、電離輻射、離心、水靜壓法和高鹽高堿法等。Part

Two第二部分單倍體育種：動物的單性生殖孤雌生殖單性生殖僅由雄性配子或者雌性配子發(fā)育成單性個體的生殖方式叫做動物的單性生殖。是指精子單獨(dú)發(fā)育為單倍體，或者精卵結(jié)合后，卵核在受精前失活，由精核在卵細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)發(fā)育成單倍體，因此只含有一套雄配子染色體。自然界，動物的孤雄生殖幾乎是不存在的。卵子單獨(dú)發(fā)育為單倍體，或是指精核進(jìn)入卵細(xì)胞后未與卵核融合而退化，卵核未經(jīng)受精而依靠自己的細(xì)胞核發(fā)育成個體的生殖行為。其子代的遺傳物質(zhì)完全來自雌核，只具有母本的性狀。孤雄生殖單倍體的特點(diǎn)和優(yōu)越性育種上具有極高價值，可獲得純合二倍體。提高選育效率。能克服遠(yuǎn)緣雜交的不孕性，創(chuàng)造出新物種?？煽朔s種分離的困難，縮短雜交育種時間，一年可獲自交系，兩年可獲純系。具有一套染色體，每個基因都能表現(xiàn)相應(yīng)的性狀，易發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的突變，尤其是隱性突變，所以單倍體是研究基因或基因劑量效應(yīng)，進(jìn)行染色體遺傳分析的理想實(shí)驗材料。單倍體的特點(diǎn)單倍體的優(yōu)越性雌、雄核發(fā)育：人工單性生殖是指因經(jīng)過紫外線、X射線或γ射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。自然界里一些無脊椎動物和魚類等存在此現(xiàn)象，用于魚類研究。研究較少。假受精，指精子雖然正常地鉆入和激活卵子，但精子的細(xì)胞核并未參與卵球的發(fā)育，精子在染色體中很快消失，胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳的控制下進(jìn)行的一種發(fā)育方式。雌核發(fā)育雄核發(fā)育人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法要達(dá)到實(shí)驗性二倍體雌核發(fā)育目的，必須解決兩個問題：①精細(xì)胞遺傳物質(zhì)失活②阻止雌性個體染色體數(shù)目的減少精子遺傳物質(zhì)的失活物理方法：輻射方法處理包括紫外線、X射線、伽馬射線?；瘜W(xué)方法：甲苯胺藍(lán)，乙烯尿素，二甲基硫酸等化學(xué)物質(zhì)其機(jī)理是與精子DNA相互作用。顯微操作方法：直接去除受精卵中雄性原核，再在第一次卵裂時期二倍體化，而得到雌核發(fā)育的二倍體。雌核染色體二倍體化利用保留卵球第二極體，或阻礙受精卵早期有絲分裂，都可二倍體化。如溫度冷休克、熱休克、流體靜水壓、細(xì)胞松弛素B、聚乙二醇處理等，已在魚類實(shí)現(xiàn)。雌核發(fā)育的鑒別通常以顏色形態(tài)、生化、細(xì)胞學(xué)等指標(biāo)為依據(jù)，鑒別雌核發(fā)育的個體。雌核發(fā)育囊胚細(xì)胞中只出現(xiàn)一套來自雌核的染色體。雌核發(fā)育的鑒別用遺傳標(biāo)志鑒別雄核發(fā)育的二倍體化，即由第一次有絲分裂的阻礙，還是由保留極體而來。假如二倍體源自第一次有絲分裂的抑制，雜合雌性個體的子代都是純合型；而如果是通過阻止第二極體的外排產(chǎn)生的雌核發(fā)育個體，則子代的情況取決于著絲點(diǎn)與基因間的距離。在著絲點(diǎn)-基因距離遠(yuǎn)離時，將明顯增加雜合型子代的比例。雌核發(fā)育的意義生產(chǎn)單性種群已經(jīng)成功地得到100％草魚、鯉魚的雌性個體，但也會導(dǎo)致后代近親繁殖的衰退，因此其實(shí)際應(yīng)用價值有待研究。產(chǎn)生同源型二倍體育種為基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供了一種優(yōu)越的研究品系。為遺傳學(xué)研究提供某些致死突變種的生物品質(zhì)，成為個體發(fā)育研究和遺傳育種實(shí)踐的好材料。農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)通過雌核發(fā)育引入單性雌體子代，人工控制性別，獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品系。第三部分Part

Three人工染色體的定義指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。人工染色體為基因組圖譜制作、基因分離以及基因組序列分析提供了有用的工具。常見的人工染色體以BAC和YAC應(yīng)用最廣泛酵母人工染色體(YAC)細(xì)菌人工染色體(BAC)P1派生人工染色體(PAC)哺乳動物人工染色體(MAC)人類游離人工染色體(HAEC)保持酵母染色體穩(wěn)定三個要素3復(fù)制點(diǎn)DNA1著絲粒DNA著絲粒DNA2端粒DNAYAC克隆技術(shù)早期插入的外源DNA片段，限制在100~200kb左右，難以獲得更長的DNA片段，原因是當(dāng)時所采用的生物化學(xué)方法，在提取細(xì)胞總DNA時，不可避免的要發(fā)生DNA斷裂及降解，后來低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋法及脈沖電源技術(shù)的出現(xiàn)，使得對于大基因合大基因簇的分析成為可能。YAC目前是比較理想的具有最大容量的人工載體。YAC克隆技術(shù)的步驟(1)完整的染色體DNA的提取

(2)基因組DNA酶切大片段的獲取

用于脈沖電泳(PFGE)的高分子量標(biāo)記的制備：SCE法和EDTA法

目的DNA的酶切最適條件(控制內(nèi)切酶量實(shí)現(xiàn))

最適DNA大片段回收YAC克隆技術(shù)的步驟(3)YAC載體臂的制備

(4)YAC臂與目的DNA大片段的連接

(5)YAC重組體對酵母的轉(zhuǎn)化

YAC克隆技術(shù)：酵母原生質(zhì)體的制備

YAC重組體對酵母的轉(zhuǎn)化YAC克隆技術(shù)的步驟(6)YAC基因庫的保存

(7)YAC基因庫的鑒定

高分子量標(biāo)記的制備

隨機(jī)挑取100個YAC轉(zhuǎn)化子，制備完整DNA

脈沖電泳分離Southern轉(zhuǎn)移

預(yù)雜交預(yù)雜交標(biāo)記探針

YAC克隆技術(shù)的步驟(8)目的基因YAC克隆的篩選

PCR法對YAC克隆進(jìn)行篩選

菌落原位雜交作為輔助手段進(jìn)行篩選

(9)目的基因YAC克隆的鑒定

用目的基因的序列、pBR322和PCR產(chǎn)物微探針進(jìn)行雜交鑒定

YAC的主要用途(1)YAC克隆重疊群是物理圖譜的主要框架。它不僅可容納大片段的外源DNA，而且在構(gòu)建基因組文庫時需要較少的克隆。

(2)用YAC克隆構(gòu)建的物理圖譜在復(fù)雜的生物基因組分析和DNA測序中發(fā)揮著重要作用。目前，用YAC提供大片段DNA構(gòu)建染色體圖譜的技術(shù)已在人類、植物、昆蟲、鳥類、兩棲類等動物中得到廣泛應(yīng)用，相比于早期的DNA片段載體，YAC是容納大片段外源DNA的首選載體。

YAC的主要用途(3)在基因功能研究中，基因嵌入及轉(zhuǎn)基因技術(shù)都采用了YAC克隆系統(tǒng)。通過YAC嵌入的基因不僅片段長，而且嵌入的基因更適于體內(nèi)表達(dá)，并有利于基因保持其固有的空間構(gòu)象和功能的發(fā)揮。

YAC的缺點(diǎn)插入的片段較大，穩(wěn)定性較差，不易操作插入的大片段常發(fā)生缺失，使文庫不完整YAC與酵母天然染色體的分子結(jié)構(gòu)類似，分離時難以與天然染色體分開文庫中的嵌合現(xiàn)象嚴(yán)重，嵌合體往往占克隆總數(shù)的5%~50%插入片段較大，往往發(fā)生序列重排，造成序列錯亂染色體顯微操作技術(shù)流式細(xì)胞分類器法微細(xì)玻璃針切割法激光顯微切割法染色體顯微操作技術(shù)流式細(xì)胞分類器法由于染色體上DNA的堿基序列是隨機(jī)分布的，各條染色體組成不同，而染料Hoechst只對A-T特異性染色，而染Chromomycin只對G-C特異性染色。因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結(jié)合的量和比例是不同的。所以結(jié)合染料后，再經(jīng)激光照射，染色體會呈現(xiàn)不同的熒光帶。將特定染色體發(fā)出的熒光波長輸入計算機(jī)，通過計算機(jī)控制就可將發(fā)出同一波長的染色體收集在一起，實(shí)現(xiàn)染色體的分離。

基本步驟010203細(xì)胞分裂同步處理：秋水仙素，抑制紡錘絲形成，使細(xì)胞分裂停留在中期。染色體熒光素染色：細(xì)胞溫和破碎，染色。染色體分離：把制備的染色體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞分類器上進(jìn)行分離微細(xì)玻璃針切割法采用特細(xì)玻璃針（直徑0.17微米），在倒置顯微鏡下對目的基因所在染色體區(qū)段進(jìn)行切割與分離，隨后進(jìn)行DNA擴(kuò)增以構(gòu)建染色體特異性文庫。

優(yōu)缺點(diǎn)：可對染色體直接進(jìn)行切割分離，費(fèi)用低，但技術(shù)性要求高、不易掌握。激光顯微切割法染色體標(biāo)本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)基上制作，利用激光共焦掃描顯微系統(tǒng)，激光照射非選擇染色體，只留下目的染色體。

優(yōu)缺點(diǎn)：在一種環(huán)境中操作避免了污染，樣品可長時間保存，與玻璃針相比操作簡便、容易掌握；但是激光儀器昂貴，切割一次費(fèi)用較高。激光共聚焦掃描顯微鏡第四部分Part

Four染色體微克隆酶解直接克隆法PCR介導(dǎo)的克隆法將切取的染色體移入含有蛋白酶的微滴中，經(jīng)去蛋白酚和氯仿抽提EcoR1酶解染色體DNA，然后加入經(jīng)EcoR1酶切的載體DNA，加入連接酶使染色體DNA和載體DNA結(jié)合，最后將微滴tris稀釋液稀釋后，進(jìn)行體外包裝。載體介導(dǎo)的PCR法

利用簡并引物直接PCR法連接引物PCR法

利用單一引物PCR法染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)定義：將染色體(甚至是全套染色體)和分離提取的細(xì)胞核或DNA大分子片段，可采用細(xì)胞融合或細(xì)胞顯微注射法將染色體或染色體片段導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使該基因能得以表達(dá)，并能在細(xì)胞分裂中傳遞下去的技術(shù)稱為染色體轉(zhuǎn)移或染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)。染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法細(xì)胞核融合轉(zhuǎn)移法染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法定義：是指分離得到相應(yīng)的染色體細(xì)胞的一種技術(shù)基本步驟：誘發(fā)細(xì)胞同步分裂，用秋水仙胺阻斷細(xì)胞分裂于中期，破碎細(xì)胞，通過離心收集大量的中期染色體，再通過適當(dāng)?shù)姆植炕蜻M(jìn)一步的分類，轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，導(dǎo)入基因的受體細(xì)胞的分離和鑒定。篩選鑒定染色體組型分析堿性Giemsa染色法。同工酶分析對分離細(xì)胞的某些組成性同工酶如LDH等進(jìn)行分析。其他方法免疫學(xué)技術(shù)測定同工酶，或者同位素標(biāo)記染色體的放射自顯影技術(shù)來鑒定。微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法定義：微細(xì)胞是指含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。優(yōu)點(diǎn)：簡化供體基因的表達(dá)，對受體細(xì)胞影響小，微核染色體穩(wěn)定。以微細(xì)胞為供體，通過與遺傳性完整的受體細(xì)胞融合，從而將微細(xì)胞內(nèi)所含有的幾條或一條染色體轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞中去，而成為能夠存活的雜合細(xì)胞的一種技術(shù)。微細(xì)胞的制備先用阻斷有絲分裂試