熒光分光光度法與檢測技術

熒光分光光度法與檢測技術◆學習目的通過學習熒光分析法的基本原理，產生熒光的條件以及熒光光譜特征和用途，加深對熒光分析的依據、條件和應用的理解，并能選擇熒光物質的激發(fā)波長和熒光波長進行分析。為學習藥物分析、天然藥物化學等專業(yè)課程奠定基礎。第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天◆知識要求熟悉掌握熒光和磷光產生的原理和特點及區(qū)別；激發(fā)光譜與熒光光譜的概念及用途；溶液熒光光譜的特征；產生熒光的條件；熒光定量分析的依據、條件和方法。了解。了解影響熒光強度的因素，熒光分析儀器及其與紫外-可見分光光度計的區(qū)別，熒光分析新技術在分析中的應用。第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天◆能力要求掌握熒光分光光度計的基本結構及儀器的基本操作方法，學會使用熒光分光光度計對藥物進行分析的操作技術。第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)熒光分光光度法的基本原理

某些物質吸收紫外-可見光后，可以發(fā)射其波長比吸收光更長的光，并且隨照射光的消失而消失，這種發(fā)射光稱為熒光（fluorescence）。熒光分析法（fluorometry）是利用某些物質發(fā)射熒光的特性進行定性、定量分析的光學分析方法，又稱熒光光譜法第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理一、熒光的產生過程（一）單重態(tài)與三重態(tài)A單重基態(tài)B激發(fā)單重態(tài)C激發(fā)三重態(tài)第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理（二）熒光的產生電子由激發(fā)單重態(tài)→基態(tài)單重態(tài)的躍遷第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理（二）磷光的產生電子由激發(fā)三重態(tài)→基態(tài)單重態(tài)的躍遷課堂互動您能比較熒光和磷光的主要區(qū)別嗎？第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理二、激發(fā)光譜和熒光光譜（發(fā)射光譜）第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理任何熒光物質都具有兩個特征光譜：激發(fā)光譜和熒光光譜（發(fā)射光譜）激發(fā)光譜是當熒光波長一定時，熒光強度隨激發(fā)光波長而變化的關系曲線（以激發(fā)光波長λex為橫坐標，熒光的發(fā)光強度F為縱坐標的光譜）。第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理熒光光譜是當使激發(fā)光波長和強度不變，而讓物質所產生的熒光通過發(fā)射分光系統(tǒng)(II)分光，測定每一發(fā)射波長熒光強度F，以發(fā)射光波長λem為橫坐標，熒光的發(fā)光強度F為縱坐標作圖所得的關系曲線。第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理溶液熒光光譜具有如下特征：斯托克斯位移熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關系蒽的激發(fā)光譜（虛）和熒光光譜（實）第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理三、熒光與分子結構（一）熒光物質的特征具有強的可見-紫外吸收，即具有K帶強吸收具有高的熒光效率熒光效率第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理（二）分子結構與熒光的關系大的共軛π鍵結構λex（激發(fā)）λem（激發(fā)）φF苯2052780.11萘2863210.29蒽3654000.46四苯3904800.60第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理分子的剛性和共平面性取代基的影響聯(lián)苯φF=0.18芴F=1.0

第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理（三）影響熒光強度的外界因素溫度溶劑溶液酸堿性熒光熄滅劑散射光激發(fā)光源第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理（四）熒光分光光度計熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強度、量子產率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù),從各個角度反映了分子的成鍵和結構情況。第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理（一）儀器類型濾光片熒光計濾光片-單色器熒光計熒光分光光度計第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理（二）熒光分光光度計的基本結構1.光源2.4.7.9.狹縫3.激發(fā)單色器5.樣品池6.表面吸光物質8.發(fā)射單色器10.檢測器11.放大器12.指示器13.記錄器第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理光源目前最常用的是氙燈單色器（分光系統(tǒng)）激發(fā)單色器發(fā)射單色器樣品池測定熒光用的樣品池必須用低熒光材料或石英檢測器光電倍增管第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理（三）儀器校準靈敏度校準波長校準激發(fā)光譜和發(fā)射光譜校準第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天課堂互動請您比較熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計的主要區(qū)別第一節(jié)基本原理第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天點滴積累熒光和磷光在實驗現(xiàn)象上的區(qū)別：激發(fā)光停止照射時，熒光隨之消失而磷光則將延續(xù)一段時間。最強熒光波長λem和最強激發(fā)波長λex是物質的定性依據，也是定量測定時的最適宜波長。強熒光物質的分子結構體征：一、具有長共軛結構，如芳香環(huán)、稠環(huán)或雜環(huán)；二、剛性和共平面性。影響熒光強度的主要因素是分子結構與外界條件。第一節(jié)基本原理第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)熒光定量分析第二節(jié)熒光定量分析由于熒光物質的結構不同，其吸收光的波長不同，發(fā)射出熒光的波長也不同，這就是熒光分光光度法對能產生熒光的物質進行定性分析的依據。實驗證明，在稀溶液中，熒光強度與熒光物質的濃度成正比，這是熒光分光光度法對熒光物質進行定量分析的依據。第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)熒光定量分析一、熒光強度與物質濃度的關系

當溶液中熒光物質的濃度為c，液層厚度為（吸收池內徑）L時，由于熒光強度F正比于被熒光物質吸收光的強度：F∝（I0–I），用線性方程表示為：F=K′（I0–I）第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)熒光定量分析K′為常數(shù)，稱熒光比率，其大小取決于一定條件下的熒光效率，結合比爾定律可得到下式：F=2.303·φF·I0·ε·c·L入射光強度I0在波長一定，光源穩(wěn)定時為固定值，因此可以將2.303·φF·I0·ε·L視為常數(shù)K，故：F=Kc第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)熒光定量分析當其他條件也一定時，熒光物質在稀溶液中的熒光強度與濃度呈線性關系，這是熒光定量分析的依據。但只有當熒光物質的濃度很小時，即ε·c·L≤0.05，這種關系才成立。第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天課堂互動請您分析為什么熒光分光光度法的靈敏度比紫外-可見分光光度法要高？第二節(jié)熒光定量分析第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)熒光定量分析二、定量分析方法標準曲線法

配制一系列濃度為c1、c2、c3……對照品溶液，分別測其F1、F2、F3……值，用F~c作圖繪制標準曲線。然后在同樣條件下測定試樣溶液的Fx，在標準曲線上查找對應的濃度cx。第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)熒光定量分析比例法

若熒光分析標準曲線過原點，則可選擇其線性范圍用比例法測定。即配制一對照品溶液（cs）測其熒光強度（Fs），再測定試樣溶液（cx）的熒光強度（Fx），然后進行比較。測定時同樣要以空白（F0）校正：第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)熒光定量分析多組分混合物測定與吸光度一樣，熒光強度也有加和性，因此混合物不需經過分離，可用解聯(lián)立方程的方法測定?？蛇x擇兩物質不同的激發(fā)波長處的熒光強度測定，也可選擇不同熒光波長處的熒光強度測定，這樣選擇范圍比紫外-可見分光光度法廣泛。第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天點滴積累當其他條件（即φF、I0、ε、L）一定時，熒光物質在稀溶液中的熒光強度F與濃度c成正比。熒光分析的定量方法與紫外-可見分光光度法基本相同。第二節(jié)熒光定量分析第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)應用與發(fā)展一、熒光分析的應用（一）有機化合物的熒光分析芳香族及具有芳香結構的化合物，因存在共軛體系在紫外光照射下很多能發(fā)射熒光。為提高測定靈敏度和選擇性，可使弱熒光物質與某些熒光試劑作用，以得到強熒光性產物。因此，熒光分析法在有機物測定方面的應用很廣。第三節(jié)應用與發(fā)展第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)應用與發(fā)展（二）無機化合物的熒光分析直接熒光法熒光猝滅法催化熒光法第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)應用與發(fā)展二、熒光分析新技術激光熒光分析時間分辨熒光分析同步熒光分析膠束增敏熒光分析三維熒光光譜分析原油試樣在環(huán)乙烷中的等角三維投影光譜圖第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第八章熒光分析法檢測技術與應用一、選擇題(一)單項選擇題1.熒光光譜屬于（）。A、吸收光譜B、發(fā)射光譜C、紅外光譜D、質譜2.分子熒光分析比紫外-可見分光光度法選擇性高的原因是（）。A、能發(fā)射熒光的物質比較少B、分子熒光光譜為線狀光譜，而分子吸收光譜為帶狀光譜C、熒光波長比相應的吸收波長稍長D、熒光光度計有兩個單色器，可以更好地消除組分間的相互干擾目標檢測第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天37第八章熒光分析法檢測技術與應用3.熒光量子效率是指（）。A、熒光強度與吸收光強度之比B、發(fā)射熒光的量子數(shù)與吸收激發(fā)光的量子數(shù)之比C、發(fā)射熒光的分子數(shù)與物質的總分子數(shù)之比D、激發(fā)態(tài)的分子數(shù)與基態(tài)的分子數(shù)之比4.一種物質能否發(fā)出熒光主要取決于（）。A、分子結構B、激發(fā)光的波長C、溫度D、溶劑的極性第37頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第八章熒光分析法檢測技術與應用5.下列敘述中，錯誤的是（）。A、熒光分析的待測物應含有大π鍵B、紫外分光光度法待測物應含有π鍵C、質譜法待測物應含離子D、氣象色譜分析物的沸點應較低6.下列因素會導致熒光效率下降的有（）。A、激發(fā)光強度下降B、溶劑極性變小C、溫度下降D、溶劑中含有鹵素離子第38頁,共43頁，2024年2月25日，星期天39第八章熒光分析法檢測技術與應用7.熒光波長與相應激發(fā)光波長相比（）。A、前者較長B、后者較長C、兩者相等D、關系不確定8.熒光光譜分析的主要優(yōu)點是（）。A、準確度高B、操作簡便C、儀器簡單D、靈敏度高9.熒光分光光度計與分光光度計的主要區(qū)別在于（）。A、光源B、單色器C、光路D、檢測器第39頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第八章熒光分析法檢測技術與應用（二）多項選擇題1.下列關于分子熒光分析特點的敘述正確的是（）。A、檢測靈敏度高B、用量大，分析時間長C、用量少，操作簡便D、選擇性強E、應用廣泛2.分子中有利于提高熒光效率的結構特征是（）。A、雙鍵數(shù)目較多B、共軛雙鍵數(shù)目較多C、含重金屬原子D、分子為平面剛性E、苯環(huán)上有給電子基團第40頁,共43頁，2024年2月25日，星期天41第八章熒光分析法檢測技術與應用3.下列躍遷方式屬于無輻射躍遷的有（）。A、振動弛豫B、內轉換C、體系間跨越D、熒光發(fā)射E、磷光發(fā)射4.分子熒光法與紫外-可見分光光法的主要區(qū)別為（）。A、分析方法不同B、儀器結構不同C、靈敏度不同D、光譜帶個數(shù)不同E、光源不同第41頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第八章熒光分析法檢測技術與應用二、填空題1.激發(fā)光波長和強度固定后，熒光強度與熒光波長的關系曲線稱為