酶活性測(cè)定的主要影響因素及控制

酶活性測(cè)定的主要影響因素及控制酶（enzyme）酶的應(yīng)用臨床診斷酶學(xué)產(chǎn)生至今已有100年的歷史。用于診斷的酶類已超過100多種，常用的數(shù)十種。酶測(cè)定約占目前臨床化學(xué)總工作量的1/4到1/2。酶的概念是一種由活細(xì)胞產(chǎn)生，具有高度專一性、高度催化活性的特殊蛋白質(zhì)，又稱為生物催化劑。酶的測(cè)定方法分為絕對(duì)定量法和相對(duì)定量法兩大類，以后者為主。酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活性（activity）。酶活性濃度的測(cè)定受許多因素的影響。第2頁,共55頁，2024年2月25日，星期天酶活性濃度測(cè)定的主要影響因素1.標(biāo)本及標(biāo)本采集和處理因素2.試劑及方法學(xué)因素3.儀器因素的影響4.測(cè)定條件與參數(shù)設(shè)置第3頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.標(biāo)本及標(biāo)本采集和處理因素

的影響及控制第4頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.標(biāo)本及采集和處理的影響因素1.1溶血1.2抗凝劑1.3溫度1.4空氣與光線1.5標(biāo)本副反應(yīng)1.6酶蛋白濃度1.7其他第5頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.1溶血最重要的影響是RBC內(nèi)酶的大量釋出。大部分酶在細(xì)胞內(nèi)外濃度差異明顯，且其活性遠(yuǎn)高于血清；如RBC內(nèi)的LD、AST和ALT活性分別較血清中高100、15和7倍左右。RBC釋放的Hb在300～500nm可見光波段能使吸光度值明顯升高，干擾分光光度計(jì)的測(cè)定。第6頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.1Hb的吸光度曲線第7頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.1溶血影響的控制減少溶血體外溶血可通過實(shí)施樣品制備技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化加以克服；分清體內(nèi)溶血與體外溶血。減少溶血的干擾可通過設(shè)置樣品對(duì)照，或使用雙波長(zhǎng)比色、連續(xù)監(jiān)測(cè)法以及改進(jìn)商品試劑等措施，克服對(duì)分光光度分析的影響。應(yīng)用血清(溶血)指數(shù)直接判斷溶血程度。第8頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.1注意:RBC中酶的干擾不僅表現(xiàn)在溶血影響上，采血后如不及時(shí)將血清和血凝塊分離，血細(xì)胞中酶同樣可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入血清，所以，靜脈采血后，必須在1～2h內(nèi)及時(shí)離心，將血清與血細(xì)胞、血凝塊分離，以免引起誤差。第9頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.2抗凝劑臨床上除非測(cè)定與凝血或纖溶有關(guān)的酶，一般都應(yīng)以血清作為首選測(cè)定標(biāo)本。大多數(shù)抗凝劑都在一定程度上影響酶活性，EDTA、草酸鹽和檸檬酸鹽等抗凝劑，它們?yōu)榻饘匐x子螯合劑；在去除Ca2+同時(shí)也去除其中Mg2+、Mn2+等離子，Ca2+是AMY的激活劑，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）的激活劑。第10頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.2肝素是一種粘多糖，是對(duì)酶活性影響最小的抗凝劑，對(duì)ALT、AST、CK、LD和ACP無影響，適于急診時(shí)迅速分離血漿進(jìn)行測(cè)定。第11頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.3溫度由于血清清蛋白對(duì)酶蛋白有穩(wěn)定作用，如無細(xì)菌污染，某些酶（如AST、

-GT和ALP等）可在室溫保存1～3天活性不受影響。有些酶極不穩(wěn)定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1h，活性可下降50%。第12頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.3貯存不同室溫體液酶的穩(wěn)定性

（活性變化小于10%）

酶室溫（25℃）冷藏（0～4℃）冰凍（-25℃）LD1周1～3d§1～3d§

-GT2d1周1月ALD2d2d不穩(wěn)定*ALT2d5d不穩(wěn)定*AST3d1周1月CK1周1周1月ChE1周1周1周ALP2～3d2～3d1月ACP4h※3d#3d#5’-NT24h1周3月AMY1月7月2月LPS1周3周3周*酶不耐融化；§與同工酶類型有關(guān)；※標(biāo)本未酸化；#標(biāo)本加枸櫞酸或醋酸至pH5第13頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.3溫度影響的控制及時(shí)檢測(cè)低溫貯存大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，因此當(dāng)天不能測(cè)定時(shí)，應(yīng)在血清分離后置冰箱中冷藏。第14頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.4空氣與光線血清置于空氣中時(shí)，血中CO2喪失極快，pH可在15min內(nèi)由7.4增至8.0，從而使對(duì)堿性環(huán)境敏感的ACP活性迅速下降。某些酶易受光線破壞，CK可因吸收藍(lán)光而引起酶發(fā)生不可逆地失活，其失活程度與暴光時(shí)間的長(zhǎng)短成正比。第15頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.5副反應(yīng)副反應(yīng)是指酶促反應(yīng)體系中，除待測(cè)酶反應(yīng)外，其他非待測(cè)酶和物質(zhì)引起的干擾待測(cè)酶測(cè)定的反應(yīng)。NAD（P）H是目前使用最多的指示反應(yīng)物質(zhì)。體內(nèi)存在數(shù)以百計(jì)的氧化還原酶，它們的輔酶很多是一致的。若存在內(nèi)源性代謝物，必然會(huì)相互干擾。第16頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.5副反應(yīng)(酶偶聯(lián)法測(cè)ALT)由于反應(yīng)體系中含有大量NADH和LD，可與血液標(biāo)本中所含丙酮酸反應(yīng)，引起340nm波長(zhǎng)處吸光度下降，從而引起ALT活性測(cè)定誤差。ALT活性測(cè)定的反應(yīng)式如下：第17頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.5副反應(yīng)的控制可通過加入副反應(yīng)抑制劑，或?qū)悠愤M(jìn)行預(yù)處理等方法給予排除。雙試劑底物啟動(dòng)模式因不增加成本、不耗費(fèi)時(shí)間是最經(jīng)濟(jì)的方法。第18頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.6酶蛋白濃度酶蛋白在低濃度時(shí)易失活，可能是亞基易解離、易吸附于容器上和易發(fā)生表面變性之故。酶蛋白在高濃度時(shí)較穩(wěn)定，但活性過高超過檢測(cè)儀器的線性范圍時(shí)，需將樣品進(jìn)行稀釋或減少樣品用量后再行測(cè)定。樣品稀釋后所測(cè)得的活性常偏高，可能與抑制劑被稀釋有關(guān)。第19頁,共55頁，2024年2月25日，星期天1.7其他樣本器皿的質(zhì)地和潔凈度，采血部位，以及血清中過量的膽紅素、脂質(zhì)，樣品制備過程中的振搖等，均可引起酶活性改變。季節(jié)冬季氣溫低，血液凝固慢，血清分離時(shí)間延長(zhǎng)，可引起血細(xì)胞內(nèi)酶釋至血清，加上血清與空氣長(zhǎng)時(shí)間接觸，可使某些抑制劑遭到破壞，故冬季測(cè)定LD的活性較夏季高。第20頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.試劑及方法學(xué)因素

的影響及控制第21頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.試劑及方法學(xué)的影響因素酶的測(cè)定大多使用商品試劑盒不同廠家酶試劑盒的測(cè)定原理、試劑配方（包括緩沖液、底物、添加劑等）、產(chǎn)品質(zhì)量、技術(shù)含量等常有區(qū)別。常見的影響因素2.1

定時(shí)法與連續(xù)監(jiān)測(cè)法2.2檢測(cè)底物或檢測(cè)產(chǎn)物2.3底物啟動(dòng)模式與樣品啟動(dòng)模式2.4正向反應(yīng)與逆向反應(yīng)2.5試劑的干擾作用第22頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.影響因素的控制選購試劑盒時(shí)要仔細(xì)閱讀試劑盒說明書；了解試劑盒所用方法的原理、試劑配方等；選擇IFCC或中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)推薦的常規(guī)方法，或選擇公認(rèn)的測(cè)定方法。使用時(shí)定期對(duì)試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)；準(zhǔn)確性、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，線性范圍寬；正向型試劑空白吸光度低、反向型試劑空白吸光度高、試劑空白速率低、瓶間差小等。第23頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.酶活性測(cè)定的原理酶活性與速度的關(guān)系*酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線第24頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.1定時(shí)法與連續(xù)監(jiān)測(cè)法的選用在條件許可的情況下，應(yīng)盡可能全部采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，少用或不用定時(shí)法。連續(xù)監(jiān)測(cè)法可以選擇線性期的反應(yīng)速度來計(jì)算酶活性，測(cè)定結(jié)果可靠，是首選的方法。但該方法儀器要求相對(duì)較高。在基層單位，某些酶采用定時(shí)法測(cè)定也可以得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果。ALP酶活性的測(cè)定，如加做樣品空白，兩法的結(jié)果準(zhǔn)確性相當(dāng)。第25頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.1連續(xù)監(jiān)測(cè)法與定時(shí)法

的酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線第26頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.2檢測(cè)底物或檢測(cè)產(chǎn)物的選擇取決于哪個(gè)更方便，測(cè)定的結(jié)果更準(zhǔn)確。通常原則是選擇測(cè)定產(chǎn)物的生成量而不是底物的消耗量。反應(yīng)時(shí)底物濃度高，反應(yīng)時(shí)間短；這也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐漸被色素源底物所取代的原因之一。除部分測(cè)定NADH減少可以看成測(cè)底物的消耗量外，已很少采用測(cè)定底物消耗量的項(xiàng)目。第27頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.2檢測(cè)底物或檢測(cè)產(chǎn)物的選擇底物與產(chǎn)物舉例ALT測(cè)定（賴氏法-定時(shí)法）L-丙氨酸+α-酮戊二酸α-丙酮酸

+L-谷氨酸α-丙酮酸+2，4-二硝基苯肼2，4-二硝基苯腙

(紅棕色，λ=505nm)ALT測(cè)定（連續(xù)監(jiān)測(cè)法）L-丙氨酸+α-酮戊二酸α-丙酮酸

+L-谷氨酸第28頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.3底物啟動(dòng)模式與樣品啟動(dòng)模式底物啟動(dòng)模式（IFCC推薦采用）。指樣品先與缺乏某種底物的試劑1預(yù)孵育一定時(shí)間后，再加入內(nèi)這種底物的試劑2，開始啟動(dòng)樣品中的待測(cè)酶的酶促反應(yīng)。好處是在待測(cè)酶酶促反應(yīng)開始之前，可以除去某些干擾物，包括內(nèi)源性干擾物和外源性干擾物。這種模式需要雙試劑劑型。樣品啟動(dòng)模式。指反應(yīng)所需的試劑先混合在一起，然后加入樣品，依靠樣品中的待測(cè)酶來啟動(dòng)酶促反應(yīng)；只是在延滯期去除部分干擾物。這種模式可采用單一試劑劑型。第29頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.3底物啟動(dòng)模式與樣品啟動(dòng)模式雙試劑與單試劑酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線第30頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.3需要注意某些雙試劑劑型是基于試劑穩(wěn)定性考慮，并沒有將底物單獨(dú)作為第二試劑，也起不到消除內(nèi)源性干擾的作用。第31頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.4正向反應(yīng)與逆向反應(yīng)一般根據(jù)測(cè)定底物或產(chǎn)物的難易程度來決定。除原則上選擇對(duì)底物親和力大，酶轉(zhuǎn)換率高的方向外，還應(yīng)考慮內(nèi)源性干擾、底物價(jià)格和穩(wěn)定性等諸多因素。例如，CK的測(cè)定普遍采用逆向反應(yīng)，因其逆向反應(yīng)是正向反應(yīng)的6倍，而且受影響因素少。第32頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.4正向反應(yīng)與逆向反應(yīng)LDH測(cè)定的選擇目前尚有爭(zhēng)議。國(guó)內(nèi)多采用正向反應(yīng)（L→P），與IFCC在2001年發(fā)表的操作手冊(cè)一致。正向反應(yīng)有利于LD1的活性表達(dá)，同時(shí)試劑成本低廉，穩(wěn)定性好。國(guó)外常用方法曾是逆向反應(yīng)（P→L），反應(yīng)速度是正向的3倍，成本也較低。第33頁,共55頁，2024年2月25日，星期天2.5檢測(cè)試劑的干擾作用試劑酶的污染。組織勻漿中往往含有NADH-細(xì)胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測(cè)定。底物的非酶反應(yīng)。很多硝基酚的酯類衍生物在水溶液中不穩(wěn)定，放置一段時(shí)間可自行水解釋放出硝基酚。如堿性磷酸酶（ALP）測(cè)定解決的方法是通過試劑空白管檢出并加以校正。選購IFCC或中華檢驗(yàn)學(xué)會(huì)推薦的方法和質(zhì)量好的試劑。第34頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3.儀器因素的影響及控制第35頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3儀器的影響因素加樣系統(tǒng)加樣的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和攜帶污染；反應(yīng)系統(tǒng)反應(yīng)杯的形狀、表面和攜帶污染；反應(yīng)杯和反應(yīng)槽溫度的準(zhǔn)確性、波動(dòng)范圍；攪拌和清洗機(jī)構(gòu)的效果和攜帶污染；檢測(cè)系統(tǒng)光度計(jì)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性范圍和雜散光等均會(huì)造成結(jié)果的偏差。第36頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3儀器影響因素的控制在日常工作中，除常規(guī)做好儀器和設(shè)備的正確使用和維護(hù)外，重點(diǎn)應(yīng)注意儀器的校準(zhǔn)問題。第37頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3.1酶活性濃度的計(jì)算公式摩爾吸光系數(shù)

和系數(shù)K均為常數(shù)，

和

K受儀器諸多因素的影響，如波長(zhǎng)的準(zhǔn)確性、半波寬的大小、比色池光徑及磨損與清潔度、溫控的準(zhǔn)確性、加樣系統(tǒng)狀況等。

和

K可用校準(zhǔn)物定期校正。第38頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3.2校準(zhǔn)物可用作酶活性測(cè)定用的校準(zhǔn)物分兩類。一類是產(chǎn)物的基準(zhǔn)物質(zhì)，如對(duì)硝基酚、對(duì)硝基苯胺等，用于校準(zhǔn)儀器的值（摩爾吸光系數(shù)）。另一類稱酶校準(zhǔn)物（Enzymecalibrator），多是用人血清或動(dòng)物血清作介質(zhì)，與測(cè)定標(biāo)本比較接近，用于校準(zhǔn)儀器的K值（酶活性濃度定量系數(shù)）。第39頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3.2校準(zhǔn)物國(guó)際上已經(jīng)有經(jīng)IFCC認(rèn)可的CRM酶參考物。各試劑供應(yīng)商所提供的酶校正物的定值應(yīng)可溯源至CRM酶參考物。常規(guī)工作一般選用用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的工作校準(zhǔn)品。目前，臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多的是德國(guó)寶靈曼公司的校準(zhǔn)品(c.f.a.s)。第40頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3.3ε的校準(zhǔn)（340nm波長(zhǎng)）NAD(P)H是酶活性測(cè)定中常用的指示輔酶。在340nm

的NAD(P)H的

，可用葡萄糖己糖激酶法實(shí)測(cè)、計(jì)算其實(shí)測(cè)的

。NAD(P)H的ε為6220。如果6000>ε>6600為不合格，則需找維修部檢查。注：干涉濾光片者需校準(zhǔn)，光柵式可直接使用文獻(xiàn)或試劑盒說明書的數(shù)值。第41頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3.3ε的校準(zhǔn)（405nm波長(zhǎng)）最常用的色素原為對(duì)硝基苯酚等。對(duì)硝基苯酚在405nm的，可用ALP測(cè)定試劑的緩沖液作為測(cè)定試劑，對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)液作為血清標(biāo)本，實(shí)際測(cè)定計(jì)算ε值。對(duì)硝基苯酚的ε為18700。如果ε值偏差過大，則需找維修部檢查。第42頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3.4K的校準(zhǔn)（公式計(jì)算法）將上述實(shí)測(cè)ε值代入K值計(jì)算公式得到校準(zhǔn)K值外。第43頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3.4K的校準(zhǔn)（酶校準(zhǔn)物）使用公認(rèn)的酶校準(zhǔn)物對(duì)K值進(jìn)行校準(zhǔn)，它是國(guó)際上目前酶測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化新途徑。使用酶校準(zhǔn)物的優(yōu)點(diǎn)，除具有實(shí)測(cè)ε值換算出的校準(zhǔn)K值所具有的一切優(yōu)點(diǎn)外，還可促進(jìn)方法間的一致性和增加常規(guī)酶方法的可靠性，可使不同實(shí)驗(yàn)室之間的測(cè)定結(jié)果相對(duì)統(tǒng)一。第44頁,共55頁，2024年2月25日，星期天3.4K的校準(zhǔn)（頻率）最好（低）每半年進(jìn)行一次酶活性的校準(zhǔn)。儀器在使用過程中，濾光片、加樣系統(tǒng)的精度都可能發(fā)生變化，光學(xué)系統(tǒng)的燈泡、光電轉(zhuǎn)換元件的老化、靈敏度變化等，都會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的偏差。但日常工作中，遇到下列情況時(shí)，必須進(jìn)行校準(zhǔn)：試劑盒改變廠家，或者更換了批號(hào)；儀器性能改變，如進(jìn)行一次大的預(yù)防性維護(hù)或者更換了重要部件；質(zhì)控反映出異常的趨勢(shì)或偏移，或者超出實(shí)驗(yàn)室規(guī)定的接受限，采取一般性糾正措施后，不能識(shí)別和糾正問題時(shí)。第45頁,共55頁，2024年2月25日，星期天4.測(cè)定條件與參數(shù)設(shè)置第46頁,共55頁，2024年2月25日，星期天4.1最適條件包括①合適的底物和最適底物濃度；②理想的緩沖液種類和最適離子強(qiáng)度；③反應(yīng)液的最適pH；④最適反應(yīng)溫度；⑤合適的輔因子、激活劑濃度；⑥若是酶偶聯(lián)反應(yīng)，還需要確定指示酶和輔助酶的用量；⑦合理的測(cè)定時(shí)間，包括延滯期盡量短暫，有足夠的線性期；⑧合適的樣品與反應(yīng)試劑的比例；⑨足夠的檢測(cè)范圍；⑩盡量去除各種抑制劑等。第47頁,共55頁，2024年2月25日，星期天4.2反應(yīng)溫度目前常規(guī)實(shí)驗(yàn)室越來越多的使用37℃，這更多地是從實(shí)際工作方便來考慮。1986年以前，IFCC推薦酶活性測(cè)定的溫度是30℃，純鎵的熔點(diǎn)為29.77℃，鎵作為此溫度的基準(zhǔn)物質(zhì)，保證了測(cè)定儀器在30℃的高度準(zhǔn)確性。2001年，IFCC正式發(fā)表了“37℃下檢測(cè)酶催化活性濃度的IFCC一級(jí)參考方法操作手冊(cè)和參考制品認(rèn)可系統(tǒng)”，包括CK、LD、ALT、AST、GGT五個(gè)酶在內(nèi)。第48頁,共55頁，2024年2月25日，星期天4.2反應(yīng)溫度酶活性與酶促反應(yīng)溫度的關(guān)系第49頁,共55頁，2024年2月25日，星期天4.3延滯期、線性期的確定延滯期的確定延滯期可以因酶在樣品中所存在的介質(zhì)不同而略有差別，原因可能是存在內(nèi)源性干擾物，也可能存在一些抑制劑。確定原則是多觀察濃度不等、病理情況不同的標(biāo)本，選擇延滯期最長(zhǎng)者作為確定值。線性期的確定離不開酶濃度的可測(cè)上限，因?yàn)槊笣舛仍礁?，在同樣時(shí)間內(nèi)消耗底物越多，產(chǎn)生產(chǎn)物越多，底物的不足