第34章 DNA的復制與修復課件

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傳遞與表達第34章DNA的復制與修復DNA復制RNA轉錄蛋白質翻譯逆向轉錄RNA復制中心法則基因（gene）：DNA上的功能單位，能夠編碼蛋白質或者RNA?；虮磉_（geneexpression）：基因轉錄與翻譯的過程。第34章DNA的復制與修復

第34章

DNA的復制和修復第34章DNA的復制與修復體細胞染色體有絲分裂第34章DNA的復制與修復一.DNA的復制高等生物染色體DNA原核生物基因組DNA原核生物染色體外DNA(質粒)病毒第34章DNA的復制與修復(一)DNA的半保留復制

定義：復制時，母鏈的雙鏈DNA解開兩股單鏈，各自作為模板指導子代合成新的互補鏈。子代細胞的DNA雙鏈，其中一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則從新合成。由于堿基互補，兩個子細胞的DNA雙鏈，都和親代母鏈DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制(semiconservativereplication)。第34章DNA的復制與修復父代DNA子代DNA保留了一半父代DNA成份第34章DNA的復制與修復1、半保留復制的實驗證據

1958年，Meselson和Stahl用15N標記E.coliDNA，用密度梯度離心試驗證明了DNA的復制是半保留復制。第34章DNA的復制與修復1963年，Cairns用放射自顯影法，在顯微鏡下首次觀察到完整的正在復制的E.coli.染色體DNA。

P408圖34-3

第34章DNA的復制與修復二、半保留復制的意義DNA的半保留復制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性，經過許多代的復制，DNA多核苷酸鏈仍可保持完整，存在于后代而不被分解，這種穩(wěn)定性體現了DNA遺傳過程的相對保守性。

遺傳的保守性是相對的，而不是絕對的。自然界還存在著普遍的變異現象。第34章DNA的復制與修復(二)復制的起點與單位基因組能獨立進行復制的單位稱為復制子（replicon)，每個復制子都含有控制復制的起點（origin)，可能還有終止復制的終點（terminus)。復制的方向大多是雙向的（unidirectional)，形成兩個復制叉分別向兩側進行復制，也有一些是單向的。origin第34章DNA的復制與修復雙向復制與單向復制第34章DNA的復制與修復三復制的方式1.真核生物：雙向，多復制子2.大腸桿菌：雙向，單復制起點（?型復制）3.病毒DNA：多種多樣第34章DNA的復制與修復大腸桿菌染色體DNA第34章DNA的復制與修復1.θ型復制：環(huán)狀DNA的復制時，在復制起點處兩條鏈解開，各自合成其互補鏈，在電子顯微鏡下可以看到形希臘字母θ

形結構，這種復制方式就叫θ型復制第34章DNA的復制與修復DNA的單向復制1.滾環(huán)復制噬菌體ΦX174DNA是環(huán)狀單鏈分子。它在復制過程中首先形成共價閉環(huán)的雙鏈分子(復制型)，然后其正鏈由內切酶在特定位置切開，游離出一個3‘-OH和一個5’—磷酸基末端。此5‘—磷酸基末端在酶的作用下固著到細胞膜上。隨后，在DNA聚合酶催化下，以環(huán)狀負鏈為模板，從正鏈的3’-OH末端加入脫氧核苷酸，使鏈不斷延長，通過滾動而合成出新的正鏈。第34章DNA的復制與修復2.D環(huán)復制雙鏈環(huán)在固定點解開進行復制，但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈先復制，另一條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下可以看到呈D環(huán)形狀。待一條鏈復制到一定程度，露出另一鏈的復制起點，另一條鏈才開始復制。這表明復制起點是以一條鏈為模板起始合成DNA的一段序列；兩條鏈的起點并不在同一點上，當兩條鏈的起點分開一定距離時就產生D—環(huán)復制。DNA的單向復制第34章DNA的復制與修復第34章DNA的復制與修復(三)DNA復制的酶學第34章DNA的復制與修復

復制是酶催化下的核苷酸聚合過程，需要多種物質的共同參與：

底物：dNTP（

dATP、dGTP、dCTP、dTTP）

DNA聚合酶：即依賴DNA的DNA聚合酶

模板：解開成單鏈的DNA母鏈

引物：RNA，提供3’-OH末端

新鏈延伸方向：5’3’

其它酶和蛋白質因子：解螺旋酶、拓樸異構酶、引物酶、DNA連接酶、單鏈結合蛋白等

第34章DNA的復制與修復1、DNA的聚合反應

第34章DNA的復制與修復DNA復制的反應第34章DNA的復制與修復復制的化學反應方程式

（dNMP）n+dNTP（dNMP）n+1+PPi第34章DNA的復制與修復2、DNA聚合酶DNA聚合酶（DNApolymerase，DNA-pol）又稱為DNA依賴的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase，DDDP）原核生物的DNA聚合酶：I、II、III；3種真核生物的DNA聚合酶：α、β、γ、δ、ε；5種第34章DNA的復制與修復（1）原核生物的DNA聚合酶

聚合酶I聚合酶II聚合酶III5’→3’聚合酶活性+++3’→5’外切酶活性+++5’→3’外切酶活性+

相對分子量（×103）10388830

聚合速度(bp/min)1000-1200240015000-60000

持續(xù)合成能力3-2001500大于500000

生物學功能切除引物,修復修復復制大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質比較第34章DNA的復制與修復IIDNA聚合酶I：校讀、修復Klenow片段特異的蛋白酶DNA聚合酶III：新鏈延長核心酶第34章DNA的復制與修復DNA聚合Ⅰ酶損傷修復第34章DNA的復制與修復（2）真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶：延長隨從鏈DNA聚合酶：相當于原核生物DNA-polIIDNA聚合酶δ：延長領頭鏈DNA聚合酶：位于線粒體內DNA聚合酶ε：起校讀、修復、填補缺口的作用，相當于原核生物DNA-polI

二者相當于原核生物的DNA-polIII第34章DNA的復制與修復（3）DNA聚合酶的核酸外切酶活性和復制的保真性1).核酸外切酶活性：校讀功能

DNA-polⅢ,I：3’5’外切酶活性5’3’聚合酶活性第34章DNA的復制與修復2).復制的保真性DNA復制的保真性依賴三種機制：

遵守嚴格的堿基配對規(guī)律：A與T、G與CDNA-polIII在復制延長中對堿基的選擇功能復制出錯時DNA-polI有即時的校讀功能第34章DNA的復制與修復3、DNA連接酶（DNAligase）

連接DNA鏈3’-OH末端和相鄰DNA鏈5’-P末端，使二者生成3’，5’磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連成完整的鏈第34章DNA的復制與修復4.解螺旋酶

解螺旋酶通過水解ATP供能，解開雙鏈DNA

解螺旋酶可沿模板隨復制叉的伸展而移動

DnaB是解螺旋酶。DnaA蛋白辨認復制起始點，引起解鏈，在此基礎上，DnaC蛋白輔助解螺旋酶結合于初步打開的雙鏈，并用其解螺旋酶活性打開雙鏈。第34章DNA的復制與修復拓撲異構酶I：

切斷DNA雙鏈中的一條鏈，使DNA解旋中不致打結，適當時再把切口封閉，反應不耗能拓撲異構酶II：無ATP時，切斷處于超螺旋狀態(tài)的DNA分子雙鏈某一部位，斷端通過切口使超螺旋松弛在利用ATP供能情況下，斷端在拓撲酶催化下恢復連接松弛狀態(tài)的DNA又進入負超螺旋狀態(tài)5.拓撲異構酶（I、II）第34章DNA的復制與修復

在復制過程中，DNA每復制10bp，復制叉前方的模板DNA雙螺旋就要繞其長軸旋轉一周，產生正超螺旋。第34章DNA的復制與修復第34章DNA的復制與修復6.單鏈結合蛋白（SSB）

SSB的作用是在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整

SSB與DNA的結合具有協(xié)同效應第34章DNA的復制與修復7、引物酶和引發(fā)體

引物酶（primase）：

復制是在一段RNA引物提供3’–OH末端的基礎上進行的，催化引物合成的是一種RNA聚合酶，稱為引物酶。它與催化轉錄過程的RNA聚合酶不同。第34章DNA的復制與修復引物酶可合成6-10個堿基的RNA引物?！顳NA復制為什么要用引物？（而RNA聚合酶不需要引物？）⑴從模板復制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配⑵新復制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的5′→3′

校對功能難發(fā)揮作用。P.419第34章DNA的復制與修復

三種酶催化生成磷酸二酯鍵的比較

提供核糖3’-OH結果DNA聚合酶引物或（dNMP）n+1

延長中的新鏈連接酶復制中不連續(xù)的不連續(xù)→連續(xù)鏈兩條單鏈連接雙鏈DNA的單鏈缺口拓撲酶切斷、整理后改變拓撲狀態(tài)的兩鏈第34章DNA的復制與修復第二部分DNA生物合成過程

DNA復制分為三個階段一、復制的起始二、復制的延伸三、復制的終止第34章DNA的復制與修復一、復制的起始

復制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復制起始點(originofreplication)常用ori或o表示。

原核生物每個DNA分子只有一個復制起始點，真核生物DNA分子有多個復制起始點。

打開雙鏈生成引發(fā)體第34章DNA的復制與修復3’...ATTAGGTGT....TTATACACA.5’3’3’5’...AATAGGTTT....TTATCCACA.3’3’5’5’5’第34章DNA的復制與修復第34章DNA的復制與修復（一）打開雙鏈第34章DNA的復制與修復防止單鏈復合3.DNA結合蛋白與單鏈結合并向前移動DNA結合蛋白起點提問：DNA結合蛋白的作用？GCAT解螺旋酶第34章DNA的復制與修復（二）引發(fā)體的生成

復制過程需要引物，引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。在解鏈的基礎上，形成了DnaB、DnaC蛋白與DNA的起始復制區(qū)域相結合的復合體，此復合體再與引物酶結合成的復合體結構稱為引發(fā)體。第34章DNA的復制與修復第34章DNA的復制與修復二、復制的延長dNTP按堿基互補配對原則逐個加入而延長DNA新鏈，其化學本質是生成3’,5’-磷酸二酯鍵。催化此反應的酶，在原核生物為DNA-polIII，真核生物為DNA-pol

和。新鏈延伸方向：5’3’第34章DNA的復制與修復新鏈延伸方向：5’3’第34章DNA的復制與修復

復制開始時，雙鏈打開，形成一個復制叉。兩條單鏈分別做模板，各自合成一條新的DNA鏈。由于DNA一條鏈的走向是5′→3′，另一條鏈的走向是3′→5′，但生物體內DNA聚合酶只能催化DNA從5′→3′方向的合成。順著解鏈方向而生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為前導鏈。另一條子鏈復制的方向與解鏈方向相反，復制是不連續(xù)的，稱為滯后鏈。這種復制方式稱為半不連續(xù)復制。復制的半不連續(xù)性

隨從鏈上不連續(xù)復制的DNA片段稱為岡崎片段。每一個岡崎片段5’-端都帶有一個RNA引物。第34章DNA的復制與修復半保留——復制結果半不連續(xù)——復制過程第34章DNA的復制與修復半不連續(xù)復制第34章DNA的復制與修復

隨從鏈復制時必須等待模板鏈解開足夠長度時，才能從5′→3′合成引物后開始復制。延伸時，又要等待下一段暴露出足夠長的模板，才能再次合成引物而延長。崗崎片段第34章DNA的復制與修復三、復制的終止

原核生物的環(huán)狀DNA多采用雙向復制的方式。復制的終止是雙向復制的兩子鏈在復制終止點的匯合。復制中的不連續(xù)片段需連接成連續(xù)的子鏈。這一過程需先由RNA酶水解引物，引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化dNTP逐一自5′向3′端聚合而填補。最后，兩不連續(xù)片段相鄰的5′-P和3′-OH還有一個缺口，則由DNA連接酶加以連接。第34章DNA的復制與修復第34章DNA的復制與修復第34章DNA的復制與修復真核生物的端粒和端粒酶

真核生物染色體DNA采取線性復制方式。子鏈5’-端的一段RNA引物被水解后，留下的空隙由端粒的端粒酶爬行式復制而不縮短。端粒（telomere）：真核生物染色體線性DNA分子末端的結構，富含GxTy的正向重復序列。端粒DNA受特殊蛋白質保護，不被核酸酶水解。端粒酶（telomerase）：保護端粒的特殊蛋白質，是一種核糖核蛋白，是一種逆轉錄酶，由RNA和蛋白質構成，能識別和結合端粒序列。其中RNA大約有150個核苷酸，富含CxAy，正好與端粒序列GxTy的單鏈呈雜交結合狀態(tài)。第34章DNA的復制與修復模板第34章DNA的復制與修復二DNA損傷(突變)與修復突變的因素突變的類型DNA損傷的修復第34章DNA的復制與修復……如經DNA修復后有缺陷，DNA就會發(fā)生突變………發(fā)展成癌細胞第34章DNA的復制與修復化學因素：堿基類似物、堿基的修飾劑（羥胺類、亞硝酸鹽、烷化劑）

嵌入染料一、突變的因素物理因素：紫外線第34章DNA的復制與修復1．堿基類似物（baseanalog）與DNA正常堿基結構類似的化合物，也能在DNA復制時取代正常堿基基摻入井與互補鏈上堿基配對。但是這些類似物易發(fā)生互變異構(tautomerization)，在復制時改變配對的堿基，于是引起堿基對的置換。

第34章DNA的復制與修復5—溴尿嘧啶(BU)是胸腺嘧啶的類似物，在通常情況下它以酮式結構存在，能與腺嘌吟配對；但它有時以烯醇式結構存在，與鳥嘌呤配對。胸腺嘧啶也有酮式和烯醇式互變異構現象，但其烯醇式發(fā)生率極低。而5－溴尿嘧啶中由于溴原子負電性很強，其烯醇式發(fā)生率要高得多，因此顯著提高了誘變的能力。結果使AT對轉變?yōu)镚C對；第34章DNA的復制與修復2-氨基嘌呤(AP)是腺嘌呤的類似物，正常狀態(tài)下與胸腺嘧啶配對，但以罕見的亞氨基狀態(tài)存在時卻與配對胞嘧啶。因此，它能引起AT對轉換為GC對第34章DNA的復制與修復2，堿基的修飾劑(basemodifier)

某些化學誘變劑通過對DNA堿基的修飾作用，而改變其配對性質。第34章DNA的復制與修復例如：亞硝酸能脫去堿基上的氨基。腺嘌呤脫氨后成為次黃嘌呤，它與胞嘧啶配對．而不是與原來的胸腺嘧啶配對。胞嘧啶脫氨后成為尿嘧啶，它成為與腺嘌呤配對。第34章DNA的復制與修復羥胺與堿基作用十分特異，它只與胞嘧啶作用，生成4-羥胺胞嘧啶(HC)，而與腺嘌呤配對，結果GC對變?yōu)锳T對。烷化劑是極強的化學誘變劑，最常見的是鳥嘌呤上第7位氮原子的烷基化，引起分子電荷分布的變化而改變堿基配對性質，第34章DNA的復制與修復3嵌入染料一些扁平的稠環(huán)分子，例如吖啶橙(acridine)、原黃素(proflavine)、溴化乙錠(ethidiumbromide)等染料，可以插入到DNA的堿基對之間，故稱為嵌入染料。這些扁平分子插入DNA后將堿基對間的距離撐大約一倍，正好占據了一個堿基對的位置。嵌入染料插入堿基重復位點處可造成兩條鏈錯位。在DNA復制時，新合成的鏈或者增加核苷酸插入，或者使核苷酸缺失，結果造成移碼突變。第34章DNA的復制與修復二、突變的類型

點突變（pointmutation）缺失（deletion）插入（insertion）重排（rearrangement）第34章DNA的復制與修復點突變（錯配）第34章DNA的復制與修復缺失移框突變：指缺失或插入（核苷酸）的突變，引起三聯(lián)密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變，其后果是翻譯出一級結構完全不同的另一種蛋白質。第34章DNA的復制與修復重排DNA分子內發(fā)生較大的交換。移位的DNA可以在新位點上顛倒方向反置（倒位），也可以在染色體之間發(fā)生交換重組。第34章DNA的復制與修復三、損傷的修復

光修復（photoreactivation)

切除修復(excisionrepair)

重組修復(recombinationrepair)

誘導修復（inductionrepair)第34章DNA的復制與修復1.光復活

高度專一的修復方式，它只作用于紫外線引起的DNA嘧啶二聚體DNA損傷的修復第34章DNA的復制與修復紫外光可見光激活該酶只有高等哺乳動物該功能退化掉了。例對細菌紫外誘變或殺滅時盡量保持暗環(huán)境。光復活酶結合于損傷部位第34章DNA的復制與修復切除修復：細胞內最重要的修復機制。通過切除損傷部位，剩下的空隙由DNA-polI催化dNTP聚合而填補，最后由DNA連接酶連接缺口。切除損傷在原核生物需Uvr蛋白類，真核生物需AP蛋白類。第34章DNA的復制與修復第34章DNA的復制與修復重組修復：重組修復是先復制再修復。這種情況出現在DNA損傷面積較大，來不及修復就進行復制。其損傷部位失去模板作用，造成子鏈上缺口出現。此時，可通過鏈間的交換，從完整母鏈將相應核苷酸序列片段移到子鏈填補該缺口。這時造成母鏈的缺口，再通過DNA-polI、DNA連接酶進行修復。這種修復的不足之處在于原損傷部位仍然存在，但隨著多次復制，損傷鏈所占比例越來越少。第34章DNA的復制與修復誘導修復（SOS修復）：

SOS是國際海難信號。SOS修復是指DNA損傷嚴重，細胞處在危急狀態(tài)下的一種修復方式。此種情況下，DNA單鏈缺口很多，由此誘發(fā)出一系列極復雜的反應以增強其修補能力。除參與修復的酶系統(tǒng)外，還有重組蛋白RecA和調控蛋白LexA等參與。這種修復反應特異性較低，對DNA的堿基識別能力差。通過SOS修復，細胞可存活，但DNA保留的錯誤較多，會引起長期廣泛的突變，往往導致細胞惡變。第34章DNA的復制與修復第34章DNA的復制與修復一、DNA損傷與腫瘤二、DNA損傷修復缺陷導致人類的遺傳疾病A、DNA修復缺陷導致的人類遺傳疾病B、細胞對DNA損傷應答缺陷導致的遺傳病第34章DNA的復制與修復DNA損傷與腫瘤日本廣島原子彈爆炸第34章DNA的復制與修復DNA損傷與腫瘤切爾諾貝利核電站大爆炸——世界上最嚴重的核事故8噸多強輻射物泄漏

污染區(qū)域超過20萬平方公里受害者約700萬人

消除影響需100多年

第34章DNA的復制與修復切爾諾貝利核電站泄漏第34章DNA的復制與修復

到現在，參加救援工作的83.4萬人中，已有5.5萬人喪生，7萬人成為殘疾人，30多萬人受放射傷害死去。烏克蘭共有250萬人因切爾諾貝利核事故而身患各種疾病，其中包括47.3萬兒童。在烏克蘭的核受害者中最常見的是甲狀腺疾病、造血系統(tǒng)障礙疾病、神經系統(tǒng)疾病以及惡性腫瘤等。離核電站僅３公里的普里皮亞季鎮(zhèn)，２０年來成為無人居住的“死城”。切爾諾貝利核電站３０公里以內被劃為隔離區(qū)，嚴格限制進入，出入的人必須持有有效證件。第34章DNA的復制與修復DNA損傷DNA修復異?；蛲蛔兡[瘤發(fā)生DNA損傷可以通過基因易位、重排、基因擴增、點突變等機