DB32T3680-2019玉米粗縮病病原免疫斑點檢測方法

ICS65.020.20

B16

DB32

江蘇省地方標準

DB32/T3680—2019

玉米粗縮病病原免疫斑點檢測方法

ThedetectionofpathogenforMaizeRoughDwarfdiseasebydotimmuobinding

assaymethod

2019-12-03發(fā)布2019-12-25實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3680—2019

玉米粗縮病病原免疫斑點檢測方法

1范圍

本標準規(guī)定了大麥、小麥、玉米植株和灰飛虱攜帶玉米粗縮病病原免疫斑點檢測方法。

本標準適用于大麥、小麥、玉米植株和灰飛虱攜帶玉米粗縮病病原的檢測。

2斑點酶聯(lián)免疫吸附檢測原理

硝酸纖維素膜具有很強的靜電吸附力，中性條件下即可有效地吸附蛋白質(zhì)等生物大分子。將抗原吸

附于硝酸纖維素膜后，可利用膜作為固相載體進行抗原抗體反應。當加入抗原的特異性抗體后，即可與

膜上的抗原結(jié)合，然后再加入帶有標記物的二抗，使酶標記通過二抗和相應抗體的結(jié)合間接地交聯(lián)于纖

維素膜上。最后加入標記物相應的底物后，標記物即可與底物作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點狀著色。

3儀器設備與試劑材料

3.1儀器設備

臺式離心機（5000r/min）；具蓋塑料離心管：200μL；培養(yǎng)皿（直徑為90mm）；塑料盒（規(guī)格

為100mm×50mm）。

3.2試劑材料

3.2.1試驗用水均為蒸餾水，使用的化學試劑未作說明均為分析純級別。

3.2.2包被緩沖液：0.05mol/L，pH值9.6。稱取1.59gNa2CO3和2.93gNaHCO3，加水定容至1000mL，

用HCl調(diào)pH值至9.6，4℃保存。

3.2.3磷酸鹽Tween20緩沖液（0.01MPBST）：0.01mol/L，pH=7.5。稱取40gNaCl,1gKCl,1gKH2PO4

和15gNa2HPO4，加水定容至5000mL，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7.5，再加入2.5mLTween20，4℃保存。

3.2.4磷酸鹽緩沖液（0.02MPBS）：0.02mol/L，pH值7.5。稱取40gNaCl，1gKCl，1gKH2PO4，

15gNa2HPO4，加水定容至2500mL，4℃保存。

3.2.51%脫脂奶粉封閉液：1g脫脂奶粉加入100mL磷酸鹽Tween20緩沖液中，4℃保存。

3.2.6辣根過氧化物酶固體顯色底物溶液：6mg的4-氯-1-萘酚加入2mL無水乙醇中，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

用時加入10mL磷酸鹽緩沖液中，再加入10μLH2O2。

3.2.7BCIP/NBT顯色底物：堿性磷酸酶底物顯色試劑盒。

3.2.8單克隆抗體（單抗）：玉米粗縮病病原RBSDV單克隆抗體，效價為1:5000～1:10000，－20℃保

存。

3.2.9酶標二抗：GoatAnti-MouseIgGAntibody，HRP（檢測灰飛虱），GoatAnti-MouseIgGAntibody,

AP（檢測植物），－20℃保存。

4植物樣品檢測

1

DB32/T3680—2019

4.1樣品制備

4.1.1田間采集新鮮的大麥、小麥、玉米植株的莖稈或葉片，裝至無菌樣品袋中。標記樣品編號、取樣

時間、取樣地點，48h內(nèi)送至實驗室，放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫苊夥磸蛢鋈凇?/p>

4.1.2取0.5mg大麥、小麥或玉米的莖稈或葉片研磨成粉末，碳酸鹽包被液稀釋100倍，離心（5000r/min）

3min，取上清液備用。

4.2封閉

4.2.1預先用鉛筆將硝酸纖維素膜（NC膜）劃成5mm×5mm的正方格，取2.0μL4.1獲得的上清液點于

NC膜上正方格中心（以不超出正方格一半為準）；同時取2.0μL已采用本方法測定為感染玉米粗縮病

的玉米汁液點于膜上預先標記好的正方格內(nèi)，作為陽性對照，取2.0μL已采用本方法測定為不感染玉米

粗縮病的玉米汁液點于膜上預先標記好的正方格內(nèi)，作為陰性對照，將膜置于室溫晾干。

4.2.2將干燥的膜置于塑料盒或玻璃培養(yǎng)皿，加入1%脫脂奶粉封閉液，要求將膜完全浸沒，37℃輕輕搖

晃，封閉30min。

4.3孵育

4.3.1用鑷子壓住膜倒棄封閉液，將單抗和1%脫脂奶粉封閉液按1:5000～1:10000比例稀釋配制孵育液，

將膜完全浸入孵育液，37℃輕輕搖晃，孵育1h～1.5h。

4.3.2用鑷子壓住膜倒棄孵育液，加入磷酸鹽Tween20緩沖液，將膜完全浸沒，輕輕搖晃，洗膜3min～5

min，用鑷子壓住膜倒棄洗液，重復洗膜三次。

4.4二抗孵育

4.4.1用鑷子壓住膜倒棄洗液，將二抗（GoatAnti-MouseIgGAntibody,AP）和封閉液按1:5000比例稀

釋配制孵育液，將膜完全浸入二抗孵育液，37℃輕輕搖晃，孵育1.5h～2h，再用鑷子壓住膜倒棄二抗

孵育液。

4.4.2加入磷酸鹽Tween20緩沖液，將膜完全浸沒，輕輕搖晃，洗膜3min～5min，用鑷子壓住膜倒棄洗

液，重復洗膜三次。

4.5顯色

用鑷子壓住膜倒棄洗液，加入BCIP/NBT顯色底物溶液，37℃靜置顯色30min；蒸餾水沖洗膜，室

溫晾干。

4.6結(jié)果判定

顯色后首先觀察對照的顏色反應，陽性對照應顯藍紫色，陰性對照應不顯色，再觀察樣品的顏色反

應，如果顯藍紫色，則認定植株感染了玉米粗縮病，如果不顯色，則認定未感染玉米粗縮病。試驗結(jié)果

記載表見附錄A。

5灰飛虱帶毒率檢測

5.1樣品制備

5.1.1采集灰飛虱高齡若蟲或成蟲，蟲量不少于100頭，裝至塑料瓶中。樣品儲存方法同4.1.1。

5.1.2單頭灰飛虱置于離心管中，加100μL碳酸鹽包被緩沖液，用牙簽搗爛，離心（5000r/min）3min，

取灰飛虱提取液備用。

2

DB32/T3680—2019

5.2封閉

同4.2。取2.0μL已采用本方法測定為帶毒的灰飛虱提取液作為陽性對照，取2.0μL已采用本方法測

定不帶毒的灰飛虱提取液，作為陰性對照。

5.3孵育

同4.3。

5.4二抗孵育

同4.4。二抗選GoatAnti-MouseIgGAntibody,HRP。

5.5顯色

用鑷子壓住膜倒棄洗液，加入辣根過氧化物酶固體顯色底物溶液，37℃靜置顯色30min；蒸餾水沖

洗膜，室溫晾干。

5.6結(jié)果判定

5.6.1灰飛虱帶毒判定

同4.6。

5.6.2帶毒率計算

按照公式1計算灰飛虱帶毒率，結(jié)果保留到小數(shù)點后一位。試驗結(jié)果記載表見附錄B。

Nc

Lc100…………公式1

Nt

式中：Lc—灰飛虱帶毒率，單位為百分率（%）；

Nc—帶毒灰飛虱蟲量；

Nt—測定灰飛虱總蟲量。

3

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附錄A

（規(guī)范性附錄）

植物樣品檢測結(jié)果記錄表

植物樣品檢測結(jié)果記錄表A.1。

表A.1植物樣品檢測結(jié)果記錄表

樣品采集日期樣品采集地點測定樣品數(shù)量陽性樣品數(shù)陰性樣品數(shù)鑒定技術(shù)負責

（株）（株）（株）人

4

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附錄B

（規(guī)范性附錄）

灰飛虱帶毒率測定結(jié)果記錄表

灰飛虱帶毒率測定記錄表B.1。

表B.1灰飛虱帶毒率測定結(jié)果記錄表

灰飛虱采灰飛虱采集灰飛虱代測定樣品數(shù)量陽性樣品數(shù)陰性樣品數(shù)帶毒率鑒定技術(shù)

集日期地點次（頭）（頭）（頭）（%）負責人

_________________________________

5

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前言

本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標準由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提出并歸口。

本標準起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學院。

本標準主要起草人：周彤、杜琳琳、周益軍、孫楓、蘭瑩、李碩、范永堅。

I

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玉米粗縮病病原免疫斑點檢測方法

1范圍

本標準規(guī)定了大麥、小麥、玉米植株和灰飛虱攜帶玉米粗縮病病原免疫斑點檢測方法。

本標準適用于大麥、小麥、玉米植株和灰飛虱攜帶玉米粗縮病病原的檢測。

2斑點酶聯(lián)免疫吸附檢測原理

硝酸纖維素膜具有很強的靜電吸附力，中性條件下即可有效地吸附蛋白質(zhì)等生物大分子。將抗原吸

附于硝酸纖維素膜后，可利用膜作為固相載體進行抗原抗體反應。當加入抗原的特異性抗體后，即可與

膜上的抗原結(jié)合，然后再加入帶有標記物的二抗，使酶標記通過二抗和相應抗體的結(jié)合間接地交聯(lián)于纖

維素膜上。最后加入標記物相應的底物后，標記物即可與底物作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點狀著色。

3儀器設備與試劑材料

3.1儀器設備

臺式離心機（5000r/min）；具蓋塑料離心管：200μL；培養(yǎng)皿（直徑為90mm）；塑料盒（規(guī)格

為100mm×50mm）。

3.2試劑材料

3.2.1試驗用水均為蒸餾水，使用的化學試劑未作說明均為分析純級別。

3.2.2包被緩沖液：0.05mol/L，pH值9.6。稱取1.59gNa2CO3和2.93gNaHCO3，加水定容至1000mL，

用HCl調(diào)pH值至9.6，4℃保存。

3.2.3磷酸鹽Tween20緩沖液（0.01MPBST）：0.01mol/L，pH=7.5。稱取40gNaCl,1gKCl,1gKH2PO4

和15gNa2HPO4，加水定容至5000mL，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7.5，再加入2.5mLTween20，4℃保存。

3.2.4磷酸鹽緩沖液（0.02MPBS）：0.02mol/L，pH值7.5。稱取40gNaCl，1gKCl，1gKH2PO4，

15gNa2HPO4，加水定容至2500mL，4℃保存。

3.2.51%脫脂奶粉封閉液：1g脫脂奶粉加入100mL磷酸鹽Tween20緩沖液中，4℃保存。

3.2.6辣根過氧化物酶固體顯色底物溶液：6mg的4-氯-1-萘酚加入2mL無水乙醇中，4℃保存?zhèn)溆?，?/p>

用時加入10mL磷酸鹽緩沖液中，再加入10μLH2O2。

3.2.7BCIP/NBT顯色底物：堿性磷酸酶底物顯色試劑盒。

3.2.8單克隆抗體（單抗）：玉米粗縮病病原RBSDV單克隆抗體，效價為1:5000～1:10000，－20℃保

存。

3.2.9酶標二抗：GoatAnti-MouseIgGAntibody，HRP（檢測灰飛虱），GoatAnti-MouseIgGAntibody,

AP（檢測植物），－20℃保存。

4植物樣品檢測

1

DB32/T3680—2019

4.1樣品制備

4.1.1田間采集新鮮的大麥、小麥、玉米植株的莖稈或葉片，裝至無菌樣品袋中。標記樣品編號、取樣

時間、取樣地點，48h內(nèi)送至實驗室，放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，避免反復凍融?/p>

4.1.2取0.5mg大麥、小麥或玉米的莖稈或葉片研磨成粉末，碳酸鹽包被液稀釋100倍，離心（5000r/min）

3min，取上清液備用。

4.2封閉

4.2.1預先用鉛筆將硝酸纖維素膜（NC膜）劃成5mm×5mm的正方格，取2.0μL4.1獲得的上清液點于

NC膜上正方格中心（以不超出正方格一半為準）；同時取2.0μL已采用本方法測定為感染玉米粗縮病

的玉米汁液點于膜上預先標記好的正方格內(nèi)，作為陽性對照，取2.0μL已采用本方法測定為不感染玉米

粗縮病的玉米汁液點于膜上預先標記好的正方格內(nèi)，作為陰性對照，將膜置于室溫晾干。

4.2.2將干燥的膜置于塑料盒或玻璃培養(yǎng)皿，加入1%脫脂奶粉封閉液，要求將膜完全浸沒，37℃輕輕搖

晃，封閉30min。

4.3孵育

4.3.1用鑷子壓住膜倒棄封閉液，將單抗和1%脫脂奶粉封閉液按1:5000～1:10000比例稀釋配制孵育液，

將膜完全浸入孵育液，37℃輕輕搖晃，孵育1h～1.5h。

4.3.2用鑷子壓住膜倒棄孵育液，加入磷酸鹽Tween20緩沖液，將膜完全浸沒，輕輕搖晃，洗膜3min～5

min，用鑷子壓住膜倒棄洗液，重復洗膜三次。

4.4二抗孵育

4.4.1用鑷子壓住膜倒棄洗液，將二抗（GoatAnti-MouseIgGAntibody,AP）和封閉液按1:5000比例稀

釋配制孵育液，將膜完全浸入二抗孵育液，37℃輕輕搖晃，孵育1.5h～2h，再用鑷子壓住膜倒棄二抗

孵育液。

4.4.2加入磷酸鹽Tween20緩沖液，將膜完全浸沒，輕輕搖晃，洗膜3min～5min，用鑷子壓住膜倒棄洗

液，重復洗膜三次。

4.5顯色

用鑷子壓住膜倒棄洗液，加入BCIP/NBT顯色底物溶液，37℃靜置顯色30min；蒸餾水沖洗膜，室

溫晾干。

4.6結(jié)果判定

顯色后首先觀察對照的顏色反應，陽性對照應顯藍紫色，陰性對照應不顯色，再觀察樣品的顏色反

應，如果顯藍紫色，則認定植株感染了玉米粗縮病，如