酶的發(fā)酵生產(chǎn)

酶的發(fā)酵生產(chǎn)本章內(nèi)容3.1概述3.2酶生物合成的基本原理3.3發(fā)酵工藝條件及控制3.4微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶及提高發(fā)酵產(chǎn)酶量的方法3.5動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶第2頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.1概述第3頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.1.1酶的合成途徑化學(xué)合成，包括酶的化學(xué)全合成、酶類似物和模擬酶的化學(xué)合成。1964年我國(guó)從氨基酸出發(fā)，以化學(xué)方法全合成了具有生物活性的胰島素，1969年Gutte和Merrifield也通過(guò)化學(xué)法人工合成了具有活性的核糖核酸酶，現(xiàn)在已發(fā)展了一整套固相合成肽的自動(dòng)化技術(shù)。生物合成，在一定的條件下通過(guò)生物體、生物組織或細(xì)胞內(nèi)的代謝合成所需的酶。包括微生物、動(dòng)植物及組織和細(xì)胞等。當(dāng)前絕大部分的酶是通過(guò)此方法合成的。第4頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.1.2現(xiàn)有酶生產(chǎn)主要方法酶制劑工業(yè)的發(fā)展早期，酶多取自動(dòng)植物原料。單動(dòng)植物的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、同時(shí)還受地理、氣候和季節(jié)等各種因素的限制，不適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。近年酶的生產(chǎn)幾乎都轉(zhuǎn)向采用微生物發(fā)酵，主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：種類繁多，凡是動(dòng)植物體內(nèi)有的酶幾乎都能從微生物中找到，并可根據(jù)應(yīng)用特點(diǎn)和要求，篩選出最佳的產(chǎn)酶菌株。繁殖快，發(fā)酵周期短，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，能通過(guò)控制培養(yǎng)條件大幅提高酶的產(chǎn)量。微生物具有較強(qiáng)的適用能力，可采用遺傳變異手段，培育出新的、更理想菌株，和對(duì)酶進(jìn)行改進(jìn)和修飾。第5頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.1.3微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的生產(chǎn)方式固體培養(yǎng)發(fā)酵以麩皮、米糠等為主要原料，加入其它必要的營(yíng)養(yǎng)成分，制成固體或半固體的麩曲，經(jīng)過(guò)滅菌、冷卻后，接種產(chǎn)酶微生物菌株，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵，以獲得所需的酶。適合霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶，以及制作酒曲、醬油曲等。液體深層發(fā)酵采用液體培養(yǎng)基，在生物反應(yīng)器中，經(jīng)滅菌、冷卻后，接種產(chǎn)酶細(xì)胞，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)得到所需酶。酶的產(chǎn)率高，質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率高，是目前酶發(fā)酵的生產(chǎn)的主要方式。固定化細(xì)胞發(fā)酵20世紀(jì)70年代后發(fā)展的技術(shù)，把微生物固定在水不溶性的載體上，進(jìn)行多批次連續(xù)或間歇發(fā)酵。這種發(fā)酵具有：細(xì)胞密度大，產(chǎn)酶能力高；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間；細(xì)胞固定在載體上，流失較少，可在高稀釋率條件下連續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵液含菌體少，利于產(chǎn)品分離。第6頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.2酶生物合成的基本原理第7頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.2.1酶生物合成的基本過(guò)程1958年克里克(Crick)提出了中心法則，認(rèn)為蛋白質(zhì)的合成主要是按以下過(guò)程進(jìn)行：

轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白質(zhì)DNARNA第8頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.2.2RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在依賴DNA的RNA聚合酶(又稱轉(zhuǎn)錄酶)的作用下，生成RNA。轉(zhuǎn)錄包括3個(gè)步驟：轉(zhuǎn)錄的起始、RNA鏈的延伸和RNA鏈合成的終止。在原核和真核生物中，除了轉(zhuǎn)錄酶、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)錄后RNA前體的加工外，轉(zhuǎn)錄過(guò)程大致相同。第9頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄的起始RNA的生物合成的起始位點(diǎn)是在DNA的啟動(dòng)基因(啟動(dòng)子)上，識(shí)別啟動(dòng)基因的任務(wù)由σ因子完成，帶有σ因子的全酶與DNA分子的啟動(dòng)基因結(jié)合，選擇一條鏈為模板開(kāi)始合成，之后由核心酶進(jìn)行RNA的延伸。轉(zhuǎn)錄起始階段的過(guò)程如下：核心酶與σ因子結(jié)合成為全酶。全酶與模板DNA結(jié)合生成不穩(wěn)定的復(fù)合物，全酶可沿著模板DNA移動(dòng)，尋找識(shí)別位點(diǎn)。全酶與啟動(dòng)基因結(jié)合生產(chǎn)酶與啟動(dòng)基因的復(fù)合物。模板DNA局部變性，DNA的雙螺旋部分解鏈。全酶移至轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，生產(chǎn)穩(wěn)定的酶-DNA復(fù)合物，按堿基互補(bǔ)結(jié)合第一個(gè)核苷三磷酸，轉(zhuǎn)錄正式開(kāi)始，σ因子釋放。第10頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第11頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第12頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第13頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第14頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.2.3酶蛋白的生物合成——翻譯翻譯：以mRNA為模板，利用各種氨基酸為底物，在核糖體上通過(guò)各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過(guò)程。是將mRNA分子上的堿基排列次序轉(zhuǎn)變?yōu)槎嚯逆溕习被崤帕写涡虻倪^(guò)程?；具^(guò)程包括：氨基酸活化肽鏈合成的起始肽鏈的延伸肽鏈合成的終止新生肽鏈的加工第15頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天氨基酸活化生產(chǎn)氨酰-tRNA氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的催化作用下，由ATP提供能量，與特定的tRNA結(jié)合生成氨酰-tRNA，AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶AA-tRNA+AMP+PPi對(duì)真核生物，肽鏈的第一個(gè)氨基酸為甲硫氨酸活化后為Met-tRNAMet，原核生物主要是甲酰甲硫氨酸活化后為fMet-tRNAF。第16頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天肽鏈合成的起始原核生物肽鏈的起始階段是在GTP和起始因子(Initiationfactor)的參入下，核糖體30S亞基、fMet-tRNAF、mRNA和50S亞基結(jié)合，組成起始復(fù)合物的過(guò)程。30S亞基先與mRNA結(jié)合，再與fMet-tRNAF結(jié)合，最后與50S亞基生產(chǎn)70S核糖體真核生物與原核生物稍有差別，主要是起始氨基酸為Met-tRNAMet

，40S亞基先與Met-tRNAMet結(jié)合，再與mRNA結(jié)合，最后與60S亞基結(jié)合生成80S核糖體。第17頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第18頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天合成過(guò)程第19頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.3發(fā)酵工藝條件及控制第20頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝過(guò)程保藏菌種細(xì)胞活化細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)固定化細(xì)胞原生質(zhì)體發(fā)酵固定化原生質(zhì)體預(yù)培養(yǎng)分離純化酶培養(yǎng)基無(wú)菌空氣工藝條件的控制在發(fā)酵過(guò)程中有詳細(xì)的介紹第21頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.4酶合成的調(diào)控及提高發(fā)酵產(chǎn)酶量的方法第22頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.4.1酶合成的調(diào)控機(jī)制酶的產(chǎn)量受其合成調(diào)節(jié)機(jī)制的控制，要大幅度提高酶產(chǎn)量就必須設(shè)法打破這種調(diào)節(jié)機(jī)制。酶和其他蛋白質(zhì)一樣，其合成可在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等各種水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)控制。對(duì)于原核生物，由于其轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程緊密關(guān)聯(lián)，因此，只要控制轉(zhuǎn)錄，也就可控制酶的合成。其調(diào)控機(jī)制普遍接受的是操縱子模型。第23頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天原核生物操縱子及其調(diào)節(jié)操縱子(Operon)包括兩部分：一是荷載著有關(guān)酶的結(jié)構(gòu)密碼，決定酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因；另一是由操縱基因和啟動(dòng)基因等組成的調(diào)控基因。操縱基因在操縱子中起開(kāi)關(guān)的作用，當(dāng)開(kāi)關(guān)“開(kāi)啟”時(shí)，附著在啟動(dòng)基因上依賴于DNA的RNA聚合酶(DDRP)就能通過(guò)這一開(kāi)關(guān)，沿著結(jié)構(gòu)基因移動(dòng)，并以結(jié)構(gòu)基因?yàn)槟０暹M(jìn)行轉(zhuǎn)錄，合成mRNA；而后再轉(zhuǎn)入翻譯合成有關(guān)蛋白質(zhì)和酶。反之操縱基因“關(guān)閉”時(shí)，DDRP移動(dòng)受阻，無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，及后續(xù)合成。第24頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天原核生物操縱子及其調(diào)節(jié)操縱基因的開(kāi)、關(guān)受調(diào)節(jié)基因控制，調(diào)節(jié)基因編碼調(diào)節(jié)蛋白(因大多表現(xiàn)阻礙作用，又叫阻礙蛋白)。在一些酶的合成調(diào)節(jié)中，阻礙蛋白直接和操縱基因結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行；而另一些酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制中，阻礙蛋白不能直接與操縱基因結(jié)合，只有在相應(yīng)效應(yīng)物存在下形成阻礙蛋白-效應(yīng)物絡(luò)合物，才能與操縱子結(jié)合，使之關(guān)閉。調(diào)節(jié)方式有：誘導(dǎo)和阻礙。第25頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天操縱子大腸桿菌操縱子示意圖第26頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天誘導(dǎo)調(diào)節(jié)某些酶在通常情況下不合成或合成甚少，但加入“誘導(dǎo)物(Inducer)”后，就能大量合成，這種現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)(Induction)。誘導(dǎo)機(jī)制：調(diào)節(jié)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白(阻礙蛋白)是一類別構(gòu)蛋白。一方面能直接和操縱基因結(jié)合，阻礙酶的合成；另一方面，它們也能和誘導(dǎo)物結(jié)合，結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變，失去和操縱基因結(jié)合的能力，使“開(kāi)關(guān)”打開(kāi)。加入誘導(dǎo)物時(shí)能誘導(dǎo)酶大量合成。參入分解代謝的酶，如淀粉酶、纖維素酶等受這種方式調(diào)節(jié)。第27頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天阻礙調(diào)節(jié)阻礙有兩種類型：尾產(chǎn)物(反饋)阻礙和分解代謝產(chǎn)物阻礙。尾產(chǎn)物阻礙是指在生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，原以一定速度合成的某些酶，當(dāng)這些酶催化生產(chǎn)的產(chǎn)物累積到某種濃度水平并能滿足需要時(shí)，這些酶的合成就會(huì)受到阻礙，這就是尾產(chǎn)物阻礙(反饋?zhàn)璧K)。尾產(chǎn)物阻礙的機(jī)制可能是阻礙蛋白本身沒(méi)有和操縱基因結(jié)合的能力，因而在通常情況下不會(huì)構(gòu)成阻礙；但，這種阻礙蛋白能以酶反應(yīng)的尾產(chǎn)物為效應(yīng)物，即輔阻礙物，與之結(jié)合，產(chǎn)生別構(gòu)效應(yīng)，形成能和操縱基因結(jié)合的阻礙蛋白-尾產(chǎn)物絡(luò)合物，阻礙酶的合成。第28頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天阻礙調(diào)節(jié)分解代謝產(chǎn)物阻礙是指有些酶，特別是參與分解代謝的酶，當(dāng)細(xì)胞在容易被利用的營(yíng)養(yǎng)成分(如葡萄糖)上生長(zhǎng)時(shí)，其合成受到的阻礙。分解代謝產(chǎn)物阻礙的機(jī)制較復(fù)雜，原因之一可能和啟動(dòng)基因與DDRP的結(jié)合有關(guān)。第29頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.4.2提高酶產(chǎn)量的方法酶合成調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)的作用是生物機(jī)體將體內(nèi)的合成原料與能量最經(jīng)濟(jì)有效地用于合成生命最需要的物質(zhì)的保證。但，從應(yīng)用的目的出發(fā)，則應(yīng)打破這種調(diào)節(jié)控制，以其使某些酶的產(chǎn)量大幅度地提高?，F(xiàn)已報(bào)道，在采取相應(yīng)的措施后，其產(chǎn)量可有上千倍的變化。打破這種調(diào)節(jié)可從內(nèi)外兩方面入手：條件控制：如添加誘導(dǎo)物、降低阻礙物濃度遺傳控制：如基因突變、基因重組第30頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天通過(guò)添加誘導(dǎo)物提高酶產(chǎn)量這種辦法僅適用于可誘導(dǎo)的酶類，但產(chǎn)生的效果有時(shí)十分顯著，其關(guān)鍵在于選擇適宜的誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)物濃度。最初認(rèn)為底物是首選的誘導(dǎo)物。現(xiàn)在的認(rèn)識(shí)是，強(qiáng)有力的誘導(dǎo)物首先是那些難以代謝的底物類似物。異丙基-b-D-巰基半乳糖（IPTG），是半乳糖苷酶的極好誘導(dǎo)物。其次也可以是底物或誘導(dǎo)物的前體，如犬尿氨酸雖能誘導(dǎo)犬尿氨酸酶，但它的前——體色氨酸的誘導(dǎo)效果更佳。誘導(dǎo)物的濃度對(duì)誘導(dǎo)有重要的影響，在誘導(dǎo)作用范圍內(nèi)，酶的誘導(dǎo)生成速度正比于誘導(dǎo)物的濃度直至飽和值，當(dāng)進(jìn)一步升高有可能就會(huì)其阻礙作用。如纖維二糖的濃度維持在0.05mg/ml以下可大量誘導(dǎo)纖維素酶的形成，當(dāng)濃度升高100倍，纖維素酶就會(huì)顯著受到阻礙。第31頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天通過(guò)降低阻礙物濃度提高酶產(chǎn)量阻礙可由分解代謝產(chǎn)物引起，也可因酶反應(yīng)的尾產(chǎn)物積累而產(chǎn)生，因此控制二種產(chǎn)物的生產(chǎn)與積累常可提高酶產(chǎn)量。通用的原則是，應(yīng)避免采用過(guò)于豐富的培養(yǎng)基和避免使用易被利用的碳源；并設(shè)法阻止效應(yīng)物的形成，降低培養(yǎng)基中效應(yīng)物的濃度。對(duì)受分解代謝產(chǎn)物阻礙的酶，限制碳源或相應(yīng)生長(zhǎng)因子的供應(yīng)尤為重要。如以緩慢速度添加多聚半乳糖醛酸，并限制其它碳源的供應(yīng)，可使液化氣單孢菌生產(chǎn)多聚半乳糖醛酸消去酶產(chǎn)量提高近千倍。對(duì)于合成代謝的酶，解決尾產(chǎn)物阻礙的方法為：在培養(yǎng)基中添加阻止尾產(chǎn)物形成的抑制劑；采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株。第32頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天通過(guò)基因突變提高酶產(chǎn)量基因突變可發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因上，也可發(fā)生在操縱子上。前者導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的改變，而后者可引起酶產(chǎn)量的升高或降低。根據(jù)酶合成調(diào)節(jié)機(jī)制，基因突變后有兩種情況可提高酶的產(chǎn)量：從誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成型，即獲得的突變株在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在