熒光定量原理及其應用

熒光定量原理及其應用實時熒光定量PCR的基本原理

實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖.第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天熒光擴增曲線分為三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天熒光背景信號階段：為擴增最初的10～15個循環(huán)，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。平臺期：擴增產物已不再呈指數級的增加。PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天指數期：此期PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，因此我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天熒光閾值：是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。CT值：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數被稱為CT值。第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天CT值與起始模板的關系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，到達熒光閾值的CT值越小，反之越大。第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中縱坐標代表起始拷貝數的對數，橫坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天定量方法絕對定量：是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天相對定量：是通過與內參基因Ct值之間的相差來計算表達基因的差異，也稱之為2-ΔΔCt。第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天其他定量方法第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR檢測模式熒光定量PCR的理論基礎：均基于熒光共振能量轉移（FRET)的原理，即當一個熒光基團與一個淬滅基團的距離鄰近時（＜10nm)，就會發(fā)生熒光能量轉移，淬滅基團會吸收熒光基團在激發(fā)光作用下的激發(fā)熒光，從而使其發(fā)不出熒光。但如果熒光基團一旦與淬滅基團分開，淬滅作用即消失。第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天檢測模式SYBRGreenI檢測模式：SYBRGreenI是一種結合于小溝中的雙鏈DNA結合染料。與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強。第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天缺點：PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光，通常本底較高，引起假陽性。優(yōu)點：通用性好，價格低，在科研中使用較普遍。第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天水解探針模式（Taqman）TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’

末端，而淬滅劑則在3’

末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’

端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5’

外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天一分子的產物生成就伴隨著一分子熒光信號的產生，隨著循環(huán)數增加，熒光信號不斷積累。第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天分子信標探針模式分子信標是一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結構的雙標記寡核苷酸探針。分子信標的莖環(huán)結構中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結構。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天模板不存在時形成莖環(huán)結構，熒光基團和淬滅基團緊緊靠近而被淬滅。當存在模板時，環(huán)序列將與模板配對，此時分子信標成鏈狀而非莖環(huán)狀，熒光基團與淬滅劑分開，使得熒光基團發(fā)出熒光。第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天其它還有雙雜交探針、蝎形探針、LUXPrimers等模式。第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天引物設計原則引物最適長度為15～20bp.G+C含量為40～60%。引物的Tm值應相似，差異不超過1～2℃.產物長度在80～150bp.不能形成引物二聚體。第22頁,共25頁，2024年2月25日，星期天Taqman探針設計原則

長度30-45bp,Tm比引物至少高5℃。盡量靠近上游引物。5’端不要有G，G會有淬滅作用，影響定量。3’端必須封閉。第23頁,共25頁，2024年2月25日，星期天實時熒光定量PCR的應用目前實時熒光PCR技術已經被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領域。其中最主要的應用集中在以下幾個方面：1.DNA或RNA的絕對定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。第24頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2.基因表達差