酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測傷寒抗體方法的建立

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測傷寒抗體方法的建立一、何為傷寒傷寒是由傷寒桿菌引起的急性腸道傳染病。傷寒是一種古老的傳染病，但在目前的傳染病防治中，仍占有重要的地位。我國的中醫(yī)學(xué)書刊中所稱的“傷寒”，指許多熱性疾病，在中醫(yī)學(xué)屬于“濕溫”病范疇，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的傷寒與副傷寒，具有不同的含義。傷寒是一種全身性的疾病，并非只局限于腸道受損。傷寒的基本病理特征是持續(xù)的菌血癥與毒血癥，單核吞噬細胞系統(tǒng)的增生性反應(yīng)，以回腸下段淋巴組織為主的增生、腫脹、壞死與潰瘍形成等病變?yōu)轱@著。第2頁,共31頁，2024年2月25日，星期天二、傷寒的檢測傷寒是由傷寒桿菌引起的急性傳染病，終年可發(fā)病，以夏秋季為多

。對沙門菌進行快速檢測，及早發(fā)現(xiàn)傳染源，切斷傳播途徑，是最有效地防治沙門菌病的手段。一直以來，傷寒的實驗室診斷方法主要靠細菌培養(yǎng)和肥達氏反應(yīng)。前者的陽性率受病人應(yīng)用抗生素的影響,而后者在病程的后期才出現(xiàn)陽性,且敏感性較低。這兩種檢測方法繁瑣,需要時間較長,難以達到早期、快速診斷目的。為尋求敏感而特異的傷寒桿菌抗體檢測法,我們建立了ELISA試驗,檢測傷寒病人血清中O抗體,我們采用購買的的傷寒沙門氏菌O抗原免疫家兔，抽取家兔血，經(jīng)分離與粗純化，得到粗純化的傷寒沙門菌O抗體，建立檢測傷寒沙門氏菌O抗體的ELISA競爭法,并對傷寒沙門氏菌O抗體進行了檢測。第3頁,共31頁，2024年2月25日，星期天三、ELISA實驗原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接的放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。第4頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共31頁，2024年2月25日，星期天競爭法競爭法(ComperingELISA)可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于因相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量成反比。操作步驟如下：①將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)形成固相抗體，洗滌、封板；②待測管中加受槍標(biāo)本與一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與因相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。這樣，受撿標(biāo)本中抗原量越高，則由于這些抗原與固相抗體的結(jié)合，競爭性的占去了晦標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合的機會，使酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合量越少。參考管中只加酶標(biāo)抗原。孵育后，酶體抗原與固相抗體的結(jié)合可達最充分的量、洗滌。③加庇物顯色。參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原量最多，故顏色最深。參考音顏色深度與待測管顏色深度之差．代表受檢標(biāo)本巾抗原的量。待測管顏色越淡．表示標(biāo)本中抗原量越多。第6頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共31頁，2024年2月25日，星期天酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測傷寒O抗體材料與方法第9頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共31頁，2024年2月25日，星期天一、抗體的制備采用顆粒性抗原（傷寒O抗原）免疫家兔。周數(shù)日期操作第一周第一天（2015.9.7）耳緣靜脈注射傷寒O菌液0.1ml第二天（2015.9.8）耳緣靜脈注射傷寒O菌液0.2ml第三天（2015.9.9）耳緣靜脈注射傷寒O菌液0.2ml第四天（2015.9.10）耳緣靜脈注射傷寒O菌液0.5ml第二周第一天（2015.9.14）兩側(cè)背部皮下注射傷寒O菌液各0.5ml第三周第一天（2015.9.21）耳緣靜脈采血至少20ml第11頁,共31頁，2024年2月25日，星期天二、抗體的鑒定直接凝集試驗3周后由已免疫兔的耳緣靜脈采血0.5ml，37℃，2500r/min離心30min，取血清。取潔凈試管10支，編號，將血清做1:10稀釋。混勻后，37℃孵育2~4小時，觀察結(jié)果。管號12345678910生理鹽水0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5稀釋血清0.50.50.50.50.50.50.50.50.50傷寒菌液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5終稀釋濃度1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120—棄第12頁,共31頁，2024年2月25日，星期天三、抗體的分離與純化①取分離好的免疫血清一份（5ml），加入一份生理鹽水（5ml）。②緩慢搖動，加入兩份飽和硫酸銨溶液（10ml），室溫靜置1.5h。③2000r/min離心20min，吸棄上清。④用適量生理鹽水（1~2ml）溶解沉淀，放置于透析袋中，透析24h。⑤收集，標(biāo)記得到的傷寒沙門氏菌粗抗體，冰凍保存。第13頁,共31頁，2024年2月25日，星期天四、酶標(biāo)抗體的制備——過碘酸鈉法①取5mgHRP溶于0.5mlPH5.6HAC-NaAc緩沖液中，滴入NaIO4水溶液0.25ml，混勻，4℃作用30min。②再加入2.5%乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30min。③然后加入待分離純化的粗抗體1.5~2.0ml，用PH9.5的碳酸鹽緩沖液調(diào)整反應(yīng)液的PH至9.0左右，4℃過夜。④加入NaBH4溶液0.1ml，混勻，4℃作用2h，以PH7.4的PBS溶液溶解沉淀于透析袋中，4℃過夜。⑤次日收集。第14頁,共31頁，2024年2月25日，星期天五、ELISA預(yù)實驗①包被抗原：傷寒抗原用包被液稀釋，每孔加入0.1ml，37℃作用4h（或4℃作用24h）。②洗滌：棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次30s，于吸水紙上充分拍干。③加入樣品：每孔加入按倍數(shù)稀釋好的酶標(biāo)抗體及待測抗體各0.1ml，混勻，放入37℃恒溫箱中孵育30min。④洗滌：棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次30s，于吸水紙上充分拍干。加入底物液：每孔加入底物液A液1滴，B液1滴，避光放置5~15min，觀察顏色變化。第15頁,共31頁，2024年2月25日，星期天1:11:51:251:1251:251:501:1001:200待測Ab酶標(biāo)AbELISA預(yù)實驗第16頁,共31頁，2024年2月25日，星期天六、ELISA正式實驗①包被抗原。②棄去ELISA板孔中的包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30s，在濾紙上拍干。③將各組原倍的待測血清與工作濃度的酶標(biāo)抗體，分別加入各孔中，每孔各0.1ml，同時設(shè)定陰性對照，37℃孵育30min。④棄去孔中液體，用洗滌液洗滌3次，每次30s，在濾紙上拍干。⑤加底物顯色，每孔加入底物液A液1滴，B液1滴，避光放置5~15min，觀察顏色變化。第17頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第一組待測Ab第二組待測Ab第三組待測Ab第四組待測Ab陰性對照1:100待測Ab酶標(biāo)AbELISA正式實驗第18頁,共31頁，2024年2月25日，星期天酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測傷寒O抗體實驗結(jié)果第19頁,共31頁，2024年2月25日，星期天一、直接凝集實驗結(jié)果21435678910實驗結(jié)果肉眼觀察在第7管無凝集，直接凝集實驗粗略估計傷寒O抗體的效價為1：1280。第20頁,共31頁，2024年2月25日，星期天二、酶標(biāo)抗體的制備與鑒定用過碘酸鈉法制備的酶標(biāo)抗體經(jīng)ELISA競爭法鑒定結(jié)果：陰陽色差最明顯為第三排，即最佳工作濃度為1:100，與第五孔顏色相差最大的味待測抗體原倍濃度。1:251:501:1001:2001:11:51:251:125陰性第21頁,共31頁，2024年2月25日，星期天三、ELISA競爭法的目測結(jié)果ELISA競爭法目測實驗結(jié)果：陰性對照孔出現(xiàn)藍色；每組均與陰性對照孔有鮮明對比，抗體制備均良好。第二組顏色最淺，抗體效價最高。由于第三組無待測血清，故無第三組結(jié)果124對照對照421第22頁,共31頁，2024年2月25日，星期天酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測傷寒O抗體實驗討論及分析第23頁,共31頁，2024年2月25日，星期天一、ELISA實驗過程中注意事項①實驗前半小時從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。選取精確移液管，恒溫孵育前振搖過程不可忽略。②操作過程應(yīng)準(zhǔn)確無誤，實驗中稀釋液、酶標(biāo)液、質(zhì)控物、陰陽性對照和標(biāo)本的加入量一定要準(zhǔn)確，防止陽性對照和未知陽性標(biāo)本的濺灑造成假陽性結(jié)果，以及感染操作人員。第24頁,共31頁，2024年2月25日，星期天③孵育溫度和時間是夾心抗體（或抗原）形成、競爭結(jié)合反應(yīng)的必要因素，因此要嚴(yán)格控制。一般來說，溫度提高而抗原抗體結(jié)合的時間可縮短，否則時間延長，所以在試驗前要選擇最佳溫度與時間。④洗滌時間洗板時應(yīng)使洗液注滿反應(yīng)孔，調(diào)節(jié)洗板次數(shù)，保證洗板徹底。洗滌的干凈程度直接影響結(jié)果。洗板是ELISA

檢測的重要環(huán)節(jié)，應(yīng)嚴(yán)格按說明書進行，達到洗滌次數(shù)和間隔時間要求，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確度。第25頁,共31頁，2024年2月25日，星期天二、ELISA實驗過程中的顯色問題所有檢測孔均無色：原因可能為酶結(jié)合物或底物失效、底物漏加（錯加）、陽性對照漏加或錯加，其中以酶結(jié)合物失效和底物錯加為常見。查找原因的方法是將酶結(jié)合物與底物直接混合，觀察有無顯色；如顯色則提示為陽性對照漏加或底物錯加所致；若不顯色，用新酶結(jié)合物與底物混合，觀察有無顯色；不顯色則提示底物失效，顯色提示原用酶結(jié)合物失效。所有檢測孔均顯色：原因多為洗板不凈（孔內(nèi)殘留未結(jié)合的酶結(jié)合物）或顯色時間過長。第26頁,共31頁，2024年2月25日，星期天三、ELISA法與肥達氏反應(yīng)法對診斷傷寒的比較分析

肥達氏診斷傷寒為經(jīng)典血清學(xué)檢驗主要檢測血清中抗體，從感染到血中產(chǎn)生抗體要有一定時間，而且操作繁瑣，結(jié)果慢（過夜觀察）。傷寒桿菌抗原酶免ELISA其包被和酶標(biāo)記抗體均針對傷寒桿菌的單克隆抗體直接檢測血清中抗原特異性強、快速、操作簡便、從加樣到判讀實驗結(jié)果僅需45min。兩法通過χ2檢驗P<0.05，具有顯著性差異，可作為早期快速輔助診斷傷寒的血清學(xué)方法。第27頁,共31頁，2024年2月25日，星期天近年來由于:①抗生素及皮質(zhì)激素的使用有抑制抗體滴度作用。②有些患者感染較輕產(chǎn)生抗體較少。③患者體弱免疫反映弱缺乏丙種球蛋白不能產(chǎn)生抗體。少數(shù)患者肥達氏凝集效價始終不高，且肥達氏反應(yīng)陽性反應(yīng)出現(xiàn)較晚。單憑肥達氏反映診斷傷寒有其局限性，易出現(xiàn)漏診，因此早期采用單克隆抗體檢測血清中抗原幫助臨床及早輔助診斷傷寒。第28頁,共31頁，2024年2月25日，星期天四、獲得高效價的傷寒O抗體的原因分析①在抗體的制備過程中，免疫動物的選擇，設(shè)計有效的免疫程序均可影響制備的抗體質(zhì)量。