酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)傷寒抗體方法的建立

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)傷寒抗體方法的建立一、何為傷寒傷寒是由傷寒桿菌引起的急性腸道傳染病。傷寒是一種古老的傳染病，但在目前的傳染病防治中，仍占有重要的地位。我國(guó)的中醫(yī)學(xué)書刊中所稱的“傷寒”，指許多熱性疾病，在中醫(yī)學(xué)屬于“濕溫”病范疇，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的傷寒與副傷寒，具有不同的含義。傷寒是一種全身性的疾病，并非只局限于腸道受損。傷寒的基本病理特征是持續(xù)的菌血癥與毒血癥，單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的增生性反應(yīng)，以回腸下段淋巴組織為主的增生、腫脹、壞死與潰瘍形成等病變?yōu)轱@著。第2頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、傷寒的檢測(cè)傷寒是由傷寒桿菌引起的急性傳染病，終年可發(fā)病，以夏秋季為多

。對(duì)沙門菌進(jìn)行快速檢測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)傳染源，切斷傳播途徑，是最有效地防治沙門菌病的手段。一直以來，傷寒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要靠細(xì)菌培養(yǎng)和肥達(dá)氏反應(yīng)。前者的陽性率受病人應(yīng)用抗生素的影響,而后者在病程的后期才出現(xiàn)陽性,且敏感性較低。這兩種檢測(cè)方法繁瑣,需要時(shí)間較長(zhǎng),難以達(dá)到早期、快速診斷目的。為尋求敏感而特異的傷寒桿菌抗體檢測(cè)法,我們建立了ELISA試驗(yàn),檢測(cè)傷寒病人血清中O抗體,我們采用購(gòu)買的的傷寒沙門氏菌O抗原免疫家兔，抽取家兔血，經(jīng)分離與粗純化，得到粗純化的傷寒沙門菌O抗體，建立檢測(cè)傷寒沙門氏菌O抗體的ELISA競(jìng)爭(zhēng)法,并對(duì)傷寒沙門氏菌O抗體進(jìn)行了檢測(cè)。第3頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、ELISA實(shí)驗(yàn)原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接的放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。第4頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天第5頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法(ComperingELISA)可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于因相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量成反比。操作步驟如下：①將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)形成固相抗體，洗滌、封板；②待測(cè)管中加受槍標(biāo)本與一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與因相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。這樣，受撿標(biāo)本中抗原量越高，則由于這些抗原與固相抗體的結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性的占去了晦標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合量越少。參考管中只加酶標(biāo)抗原。孵育后，酶體抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量、洗滌。③加庇物顯色。參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原量最多，故顏色最深。參考音顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差．代表受檢標(biāo)本巾抗原的量。待測(cè)管顏色越淡．表示標(biāo)本中抗原量越多。第6頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天第7頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)傷寒O抗體材料與方法第9頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天第10頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、抗體的制備采用顆粒性抗原（傷寒O抗原）免疫家兔。周數(shù)日期操作第一周第一天（2015.9.7）耳緣靜脈注射傷寒O菌液0.1ml第二天（2015.9.8）耳緣靜脈注射傷寒O菌液0.2ml第三天（2015.9.9）耳緣靜脈注射傷寒O菌液0.2ml第四天（2015.9.10）耳緣靜脈注射傷寒O菌液0.5ml第二周第一天（2015.9.14）兩側(cè)背部皮下注射傷寒O菌液各0.5ml第三周第一天（2015.9.21）耳緣靜脈采血至少20ml第11頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、抗體的鑒定直接凝集試驗(yàn)3周后由已免疫兔的耳緣靜脈采血0.5ml，37℃，2500r/min離心30min，取血清。取潔凈試管10支，編號(hào)，將血清做1:10稀釋。混勻后，37℃孵育2~4小時(shí)，觀察結(jié)果。管號(hào)12345678910生理鹽水0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5稀釋血清0.50.50.50.50.50.50.50.50.50傷寒菌液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5終稀釋濃度1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120—棄第12頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、抗體的分離與純化①取分離好的免疫血清一份（5ml），加入一份生理鹽水（5ml）。②緩慢搖動(dòng)，加入兩份飽和硫酸銨溶液（10ml），室溫靜置1.5h。③2000r/min離心20min，吸棄上清。④用適量生理鹽水（1~2ml）溶解沉淀，放置于透析袋中，透析24h。⑤收集，標(biāo)記得到的傷寒沙門氏菌粗抗體，冰凍保存。第13頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、酶標(biāo)抗體的制備——過碘酸鈉法①取5mgHRP溶于0.5mlPH5.6HAC-NaAc緩沖液中，滴入NaIO4水溶液0.25ml，混勻，4℃作用30min。②再加入2.5%乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30min。③然后加入待分離純化的粗抗體1.5~2.0ml，用PH9.5的碳酸鹽緩沖液調(diào)整反應(yīng)液的PH至9.0左右，4℃過夜。④加入NaBH4溶液0.1ml，混勻，4℃作用2h，以PH7.4的PBS溶液溶解沉淀于透析袋中，4℃過夜。⑤次日收集。第14頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、ELISA預(yù)實(shí)驗(yàn)①包被抗原：傷寒抗原用包被液稀釋，每孔加入0.1ml，37℃作用4h（或4℃作用24h）。②洗滌：棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次30s，于吸水紙上充分拍干。③加入樣品：每孔加入按倍數(shù)稀釋好的酶標(biāo)抗體及待測(cè)抗體各0.1ml，混勻，放入37℃恒溫箱中孵育30min。④洗滌：棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次30s，于吸水紙上充分拍干。加入底物液：每孔加入底物液A液1滴，B液1滴，避光放置5~15min，觀察顏色變化。第15頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天1:11:51:251:1251:251:501:1001:200待測(cè)Ab酶標(biāo)AbELISA預(yù)實(shí)驗(yàn)第16頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、ELISA正式實(shí)驗(yàn)①包被抗原。②棄去ELISA板孔中的包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30s，在濾紙上拍干。③將各組原倍的待測(cè)血清與工作濃度的酶標(biāo)抗體，分別加入各孔中，每孔各0.1ml，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照，37℃孵育30min。④棄去孔中液體，用洗滌液洗滌3次，每次30s，在濾紙上拍干。⑤加底物顯色，每孔加入底物液A液1滴，B液1滴，避光放置5~15min，觀察顏色變化。第17頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一組待測(cè)Ab第二組待測(cè)Ab第三組待測(cè)Ab第四組待測(cè)Ab陰性對(duì)照1:100待測(cè)Ab酶標(biāo)AbELISA正式實(shí)驗(yàn)第18頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)傷寒O抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果第19頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、直接凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果21435678910實(shí)驗(yàn)結(jié)果肉眼觀察在第7管無凝集，直接凝集實(shí)驗(yàn)粗略估計(jì)傷寒O抗體的效價(jià)為1：1280。第20頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、酶標(biāo)抗體的制備與鑒定用過碘酸鈉法制備的酶標(biāo)抗體經(jīng)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法鑒定結(jié)果：陰陽色差最明顯為第三排，即最佳工作濃度為1:100，與第五孔顏色相差最大的味待測(cè)抗體原倍濃度。1:251:501:1001:2001:11:51:251:125陰性第21頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、ELISA競(jìng)爭(zhēng)法的目測(cè)結(jié)果ELISA競(jìng)爭(zhēng)法目測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：陰性對(duì)照孔出現(xiàn)藍(lán)色；每組均與陰性對(duì)照孔有鮮明對(duì)比，抗體制備均良好。第二組顏色最淺，抗體效價(jià)最高。由于第三組無待測(cè)血清，故無第三組結(jié)果124對(duì)照對(duì)照421第22頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)傷寒O抗體實(shí)驗(yàn)討論及分析第23頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、ELISA實(shí)驗(yàn)過程中注意事項(xiàng)①實(shí)驗(yàn)前半小時(shí)從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。選取精確移液管，恒溫孵育前振搖過程不可忽略。②操作過程應(yīng)準(zhǔn)確無誤，實(shí)驗(yàn)中稀釋液、酶標(biāo)液、質(zhì)控物、陰陽性對(duì)照和標(biāo)本的加入量一定要準(zhǔn)確，防止陽性對(duì)照和未知陽性標(biāo)本的濺灑造成假陽性結(jié)果，以及感染操作人員。第24頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天③孵育溫度和時(shí)間是夾心抗體（或抗原）形成、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)的必要因素，因此要嚴(yán)格控制。一般來說，溫度提高而抗原抗體結(jié)合的時(shí)間可縮短，否則時(shí)間延長(zhǎng)，所以在試驗(yàn)前要選擇最佳溫度與時(shí)間。④洗滌時(shí)間洗板時(shí)應(yīng)使洗液注滿反應(yīng)孔，調(diào)節(jié)洗板次數(shù)，保證洗板徹底。洗滌的干凈程度直接影響結(jié)果。洗板是ELISA

檢測(cè)的重要環(huán)節(jié)，應(yīng)嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，達(dá)到洗滌次數(shù)和間隔時(shí)間要求，從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確度。第25頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、ELISA實(shí)驗(yàn)過程中的顯色問題所有檢測(cè)孔均無色：原因可能為酶結(jié)合物或底物失效、底物漏加（錯(cuò)加）、陽性對(duì)照漏加或錯(cuò)加，其中以酶結(jié)合物失效和底物錯(cuò)加為常見。查找原因的方法是將酶結(jié)合物與底物直接混合，觀察有無顯色；如顯色則提示為陽性對(duì)照漏加或底物錯(cuò)加所致；若不顯色，用新酶結(jié)合物與底物混合，觀察有無顯色；不顯色則提示底物失效，顯色提示原用酶結(jié)合物失效。所有檢測(cè)孔均顯色：原因多為洗板不凈（孔內(nèi)殘留未結(jié)合的酶結(jié)合物）或顯色時(shí)間過長(zhǎng)。第26頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、ELISA法與肥達(dá)氏反應(yīng)法對(duì)診斷傷寒的比較分析

肥達(dá)氏診斷傷寒為經(jīng)典血清學(xué)檢驗(yàn)主要檢測(cè)血清中抗體，從感染到血中產(chǎn)生抗體要有一定時(shí)間，而且操作繁瑣，結(jié)果慢（過夜觀察）。傷寒桿菌抗原酶免ELISA其包被和酶標(biāo)記抗體均針對(duì)傷寒桿菌的單克隆抗體直接檢測(cè)血清中抗原特異性強(qiáng)、快速、操作簡(jiǎn)便、從加樣到判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅需45min。兩法通過χ2檢驗(yàn)P<0.05，具有顯著性差異，可作為早期快速輔助診斷傷寒的血清學(xué)方法。第27頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天近年來由于:①抗生素及皮質(zhì)激素的使用有抑制抗體滴度作用。②有些患者感染較輕產(chǎn)生抗體較少。③患者體弱免疫反映弱缺乏丙種球蛋白不能產(chǎn)生抗體。少數(shù)患者肥達(dá)氏凝集效價(jià)始終不高，且肥達(dá)氏反應(yīng)陽性反應(yīng)出現(xiàn)較晚。單憑肥達(dá)氏反映診斷傷寒有其局限性，易出現(xiàn)漏診，因此早期采用單克隆抗體檢測(cè)血清中抗原幫助臨床及早輔助診斷傷寒。第28頁(yè),共31頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、獲得高效價(jià)的傷寒O抗體的原因分析①在抗體的制備過程中，免疫動(dòng)物的選擇，設(shè)計(jì)有效的免疫程序均可影響制備的抗體質(zhì)量。