第一節(jié) 克隆載體課件

第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成份.Plasmid一詞由JoshuaLederberg于1952年提出。質(zhì)粒的命名:例:pBR322一、質(zhì)粒載體p代表質(zhì)粒;“BR”代表兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首,“322”是實(shí)驗(yàn)編號(hào).第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體已在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)質(zhì)粒的宿主范圍較窄，只能生存于親緣關(guān)系很近的少數(shù)細(xì)菌種類中。是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位已進(jìn)化出多種機(jī)制以維持其在細(xì)菌宿主中的穩(wěn)定的拷貝并將質(zhì)粒分子精確地分配給子代細(xì)胞。1.質(zhì)粒的特點(diǎn)：（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)第一節(jié)克隆載體其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄或多或少依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)。常常含有一些編碼對(duì)細(xì)菌宿主有利的基因。這些基因可賦予宿主迥然不同的特征，其中不少具有重要的醫(yī)學(xué)和商業(yè)價(jià)值。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括產(chǎn)生抗生素、大腸桿菌素、腸毒素、限制酶與修飾酶，以及降解復(fù)雜的有機(jī)化合物等。第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒通過(guò)合成長(zhǎng)效致死物和短效解毒劑得以在細(xì)菌中生存.第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒絕大多數(shù)是環(huán)形雙鏈的DNA但也存在有線形質(zhì)粒、RNA質(zhì)粒（酵母的殺傷質(zhì)粒）2.質(zhì)粒的生物學(xué)特征只能在在寄主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立增殖，隨寄主分裂而遺傳。自然界中，無(wú)論是真核生物還是原核生物細(xì)胞，甚至真菌的線粒體中都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在。質(zhì)粒DNA分子可以穩(wěn)定存在于染色體外，呈游離狀態(tài),有一些質(zhì)粒在一定條件下能可逆地整合到寄主染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制,稱為附加體第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體3.環(huán)形雙鏈DNA質(zhì)粒分子組成與構(gòu)型多數(shù)為雙鏈環(huán)狀DNA分子.分子量從不足2kb到100kb以上,多數(shù)為10kb左右.具有三種不同的構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)形DNA(cccDNA):兩條多核苷酸鏈均保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)。DNA呈超螺旋的SC構(gòu)型。開環(huán)DNA(ocDNA)：有一條保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口。即OC構(gòu)型。線性分子（lDNA)：經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割之后，雙鏈斷裂而形成。稱L構(gòu)型。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體4.作為克隆載體質(zhì)粒的條件適于作為基因克隆載體的所有質(zhì)粒DNA分子，都必須包括三種共同的組分：復(fù)制子選擇性標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)基因克隆載體還需要滿足具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)第一節(jié)克隆載體根據(jù)分子特性，革蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)?？煞譃閮煞N接合型又叫自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒具有自主復(fù)制所必須的遺傳信息之外，還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。

可以在不同細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。非接合型的質(zhì)粒不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。失去控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。不能自主轉(zhuǎn)移5、質(zhì)粒的類型第一節(jié)克隆載體F質(zhì)粒的tra區(qū)包含細(xì)菌接合所需的基因第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移與遷移.轉(zhuǎn)移一般指一個(gè)質(zhì)粒獨(dú)立地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞.遷移則指本身不能轉(zhuǎn)移,在另一個(gè)接合型質(zhì)粒存在下,從一個(gè)細(xì)胞移至另一種細(xì)胞.質(zhì)粒遷移的條件:①bom位點(diǎn)(colE1)nic位點(diǎn).②mob基因.結(jié)合動(dòng)員基因.編碼遷移蛋白,實(shí)質(zhì)是一種核酸酶,切割nic位點(diǎn).遷移作用(mobiligation):由共存接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的遷移過(guò)程.第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體從基因工程安全角度考慮，接合型質(zhì)粒不宜作為克隆載體。因?yàn)閺睦碚撋洗嬖谥l(fā)生使ＤＮＡ跨越生物種間遺傳屏障的潛在危險(xiǎn).而利用遷移作用可能將非接合型質(zhì)粒從一種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一種細(xì)胞,這種方法叫三親雜交法.一般將受體菌、供體菌及輔助轉(zhuǎn)移菌三者共培養(yǎng)過(guò)夜.在基因工程中得到大量的應(yīng)用.第一節(jié)克隆載體三親雜交法第一節(jié)克隆載體根據(jù)質(zhì)粒的性狀特征，可分為五種不同的類型：F(Fertility)質(zhì)粒:

Ｒ(Resistance)質(zhì)粒Col質(zhì)粒降解質(zhì)粒（Degradativeplasmids）致瘤質(zhì)粒（Virulenceplasmids）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒

第一節(jié)克隆載體根據(jù)質(zhì)粒的表現(xiàn)分為:定義：質(zhì)粒除了與控制本身復(fù)制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，有的質(zhì)粒還攜帶一些其他的基因，宿主細(xì)胞由于含有這樣的質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，這樣的質(zhì)粒稱為顯性質(zhì)粒。相反，即使宿主細(xì)胞含有某種質(zhì)粒，但無(wú)異樣性狀表露，這樣的質(zhì)粒稱為隱蔽質(zhì)粒。受檢測(cè)手段的限制，現(xiàn)定為隱蔽型的質(zhì)粒未必是真正的隱蔽質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒第一節(jié)克隆載體人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為:

(1)多拷貝質(zhì)粒

(2)測(cè)序質(zhì)粒

(3)整合質(zhì)粒

(4)穿梭質(zhì)粒

(5)表達(dá)質(zhì)粒

(6)探針質(zhì)粒

第一節(jié)克隆載體環(huán)狀質(zhì)粒的復(fù)制形式主要分theta(θ)及rollingcircle兩種。質(zhì)粒的復(fù)制子決定其拷貝數(shù)。復(fù)制子是一個(gè)遺傳單位，包括DNA復(fù)制起點(diǎn),相關(guān)的調(diào)控元件,復(fù)制終點(diǎn)。6、質(zhì)粒的復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)是一段特定的DNA片段，長(zhǎng)約幾百堿基對(duì)，常稱為oriV(originofvegetativereplication)；有時(shí)R-質(zhì)粒的復(fù)制原稱為oriR,其相關(guān)的順式作用調(diào)控元件中含有參與DNA合成起始的由質(zhì)?；蛩拗骶幋a的可擴(kuò)散因子的結(jié)合位點(diǎn)。定義：質(zhì)粒DNA中能自主復(fù)制并維持正?？截悢?shù)的一段最小的核酸序列單位。第一節(jié)克隆載體與一個(gè)起始點(diǎn)相連而沒有被終點(diǎn)隔斷的任何序列,都是作為復(fù)制子的一部分而被復(fù)制.起始點(diǎn)是一種順式作用位點(diǎn),只能作用于該位點(diǎn)所在的DNA分子.第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒的拷貝數(shù)定義:(1)通常定義:生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(LB培養(yǎng)基)每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中平均所含有的質(zhì)粒的拷貝數(shù).(2)特殊定義:在營(yíng)養(yǎng)富有余的培養(yǎng)基中,每個(gè)細(xì)胞當(dāng)中每條染色體所擁有的平均質(zhì)粒DNA分子數(shù).(3)<基因工程原理>中定義:在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的每個(gè)細(xì)胞,如果具有20個(gè)及以上的質(zhì)粒DNA分子,就叫高拷貝質(zhì)粒,如果低于20個(gè)則叫低拷貝質(zhì)粒.第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類：嚴(yán)緊型（stringentplasmid)每個(gè)寄主細(xì)胞中僅有１－３份的拷貝松弛型（relaxedplasmid)

每個(gè)寄主細(xì)胞中僅有１０－６０份的拷貝一般接合型的質(zhì)粒是嚴(yán)緊型，具有較高的分子量。而非接合型的質(zhì)粒是松馳型的，具有較低的分子量。例外，接合型的質(zhì)粒Ｒ6K分子量較小，為松馳型。質(zhì)粒中已鑒定的復(fù)制子已逾30個(gè)，但分子克隆中常用的幾乎都帶有一個(gè)來(lái)源于pMB1的復(fù)制子，可使每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中維持１５－２０個(gè)拷貝。第一節(jié)克隆載體即同一種質(zhì)粒在不同的寄主類型中可能屬于嚴(yán)緊型的也可能屬于松馳型的如ColE1-K30在大腸桿菌中屬于松弛型的,在奇異變形桿菌中是嚴(yán)緊型的.質(zhì)?？截悢?shù)還與寄主狀況有關(guān)。第一節(jié)克隆載體氯霉素?cái)U(kuò)增:

pMB1或ColEI類質(zhì)粒復(fù)制子的復(fù)制完全依靠宿主細(xì)胞提供的半衰期較長(zhǎng)的復(fù)制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的產(chǎn)物），因此在蛋白質(zhì)合成中斷時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)，帶有pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞可以積聚2000-3000個(gè)拷貝，這叫做氯霉素?cái)U(kuò)增。

第一節(jié)克隆載體另外兩種質(zhì)粒（psc101和p15A）的復(fù)制子的復(fù)制受質(zhì)粒上編碼的蛋白因子的正調(diào)節(jié)。氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成后，這類質(zhì)粒便不能持續(xù)復(fù)制。第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型抑制蛋白稀釋模型阻遏蛋白在低濃度時(shí)處于單體狀體，高濃度時(shí)處于多體狀態(tài)。只有多體狀態(tài)具有活性自體阻遏蛋白質(zhì)模型阻遏蛋白具有自體阻遏活性。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體7、質(zhì)粒的不相容性(不親和性)指在沒有選擇壓力下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠共存于同一個(gè)寄主細(xì)胞系中的現(xiàn)象。只有當(dāng)兩種質(zhì)粒在同一寄主細(xì)胞中都不受限制時(shí)，才能判斷親緣關(guān)系較近的質(zhì)粒，彼此之間互不相容，它們屬于同一種不親和群。大腸桿菌質(zhì)粒中至少已鑒別出３０種以上的不親和群。第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒不相容性現(xiàn)象與質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分離的調(diào)控有關(guān).攜帶相同復(fù)制子的不同質(zhì)粒屬于同一不相容組。帶有不可互換成分的復(fù)制子的質(zhì)粒則屬于不同的不相容組。大多數(shù)質(zhì)粒都會(huì)產(chǎn)生出一種控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，其濃度與質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。阻遏蛋白通過(guò)同其靶序列間的相互作用，使雙鏈ＤＮＡ中的一條斷裂從而導(dǎo)致質(zhì)粒ＤＮＡ復(fù)制的啟動(dòng)。并建立起一種調(diào)節(jié)質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)反饋環(huán)。當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)便被抑制了。反之，復(fù)制反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體8.質(zhì)粒ＤＮＡ的分離與純化(1)氯化銫密度梯度離心法(2)堿變性法第一節(jié)克隆載體（二）質(zhì)粒載體的構(gòu)建一般條件：選擇適合手頭工作目標(biāo)的質(zhì)粒載體選擇載體上的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)用合適的連接反應(yīng)條件選用最適合擴(kuò)增外源目的ＤＮＡ的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。具備篩選轉(zhuǎn)化子的方法和驗(yàn)證目的基因克隆的技術(shù)有時(shí)需要特殊的步驟以降低轉(zhuǎn)化菌落的背景。在每一階段都需要設(shè)置陰性及陽(yáng)性對(duì)照。第一節(jié)克隆載體構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的基本策略：(１)質(zhì)粒載體應(yīng)該能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制。作為質(zhì)粒的克隆載體，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。所以含有能在受體細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori)，最好是松弛型質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。(２)必須含有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，且這樣的克隆位點(diǎn)盡可能多。為了便于多種類型末端的DNA片段的克隆，質(zhì)?？寺≥d體中往往組裝一個(gè)含多種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的多克隆位點(diǎn)(MCS)連桿。第一節(jié)克隆載體(３)必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。(4)質(zhì)粒載體本身DNA分子應(yīng)盡可能小。(５)根據(jù)需要，使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種‘元件’，構(gòu)建成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。如在克隆位點(diǎn)上游組裝強(qiáng)的啟動(dòng)子，下游組裝相應(yīng)的終止子，就成為強(qiáng)表達(dá)質(zhì)?？寺≥d體?；蛘咴谫|(zhì)粒克隆載體的合適位置組入受體細(xì)胞染色體DNA的同源序列，成為基因整合平臺(tái)系統(tǒng)的供體質(zhì)?？寺≥d體。第一節(jié)克隆載體質(zhì)?？寺≥d體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過(guò)程應(yīng)遵循的原則：(１)選擇合適的復(fù)制起始位點(diǎn)。選用合適的出發(fā)質(zhì)粒。(２)組裝合適的選擇標(biāo)記基因。(３)增加或減少酶切位點(diǎn)。正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。組裝一個(gè)含有多種單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的多克隆位點(diǎn)(MCS)(4)縮短長(zhǎng)度。在能達(dá)到預(yù)期目的前提下，構(gòu)建過(guò)程應(yīng)力求簡(jiǎn)單。第一節(jié)克隆載體（三）常用的質(zhì)粒載體1、天然質(zhì)粒指那些沒有經(jīng)過(guò)以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有：ColE1,RSF2124和pSC101pSC101是第一個(gè)用于基因克隆的載體。它對(duì)于限制酶EcoR1只有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，而且在此克隆外源ＤＮＡ不影響它的復(fù)制功能，也不破壞其唯一的四環(huán)素抗性基因。其缺點(diǎn)是分子量較大，拷貝數(shù)少，且又只有一個(gè)抗菌素抗性基因，無(wú)法用插入失活技術(shù)選擇重組分子。第一節(jié)克隆載體ColE1也只有唯一的單切割位點(diǎn)，且可以根據(jù)大腸桿菌素的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，該質(zhì)?？截悢?shù)較高，但要用免疫篩選，在化學(xué)上相當(dāng)麻煩。RSF2124派生于ColE1,可用氨芐青霉素的抗性標(biāo)記進(jìn)行選擇。但仍然不是較好的載體。2、理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具備以下條件：１）具有復(fù)制位點(diǎn)２）具有抗菌素抗性基因。３）具有若干個(gè)限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)?？梢詽M足基因克隆的需要而且在其中插入適當(dāng)大小的外源ＤＮＡ片段之后，應(yīng)不影響質(zhì)粒ＤＮＡ的復(fù)制功能。４）具有較少的分子量和較高的拷貝數(shù)。第一節(jié)克隆載體3、選擇標(biāo)記質(zhì)粒載體含有遺傳標(biāo)記，它賦予帶有質(zhì)粒的細(xì)菌在選擇條件下以較強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在分子克隆中，這些標(biāo)記用來(lái)：選擇帶有質(zhì)粒的細(xì)菌克隆。防止負(fù)載質(zhì)粒或質(zhì)粒編碼蛋白質(zhì)所致的危險(xiǎn)因素，保持轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。因?yàn)楦呖截惖馁|(zhì)粒和大量的重組蛋白質(zhì)可嚴(yán)重妨礙轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至生存，為了防止質(zhì)粒被從細(xì)菌中清除，在培養(yǎng)基中一直加入合適的抗生素來(lái)維持選擇壓力是重要的。第一節(jié)克隆載體4、不同類型的質(zhì)粒載體：(１)高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體(２)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體目的基因產(chǎn)物含量高時(shí)對(duì)寄主細(xì)胞的正常新陳代謝具有擾亂作用時(shí)用。(３)失控的質(zhì)粒載體是一些低拷貝的質(zhì)粒，其復(fù)制控制是溫度敏感型的，也就是說(shuō)在不同的溫度下，拷貝數(shù)會(huì)有顯著的變化。

根據(jù)此原理，發(fā)展了失控的質(zhì)粒載體pBEU1和pBEU2，并成功地用來(lái)擴(kuò)增克隆基因及其編碼產(chǎn)物。第一節(jié)克隆載體質(zhì)粒ＤＮＡ可累積到細(xì)胞總ＤＮＡ的５０％(４)插入失活的質(zhì)粒載體該類質(zhì)粒至少含有兩個(gè)選擇記號(hào)，在與外源DNA的重組過(guò)程中，其中一個(gè)記號(hào)保持完整，用作選擇轉(zhuǎn)化子然后根據(jù)另一記號(hào)的插入失活效應(yīng)進(jìn)一步篩選出轉(zhuǎn)化子，此表明它帶有外源DNA.第一節(jié)克隆載體(５)正選擇的質(zhì)粒載體應(yīng)用只有突變體或重組體分子才能正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇?？梢灾苯舆x擇記號(hào)并給予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。質(zhì)粒pKN80帶有來(lái)自Mu噬菌體DNA的EcoR1-C片段，它編碼一種致死功能的kil基因。質(zhì)粒pKN80可以在Mu噬菌體溶源菌株中正常地復(fù)制，而對(duì)非溶源菌株是致死的。當(dāng)其Hpa1或HINd3位點(diǎn)插入外源DNA后，便會(huì)使這種致死功能失活。第一節(jié)克隆載體pUR2是另一種正選擇質(zhì)粒載體：在X-gal培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子菌落，只有含有pUR2質(zhì)粒的才能顯示出特有的藍(lán)色，而那些在EcoR1、BamH1或Hind3位點(diǎn)具外源ＤＮＡ插入的pUR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子菌落則呈現(xiàn)白色。第一節(jié)克隆載體(６)表達(dá)載體按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體特稱為表達(dá)載體。主要組成包括大腸桿菌的啟動(dòng)子及操縱子位點(diǎn)序列，多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。第一節(jié)克隆載體pBR322質(zhì)粒由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成：第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr)第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(tetr),第三部分是來(lái)源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1DNA復(fù)制起點(diǎn)。其優(yōu)點(diǎn)：分子量小具有兩個(gè)抗菌素抗性基因插入外源基因后變成ampsTetr

5、常用克隆質(zhì)粒載體介紹第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體tet第一節(jié)克隆載體pUC系列由加利福尼亞大學(xué)的科學(xué)家于1987年構(gòu)建.四個(gè)組成部分：來(lái)自于pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)氨芐青霉素抗性基因，但它的ＤＮＡ核苷酸序列發(fā)生變化不再含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶位點(diǎn)。大腸桿菌β－半乳糖苷酶基因(lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼α肽鏈的ＤＮＡ序列，此特稱為lacZ’基因，位于lacZ’基因中的靠近5‘端的一段多克隆位點(diǎn)區(qū)段。第一節(jié)克隆載體pUC18和pUC19載體第一節(jié)克隆載體其多克隆位點(diǎn)是一段特殊設(shè)計(jì)的具有許多不同的核酸內(nèi)切酶單一識(shí)別序列的短序列。

lacZ’基因編碼的α肽鏈?zhǔn)铅拢肴樘擒彰傅陌被┒说亩唐危チ苏０被┒说摩拢肴樘擒彰富蛲蛔凅w互補(bǔ)時(shí)，便會(huì)產(chǎn)出有功能活性的β－半乳糖苷酶分子。當(dāng)pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了染色體基因組存在此種β－半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞之后，便會(huì)出現(xiàn)具有功能活性的β－半乳糖酶的積累,稱為α

互補(bǔ)。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體β－半乳糖苷酶催化二糖乳糖水解為單糖：葡萄糖和半乳糖。該酶的活性可以用X-gal(５-溴-4-氫-吲哚-3-β-半乳糖苷）等顯色底物加以檢測(cè)，β－半乳糖苷酶可將X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘纳钏{(lán)色沉淀。第一節(jié)克隆載體由于在正常情況下，任何插入到多克隆位點(diǎn)的外源ＤＮＡ片段，都會(huì)阻斷α肽鏈的合成，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆是無(wú)色的，它可以與含有非重組質(zhì)粒載體的克隆形成的藍(lán)色背景明顯地區(qū)別。其優(yōu)點(diǎn)：具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。一步實(shí)現(xiàn)對(duì)重組子克隆的鑒定。第一節(jié)克隆載體TA載體耐熱聚合酶可在PCR產(chǎn)物的3’端加上一個(gè)非配對(duì)的脫氧腺嘌呤核苷(A)，根據(jù)此特點(diǎn)研制出線性TA質(zhì)粒載體，其5’端各帶有一個(gè)不配對(duì)的脫氧胸腺嘧啶(T)，用該載體可進(jìn)行PCR產(chǎn)物的直接克隆。

TA質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)普通質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建而成。其方法是將一般質(zhì)粒線性化，然后通過(guò)一些方法形成平末端，再在末端加上T就可得到。常見的有TaKaRa公司的pMD18-T第一節(jié)克隆載體6、穿梭質(zhì)粒載體具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體?？梢詳y帶外源基因在不同物種細(xì)胞之間，特別是真核和原核細(xì)胞之間往返穿梭，所以十分有用。目前已構(gòu)建了可在大腸桿菌與枯草桿菌、釀酒酵母和動(dòng)物體中進(jìn)行穿梭的載體。植物與大腸桿菌的穿梭載體還未發(fā)現(xiàn)。第一節(jié)克隆載體二噬菌體載體第一節(jié)克隆載體病毒核酸外殼蛋白包裝病毒顆粒第一節(jié)克隆載體病毒顆粒

實(shí)現(xiàn)病毒的增殖利用此性質(zhì)，可以構(gòu)建各類病毒載體。感染利用其體系宿主細(xì)胞DNA(RNA)復(fù)制和蛋白的合成第一節(jié)克隆載體病毒細(xì)菌病毒植物病毒動(dòng)物病毒稱噬菌體，有雙鏈的，單鏈的如花椰菜花葉病毒，煙草花葉病毒ＴＭＶ等如SV40,勞斯肉瘤病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒）腺病毒哺乳動(dòng)物和禽類中都有分布痘苗病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞漿中增殖桿狀病毒（感染昆蟲等無(wú)脊椎動(dòng)物）第一節(jié)克隆載體即細(xì)菌病毒的總稱英文：Bacteriophage簡(jiǎn)稱phage.該詞來(lái)源于希臘文phagos,意為吞噬。在結(jié)構(gòu)上沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，比原核和真核簡(jiǎn)單但比質(zhì)粒復(fù)雜，因?yàn)樗€編碼蛋白質(zhì)外殼?？梢钥寺『蛿U(kuò)增特定的DNA片段。是一種良好的基因克隆載體。噬菌體概念第一節(jié)克隆載體噬菌體的一般生物學(xué)功能1保護(hù)自已的核酸分子免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞2將其核酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞3將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，大量產(chǎn)生子代噬菌體。4使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代噬菌體顆粒第一節(jié)克隆載體噬菌體的結(jié)構(gòu)與核酸類型三種結(jié)構(gòu)：無(wú)尾部的二十面體型具尾部的二十面體型（多數(shù)）線狀體型。核酸類型：雙鏈環(huán)性DNA單鏈環(huán)形DNA單鏈線性DNA單鏈RNA不同種噬菌體核酸分子量相差較大。個(gè)別有堿基替代現(xiàn)象。如T4噬菌體中沒有C，由5-羥甲基胞嘧啶取代。SP01噬菌體中沒有T,為5-羥甲基尿嘧啶取代第一節(jié)克隆載體噬菌體的感染性噬菌體的感染效率高到令人生畏的程度。在瓊脂糖平板上形成噬菌斑。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體噬菌體的生命周期噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體上稱為溶源吸附、注入，整合、復(fù)制只能進(jìn)行溶菌周期的噬菌體稱為烈性噬菌體形成清晰的噬菌斑噬菌體的生命周期溶菌周期溶源周期吸附、注入，轉(zhuǎn)變、合成組裝釋放第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體溫和噬菌體，既能進(jìn)入溶菌生命周期，又能進(jìn)入溶源生命周期。形成混濁的噬菌斑.只有雙鏈DNA的噬菌體才有溶源周期。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體溶源性細(xì)菌：具有一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌叫溶源性細(xì)菌。如果有某些噬菌體基因缺失了，不能完成其溶菌周期，含有這種噬菌體的細(xì)菌叫做缺陷性的溶源性細(xì)菌。溶源化lysogenization：用溫和的噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細(xì)菌的過(guò)程。整合：如果噬菌體的DNA是被包容在寄主細(xì)菌染色體DNA之中，便叫做已整合的噬菌體DNA.這種噬菌體DNA組入細(xì)菌染色體DNA的過(guò)程，稱噬菌體DNA的整合或插入。以游離DNA分子形式存在的噬菌體DNA，叫做非整合的噬菌體DNA.一些常見概念第一節(jié)克隆載體原噬菌體：在溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的噬菌體DNA，叫做原噬菌體。如:λ，e14

一般當(dāng)這些質(zhì)粒或原噬菌體缺失或變異時(shí)也用“()”或“/”等加以區(qū)別表示。

第一節(jié)克隆載體另一種類型的溶源周期是以噬菌體P1為原型這種類型的基本特征是不存在噬菌體DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的環(huán)形的質(zhì)粒DNA分子。第一節(jié)克隆載體溶源性細(xì)菌有兩個(gè)重要特點(diǎn)第一，不能被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。溶源性細(xì)菌所具有的這種抗御同種噬菌體再感染的特性，叫做超感染免疫性。第二，經(jīng)過(guò)許多世代之后，溶源性的細(xì)菌便能夠開始進(jìn)入溶菌周期。這個(gè)過(guò)程叫做溶源性細(xì)菌的誘發(fā)。在誘發(fā)過(guò)程中，噬菌體基因組以單一DNA片段的形式從寄主染色體DNA上刪除下來(lái)。第一節(jié)克隆載體（一）λ噬菌體載體1與構(gòu)建載體相關(guān)的性質(zhì):λ噬菌體由DNA和外殼蛋白組成.分頭部和尾部.DNA集中在頭部.(1)λ噬菌體的DNA在噬菌體中是線狀DNA,全長(zhǎng)48502bp,左右兩端各有12個(gè)核苷酸組成的5’凸出粘性末端，稱為cos位點(diǎn)(cohesiveendsite)．(2)λ噬菌體基因組有基因50個(gè)，各司其職，功能相近的聚集成簇．有些區(qū)域?qū)Ζ耸删w生長(zhǎng)必須，有些區(qū)域?yàn)槠渖L(zhǎng)非必需的．第一節(jié)克隆載體λ－DNA的結(jié)構(gòu)第一節(jié)克隆載體λDNA被外殼蛋白包裝之前，在cos位點(diǎn)切開，這樣的基因圖便是線性的．(3)具有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn).有56種之多.(4)λ噬菌體具有溶源和溶菌兩條生長(zhǎng)途徑．第一節(jié)克隆載體2選用λ噬菌體作為構(gòu)建克隆載體材料的依據(jù)λ噬菌體是一種溫和的噬菌體．對(duì)大腸桿菌的感染性強(qiáng),可以原噬菌體形式長(zhǎng)期潛伏在溶原細(xì)胞中,易于保存.λ噬菌體能承載比較大的外源DNA片段．

在其DNA分子上有多種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)，便于多種外源DNA片段的克?。谝还?jié)克隆載體3野生的λ噬菌體DNA的改造多余限制位點(diǎn)的刪除非必需區(qū)段的去除．第一節(jié)克隆載體ABCDEFABD+E+F

**第一節(jié)克隆載體酶切位點(diǎn)的處理:確定一種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列用作克隆位點(diǎn)，并抹去這種酶的其它多余識(shí)別位點(diǎn)．對(duì)于非必需區(qū)的切割位點(diǎn)可直接切去．對(duì)于必需區(qū)的切割位點(diǎn)可用點(diǎn)突變或甲基化酶處理等方法使必須區(qū)內(nèi)的這種酶的識(shí)別序列失效．4構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的基本技術(shù)路線第一節(jié)克隆載體標(biāo)記基因:在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)組入選擇標(biāo)記基因．建立重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng)．包裝蛋白由D蛋白和E蛋白組成．為了制備用于體外包裝重組λDNA的各種蛋白質(zhì)，篩選到了D基因和E基因分別缺失的λ噬菌體突變株D－和E－．兩種噬菌體都不能包裝成噬菌體顆粒．第一節(jié)克隆載體BHB2688是E基因缺失的λ溶源菌，BHB2690是D基因缺失的λ溶源菌．經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后可提取制備用于包裝的全部蛋白質(zhì)，成為λDNA分子體外包裝系統(tǒng)．第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體λ噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納DNA的能力是有一定限度的。上限不得超過(guò)其正常野生型DNA總量的5％左右，而低限又不得少于正常野生型DNA總量的75％。按野生型λDNA分子長(zhǎng)度為48kb計(jì)算，即λ噬菌體只容許包裝<51kb而>34.6kb的DNA片段。

編碼必要基因的DNA區(qū)段占28kb，因此λ載體克隆外源DNA的理論極限值應(yīng)是最大23kb,最小6.6Kb。

第一節(jié)克隆載體5λ噬菌體載體的主要類型(1)插入型載體外源DNA克隆到插入型的λ載體分子上，會(huì)使噬菌體的某些生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應(yīng)。第一節(jié)克隆載體Ａ免疫功能失活的插入型載體在其免疫區(qū)帶有一兩種核酸內(nèi)切酶的單切割位點(diǎn)。外源片段插入到該位點(diǎn)之后,合成活性阻遏物的功能遭受破壞，不能進(jìn)入溶源周期。凡帶有外源DNA插入的λ重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本噬菌體就會(huì)形成混濁的噬菌斑。這種形態(tài)上的差異，為分離重組體分子提供了方便的標(biāo)志。根據(jù)插入效應(yīng)的特異性，又可分為以下兩種第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體Ｂβ-半乳糖苷酶失活的插入型載體可以通過(guò)噬菌斑的顏色判斷有無(wú)外源基因的插入第一節(jié)克隆載體(2)替換型載體替換型載體又叫取代型載體，在其中央部分有一個(gè)可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體。在構(gòu)建此類載體時(shí)，安排在中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因此當(dāng)外源DNA插入時(shí)，一對(duì)克隆位點(diǎn)之間的DNA片段便會(huì)被置換掉，從而有效地提高克隆外源DNA的能力。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體λ噬菌體載體的選擇:

并沒有一種可以適于克隆所有DNA片段的入噬菌體載體。具體選擇時(shí)，應(yīng)該考慮以下幾點(diǎn)：①如果要從染色體DNA來(lái)構(gòu)建基因組文庫(kù)，那么可以選擇置換型的λ噬菌體載體，因其可容納DNA較大片段。②如果要從染色體DNA中分離某一基因，而又不需構(gòu)建完整基因組文庫(kù)，那么選擇的自由度就較大。③如果需要構(gòu)建cDNA文庫(kù)，那么常選λgt10或λgt11插入型載體；如果考慮選用抗體探針，那么常選λgt11這一有效表達(dá)載體。第一節(jié)克隆載體（二）M13噬菌體為了測(cè)序的需要，可應(yīng)用絲狀噬菌體產(chǎn)生單鏈DNA第一節(jié)克隆載體M13為絲狀噬菌體家族成員，含有長(zhǎng)度約為6400堿基的單鏈DNA基因組。M13是一種絲狀病毒顆粒，它只能感染雄性細(xì)胞菌，并不裂解宿主，相反，它甚至要從繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂的感染細(xì)胞中釋放出來(lái)。感染時(shí)，單鏈?zhǔn)删w基因組轉(zhuǎn)變成稱為復(fù)制型（RF)的雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，它以凱恩斯復(fù)制(θ型復(fù)制

)。然后，RF分子以滾環(huán)方式產(chǎn)生單鏈正鏈子代DNA分子，RF分子也作為M13噬菌體11個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的模板。三個(gè)病毒基因產(chǎn)物（pⅡ,p

ⅤpⅩ）用于病毒DNA的復(fù)制，五個(gè)病毒基因編碼跨膜蛋白（pⅢ,pⅥ,pⅦ,pⅧ,pⅨ)構(gòu)成外殼。子代病毒顆粒是通過(guò)一個(gè)協(xié)同過(guò)程組裝而成的。衣殼蛋白突入細(xì)菌細(xì)胞膜，并圍繞正鏈子代DNA裝配，這一蛋白－DNA復(fù)合物以絲狀病毒顆粒形式分泌出細(xì)胞。

第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體所有M13噬菌體基因組的順式作用元件均集中在一個(gè)508bp的基因間區(qū)，這一區(qū)域已被克隆到質(zhì)粒上。當(dāng)轉(zhuǎn)化了這種質(zhì)粒的細(xì)菌被野生型或輔助M13噬菌體感染，單鏈形式的質(zhì)粒DNA就被包裝入子代噬菌體。由于其基因組不穩(wěn)定，重組絲狀噬菌體一般不用于外源DNA片段的克隆和長(zhǎng)期擴(kuò)增，而用于制備已克隆于其他質(zhì)粒上的DNA片段的單鏈拷貝。第一節(jié)克隆載體絲狀噬菌體比其它載體優(yōu)越的地方：?jiǎn)捂淒NA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介這種復(fù)制形式（RF)可以如質(zhì)粒DNA一樣在體外進(jìn)行操作。RF和ssDNA都能夠轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌寄主細(xì)胞，并依據(jù)所采用的實(shí)驗(yàn)方法而定，或產(chǎn)生出噬菌斑，或形成浸染的菌落。單鏈DNA噬菌體顆粒的大小是受其DNA多寡制約的。因此對(duì)它們來(lái)說(shuō)，并不存在包裝限制問題。應(yīng)用這類單鏈DNA噬菌體，可以容易地檢測(cè)出外源DNA的插入方向。可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA片段的單鏈DNA分子。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體M13噬菌體載體以野生型M13噬菌體為原始載體，進(jìn)行以下改造：在IS區(qū)加入選擇性標(biāo)記基因，組裝合適的多克隆位點(diǎn)第一節(jié)克隆載體噬菌體展示載體

在絲狀噬菌體顆粒一端的表面，存在3-5個(gè)拷貝的基因Ⅲ編碼的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)對(duì)于噬菌體顆粒的正確組裝，及其對(duì)大腸桿菌雄性細(xì)胞F性須的吸附過(guò)程，均具有重要功能。當(dāng)外源DNA插入在噬菌體的基因Ⅲ編碼序列中時(shí)，在兩者讀碼結(jié)構(gòu)保持一致的情況下，就會(huì)產(chǎn)生出由克隆基因與基因Ⅲ聯(lián)合編碼的融合蛋白質(zhì)。因此可利用此特性構(gòu)建噬菌體展示載體。第一節(jié)克隆載體構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)的方法：將隨機(jī)的多肽DNA彈夾插入在基因Ⅲ的編碼序列中，使在噬菌體顆粒的表面展現(xiàn)出各種不同的蛋白質(zhì)或多肽此即是通常所說(shuō)的隨機(jī)多肽文庫(kù)。然后通過(guò)親和層析處理，將所要分離的某種特定的目標(biāo)噬菌體，例如展示具有抗體結(jié)合特性的多肽的噬菌體顆粒分離出來(lái)。經(jīng)過(guò)如此多次的層析和增殖后，所得的噬菌體制劑便可用于進(jìn)一步富集具有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體第一節(jié)克隆載體（一）、黏粒(Cosmid)載體λ噬菌體載體克隆外源DNA的能力有限理論上雖可達(dá)23kb，但事實(shí)上較為有效的克隆范圍僅為15kb左右。一般情況下可以滿足一個(gè)完整基因及其兩端的側(cè)翼序列克隆的要求。但有的基因分子大小比正常預(yù)期的要大很多，有的可達(dá)35-40kb或更大。有時(shí)，還需要能夠同時(shí)克隆兩個(gè)連鎖的基因。所以還需要更大的載體。第一節(jié)克隆載體1978年，Collins及B.Hohn等人發(fā)展出的柯斯質(zhì)粒載體(cosmidvectors)可以滿足這一要求。Cosmid：是英文cossite-carryingplasmid縮寫而成的。其原意是指帶有粘性末端位點(diǎn)（cos）的質(zhì)粒。即一類由人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。又叫柯斯質(zhì)粒。第一節(jié)克隆載體Cos位點(diǎn)：λ噬菌體線性雙鏈DNA分子的兩端，各有一條由12個(gè)核苷酸組成的彼此完全互補(bǔ)的5‘單鏈突出序列，即通常所說(shuō)的粘性末端。注入到感染寄主細(xì)胞內(nèi)的λ噬菌體的線性DNA分子，會(huì)迅速地通過(guò)粘性末端之間的互補(bǔ)作用，形成環(huán)形雙鏈DNA分子。隨后，在DNA連接酶的作用下，將相鄰的5‘-P,3’-OH連接起來(lái)。并進(jìn)一步超盤旋化。這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點(diǎn)。第一節(jié)克隆載體柯斯質(zhì)粒λDNA片段和pBR322質(zhì)粒DNA聯(lián)合組成的。用λ噬菌體基因組之cro-rⅡ

的Bg1Ⅱ

限制片段，取代pBR322質(zhì)粒DNA的位于1459-1666bp之間的Sau3A片段，產(chǎn)生出具有BglⅡ

單切割位點(diǎn)的重組體分子，然后通過(guò)這個(gè)位點(diǎn)，將帶有cos序列，長(zhǎng)度為1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入進(jìn)去，于是得到了pHC79柯斯質(zhì)粒。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體1.柯斯質(zhì)粒的特點(diǎn)除了cos位點(diǎn)外，在其兩側(cè)還具有與噬菌體包裝有關(guān)的DNA序列，而質(zhì)粒DNA部分則是一個(gè)完整的復(fù)制子，編碼一個(gè)復(fù)制位點(diǎn)和兩個(gè)抗菌素抗性基因ampr,tetr.因而具有兩個(gè)載體的優(yōu)點(diǎn)。第一節(jié)克隆載體(１)具有λ噬菌體的特性?？滤官|(zhì)粒載體在克隆了合適長(zhǎng)度的外源DNA，并在體外被包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)λ噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。然后便按照噬菌體同樣的方式環(huán)化。由于不具有噬菌體的全部必要基因，因而不能通過(guò)溶菌周期，無(wú)法形成子代噬菌體顆粒。第一節(jié)克隆載體(２)具有質(zhì)粒載體的特性。

柯斯質(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，因此在寄主細(xì)胞內(nèi)能夠像質(zhì)粒DNA一樣復(fù)制，并且在氯霉素作用下，同樣也會(huì)獲得進(jìn)一步的擴(kuò)增。且具有抗菌素標(biāo)記，可供作重組體分子表型選擇，有的還帶有插入位點(diǎn)。(３)具有高容量的克隆能力。由于其載體分子僅具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一兩個(gè)選擇標(biāo)記和Cos位點(diǎn)等三個(gè)組成部分，其分子量較少，一般只有5-7kb左右。其克隆極限可達(dá)45kb，比噬菌體和質(zhì)粒載體的最大克隆能力都要大很多。由于包裝限制的緣故，柯斯質(zhì)粒載體的克隆能力還有一個(gè)最低極限制值。如果載體分子為5Kb,那么插入片段最少得有30kb長(zhǎng)。才能夠裝形成具有感染能力的噬菌體顆粒。因此柯斯質(zhì)粒載體用于克隆大片段的DNA分子。第一節(jié)克隆載體(４)具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。一旦柯斯載體與一種帶有同源序列的質(zhì)粒載體共存于同一個(gè)寄主細(xì)胞，它們之間便會(huì)形成共合體。如果讓柯斯質(zhì)粒與質(zhì)粒各自具有一個(gè)互不相同的抗藥性標(biāo)記及相容性的復(fù)制起點(diǎn)，那么當(dāng)它們轉(zhuǎn)化到同一寄主細(xì)胞之后，便可容易地篩選出含有兩個(gè)不同選擇標(biāo)記的共合體分子。第一節(jié)克隆載體2、柯斯克隆

應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù)，叫做柯斯克隆。理論依據(jù):

在線性λ噬菌體DNA分子的每一端，都具有一段彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列，即所謂的粘性末端，在λ噬菌體的正常生命周期中，會(huì)產(chǎn)生出由數(shù)百個(gè)λ噬菌體DNA分子拷貝組成的多連體分子。在此分子中，前后兩個(gè)基因組之間都是通過(guò)cos位點(diǎn)連接起來(lái)的。λ噬菌體具有的一種位點(diǎn)特異的切割體系，叫做末端酶或Ter體系能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的cos位點(diǎn)，將多連體分子切割成λ單位長(zhǎng)度的片段，并將它們包裝到λ噬菌體頭部中去，因此，對(duì)于λ噬菌體DNA的包裝作用，cos位點(diǎn)和Ter體系是兩項(xiàng)必須具備的條件。第一節(jié)克隆載體λDNA分子具有兩個(gè)cos位點(diǎn)，而且它們之間的距離保持在38-54kb的條件下，Ter體系才能對(duì)它們發(fā)生作用。柯斯質(zhì)粒是不能作為體外包裝的底物的。因?yàn)樗幕蚪M只具有一個(gè)cos位點(diǎn)。如果用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶處理柯斯質(zhì)粒所形成的片段仍不能被包裝。因?yàn)楸M管經(jīng)過(guò)退火的片段可互相連接成具有兩個(gè)cos位點(diǎn)的二聚體，但由于它們之間相距太近，只有幾個(gè)kb,因此Ter體系還是對(duì)它不能發(fā)生作用。第一節(jié)克隆載體

只有將經(jīng)過(guò)限制酶切割之后的柯斯質(zhì)粒線性分子同外源真核生物基因組同樣的酶切片段混合，并退火，由此形成的重組體DNA分子群體中，便會(huì)有一部分是具有兩個(gè)Cos位點(diǎn)的線性二聚體。在這兩個(gè)cos位點(diǎn)之間由于插入了足夠長(zhǎng)度的外源DNA，它們的距離已符合于ter體系的要求。由于包裝限制問題，只有當(dāng)柯斯質(zhì)粒含有適當(dāng)數(shù)量的外源DNA分子插入的情況下，才會(huì)發(fā)生包裝作用。第一節(jié)克隆載體柯斯克隆的一般過(guò)程：外源基因組的消化柯斯質(zhì)粒的線性化及與外源DNA分子進(jìn)行體外連接反應(yīng)。包裝第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體3、柯斯克隆的技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要有兩個(gè)方面：第一由于柯斯載體兼具了質(zhì)粒和λ噬菌體兩方面的特性提高了克隆外源DNA片段的能力，可達(dá)45kb左右，因此對(duì)于構(gòu)建真核生物基因文庫(kù)是種特別有用的克隆載體。第二應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作克隆載體，所形成的非重組體的克隆本底比較低，即便不使用插入失活或堿性磷酸酶對(duì)線性化的柯斯質(zhì)粒DNA作預(yù)處理，其結(jié)果亦是如此。從而提高了篩選具外源DNA的重組體質(zhì)粒的幾率。第一節(jié)克隆載體（二）噬菌粒載體第一節(jié)克隆載體

問題的提出

M13可方便地用來(lái)制備克隆基因的單鏈DNA。所以在基因工程研究中很有用。但插入的片段遺傳穩(wěn)定性下降，且隨片段分子量的增加，其穩(wěn)定性降低的程度也越嚴(yán)重。所以其克隆外源DNA的實(shí)際能力十分有限，一般情況下，最大克隆能力只有1500bp.使其中真核基因克隆中的實(shí)用價(jià)值大大折扣。為了解決此問題，已經(jīng)發(fā)展出一類由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列，稱為噬菌粒(phasmid)。第一節(jié)克隆載體

噬菌粒載體的特點(diǎn)噬菌粒載體的分子量一般都比M13載體的小，約為3000bp，易于體外操作，可得到長(zhǎng)達(dá)10kb的外源DNA的單鏈序列。由于具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)因此在大腸桿菌寄主細(xì)胞中，可以按正常的雙鏈質(zhì)粒分子形式復(fù)制，形成的雙鏈DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)。具有常規(guī)的質(zhì)粒特性。當(dāng)存在著輔助噬菌體的情況下，在噬菌體基因Ⅱ

蛋白質(zhì)的影響下，噬菌粒的復(fù)制方式發(fā)生改變，又可如同M13載體一樣按滾環(huán)模型復(fù)制產(chǎn)生單鏈的DNA，并在包裝噬菌體顆粒之后被擠壓出寄主細(xì)胞。應(yīng)用噬菌?？芍苯舆M(jìn)行克隆DNA片段的序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的亞克隆步聚。第一節(jié)克隆載體

與M13相比，噬菌粒載體具有分子量小、克隆能力大能穩(wěn)定遺傳以及可用來(lái)制備單鏈或雙鏈DNA等諸多優(yōu)點(diǎn)。第一節(jié)克隆載體pUC118,pUC119噬菌粒載體

是一對(duì)分別由pUC18,pUC19質(zhì)粒與野生型M13噬菌體的基因間隔區(qū)重組而成的噬菌粒載體。除了多克隆位點(diǎn)區(qū)的序列取向彼此相反而外，兩者的分子結(jié)構(gòu)完全一樣。如果有某一種特定的外源基因被插入在這一對(duì)噬菌體多克隆位點(diǎn)區(qū)的同一種限制位點(diǎn)上，那么所形成的重組載體中的一個(gè)將轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA,而另一重組載體則轉(zhuǎn)錄克隆基因的負(fù)鏈。第一節(jié)克隆載體第一節(jié)克隆載體四、人工染色體載體第一節(jié)克隆載體染色體結(jié)構(gòu)真核生物的染色體在形態(tài)上具有共同的特征：線狀、中間有著絲粒把染色體分成兩臂，兩臂末端各有一個(gè)端粒，在染色體上有數(shù)目不等的復(fù)制起始點(diǎn)。著絲粒、端粒和復(fù)制起始點(diǎn)是真核生物染色體的三個(gè)最基本的組成元件。著絲粒DNA稱CENDNA復(fù)制起始點(diǎn)DNA為自主復(fù)制序列(ARS)第一節(jié)克隆載體人工染色體克隆載體實(shí)際上是一種穿