藥物分離純化技術制備色譜分離技術

藥物分離純化技術制備色譜分離技術制備色譜技術制備薄層色譜法設備簡單，操作方便、分離快速、靈敏度及分辨率高；切割譜帶更加方便；自動化：自動點樣儀、自動程序展開儀、薄層掃描儀、多種強制流動技術、多種聯(lián)用技術如傅立葉變換紅外、拉曼、質譜等。第2頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備色譜技術常規(guī)制備薄層色譜PTLC薄層板制備為了增大上樣量，增加了吸附劑用量。固定相：硅膠、氧化鋁、纖維素、C2、C18等反相健合硅膠支撐：玻璃板或鋁箔平均25m,5~40m硅膠H、硅膠G、硅膠F254、硅膠F365、硅膠P第3頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備色譜技術硅膠粒徑范圍影響：越細越均勻，分離度越高，但？粒徑范圍寬，分離效率低，怎么辦？------薄層厚度的漸變薄層厚度從底部到前沿逐漸增加，這樣展開劑的速度逐漸變慢，樣品譜帶在展開過程中逐步富集，可保持較窄的譜帶。第4頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備色譜技術薄層板的制作方法：常采用濕法：平鋪法和涂鋪法。混合平鋪涂鋪器自然干燥一夜105-120℃活化黏合劑硅膠煅石膏或羧甲基纖維素鈉水溶液第5頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備色譜技術薄層色譜條件選擇操作參數(shù)流速展開模式分離距離樣品量流動相選擇性溶劑強度黏度展開缸類型薄層板和展開缸空腔體積比值溫度蒸氣相固定相薄層厚度顆粒大小質量開放型操作不連續(xù)第6頁,共50頁，2024年2月25日，星期天常用溶劑(1)電子接受體溶劑：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；(2)質子給體溶劑：異丙醇、正丁醇、甲醇、無水乙醇等；(3)強質子給體溶劑：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等；(4)質子受體溶劑：三乙胺、乙醚等；(5)偶極作用溶劑：二氯甲烷(6)惰性溶劑：環(huán)己烷、正己烷等。制備色譜技術第7頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備色譜技術上樣和展開先用甲醇展開一次，除去可能存在的雜質；低揮發(fā)性溶劑溶解樣品會引起樣品帶變寬，因此選用揮發(fā)性溶劑（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶劑極性盡可能小。樣品濃度以能均勻分布于吸附劑表面不析出為宜，5-10%；帶狀點樣，盡可能窄；如點樣帶太寬，可用高極性溶劑展開至點樣帶上方2cm處進行濃縮，然后將鋪板干燥后再用展開劑展開。？第8頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備色譜技術樣品檢測有色物質直接觀察斑點；熒光物質在紫外燈下觀察；無色無熒光可在熒光板分離，紫外光下顯示暗斑；噴顯色劑，結構穩(wěn)定且不易氧化物質可以用碘蒸氣顯色，可逆；第9頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備色譜技術常用顯色劑：硫酸：硫酸:乙醇(1:1)溶液，噴后110℃烤5分鐘，不同有機物顯不同的顏色；0.05%高錳酸鉀溶液，還原性物質顯黃色，背景淡紅色；酸性重鉻酸鉀：5%重鉻酸鉀濃硫酸溶液，必要時150℃烤薄層；5%磷鉬酸乙醇溶液：噴后120℃烤，還原性物質顯藍色，再用氨氣熏，背景無色。第10頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備色譜技術樣品收集：切割：刮刀或與真空相連的管型刮離器；回收：極性盡可能低的溶劑洗脫，通常1g吸附劑用5mL溶劑，丙酮和氯仿常用，甲醇因溶解硅膠及其中含有的雜質不常用。4型玻璃沙芯漏斗過濾洗脫液，再用0.2-0.45m濾膜過濾。硅膠的黏合劑以及熒光指示劑等雜質，可用SephadexLH-20過濾純化。第11頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備色譜技術常規(guī)制備TLC速度慢，效率低，如何提高？加壓離心第12頁,共50頁，2024年2月25日，星期天加壓制備OPLC

彈性氣墊，外壓使沒有氣相存在，展開劑強制流動，展開速度加快制備色譜技術更細的固定相顆粒、更長的薄層板第13頁,共50頁，2024年2月25日，星期天離心制備CTLC

離心力加速流動相，分離速度快，操作簡單，占用空間小，使用溶劑少，可反復使用，可進行梯度洗脫，進樣量大，一次分離量0.1-0.2g.制備色譜技術第14頁,共50頁，2024年2月25日，星期天不同制備TLC方法的比較

制備色譜技術參數(shù)PTLCOPLCCTLC流動相遷移方法毛細作用加壓離心薄層厚度/mm0.5-20.5-21-4分離長度/cm181812分離模式線形線形環(huán)形組分分開方法離線在線在線典型上樣量/mg50-15050-30050-500分離譜帶數(shù)2-52-72-12第15頁,共50頁，2024年2月25日，星期天常規(guī)柱色譜技術：可使用較大直徑的色譜柱，更多的固定相，因此樣品量可以更大；分離速度較慢，樣品可能被不可逆吸附；不適合小顆粒的吸附劑？改進方法：減壓、加壓等制備色譜技術第16頁,共50頁，2024年2月25日，星期天柱色譜常用固定相(1)硅膠：官能團和分子的幾何形狀，對異構體的分離選擇性遠大于其他色譜方法。烷基<鹵素（F<Cl<Br<I）<醚<硝基混合物<腈<叔胺<酯<酮<醛<醇<酚<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸摻雜硅膠：如硝酸銀處理，對不飽和烴有好的分離效果。1%-10%的添加劑的水或丙酮溶液與硅膠混合，稍干后110℃干燥即可。制備色譜技術第17頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(2)健合硅膠制備色譜技術第18頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(3)氧化鋁堿性氧化鋁：其水提取液為pH9-10，常用于碳氫化合物的分離，從碳氫化合物中除去含氧化合物。中性氧化鋁：5%乙酸處理，水提取液為pH7.5，適用于醛、酮、醌、某些苷以及酸堿溶液中不穩(wěn)定成分如酯、內酯等化合物的分離。酸性氧化鋁：2MHCl溶液處理，水提取液pH為4-4.5，適合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分離。制備色譜技術第19頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(4)活性炭：分離水溶性物質吸附作用在水溶液中最強，用有機溶劑洗脫。對芳香族的吸附力大于脂肪族；對大分子吸附力大于小分子；對極性基團多的分子吸附力大于少的；易吸附氣體“中毒”，用前需活化，120℃加熱4-5小時；制備色譜技術第20頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(5)聚酰胺：又稱為錦綸或尼龍同時具有良好的親水性和親脂性；可溶于濃鹽酸、甲酸，不溶于常見溶劑；含有豐富的酰胺基，與酚類、黃酮類、醌類、脂肪酸類物質形成氫鍵；還含有非極性脂肪鏈，雙重保留機理；制備色譜技術第21頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(6)大孔吸附樹脂：苯乙烯和丙烯酸酯骨架結構決定樹脂的極性：

非極性、弱極性----苯乙烯或二乙烯基苯聚合而成；

中等極性----甲基丙烯酸酯；

極性、強極性----含氧硫基、酰胺基、氮氧等基團；吸附和分子篩分離相結合：網(wǎng)狀結構，大比表面積制備色譜技術第22頁,共50頁，2024年2月25日，星期天大孔吸附樹脂使用：用前需預處理除去雜質：

回流法、水蒸氣蒸餾法；

滲漉法----乙醇丙酮等有機溶劑濕法裝柱，浸泡12h后洗脫2-3倍柱體積，再浸泡3-5h后洗脫2-3倍柱體積，重復直到流出的有機溶劑與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象為止，用大量蒸餾水洗去乙醇即可。如單獨采用有機溶劑洗不盡雜質，則可用酸堿處理，2-5%鹽酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脫，水洗。制備色譜技術第23頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(7)凝膠：交聯(lián)葡聚糖Sephadex----葡聚糖和3氯-1，2環(huán)氧丙烷以醚健交聯(lián)形成的三維空間多孔凝膠

交聯(lián)度大，孔小，吸水膨脹小

型號以其吸水量的10倍命名，如SephadexG-25表示每克干膠吸水2.5g；

引入羥丙基，為LH型烷基化葡聚糖凝膠，不僅可分離水溶性成分，還可分離親脂性成分，常用于最后的純化，除去微量固體、鹽類和其他外來雜質，純化過程中樣品損失極小。制備色譜技術第24頁,共50頁，2024年2月25日，星期天甲基丙烯酸酯共聚物ToyopearlHW系列----乙二醇、甲基丙烯酸縮水甘油酯和二甲基丙烯酸季戊四醇酯共聚而成穩(wěn)定性好，pH2-12；機械強度高，常用于加壓柱色譜；在蛋白質、酶、核酸、多糖的純化處理中應用較多；

ToyopearlHW40可用于小分子物質的分離純化，與SephadexLH20有相似的效果。制備色譜技術第25頁,共50頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖凝膠----D-半乳糖和3,6位脫水的L-半乳糖連接構成的多糖鏈，100℃時呈液態(tài)，45℃下互相連接成線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，再凝聚成瓊脂糖凝膠。與1,3-二溴異丙醇在強堿條件下反應，生成CL型交聯(lián)瓊脂糖，穩(wěn)定性更好，pH3-14（一般的瓊脂糖pH4.5-9.0）；機械強度和篩孔的穩(wěn)定性由于葡聚糖，流速較快。制備色譜技術第26頁,共50頁，2024年2月25日，星期天凝膠柱使用一般注意事項：(1)交聯(lián)度決定凝膠孔徑大小，孔徑決定排除下限；(2)顆粒粗細很重要，細顆粒分離效果好，但流速慢，宜采用大直徑柱，粗顆粒流速快，但分離效果差，宜采用小直徑柱；(3)干膠用量需考慮溶漲度制備色譜技術第27頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(4)干膠使用前需在5-10倍的去離子水中充分溶漲，傾倒掉小顆粒，減壓排氣。也可用煮沸的方法溶漲，速度快，可滅菌排氣。(5)填充均勻，無空隙和氣泡；(6)多次使用后，床體積減小或污染，可再生處理，即用水逆向反復沖洗，再用緩沖溶液平衡。制備色譜技術第28頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(8)離子交換樹脂----陽離子交換和陰離子交換價態(tài)高，交換能力強；價態(tài)相同，原子序數(shù)大能力強；兩性物質的交換取決于物化性質和特定條件下的離子狀態(tài)；制備色譜技術第29頁,共50頁，2024年2月25日，星期天離子交換樹脂的一般原則----

選擇取決于被分離物質的電荷性質；強的使用范圍寬，弱的分離生物大分子時，活性不容易失去；反離子，為了提高交換容量，選擇結合力小的反離子；親疏水性選擇，一般分離大分子時，選擇疏水性的基質，活性易保持；制備色譜技術第30頁,共50頁，2024年2月25日，星期天常規(guī)柱色譜的操作(1)裝柱：干法和濕法；(2)上樣：液體上樣和拌樣上樣，樣品帶盡可能窄；(3)洗脫：始終保持洗脫劑液面高于柱床表面，可梯度洗脫；(4)流分收集：常采用固定體積收集法，結合TLC檢驗；(5)樣品回收：減壓蒸餾或重結晶制備色譜技術第31頁,共50頁，2024年2月25日，星期天干柱柱色譜干吸附劑，待分離樣品配成濃溶液或吸附于少量填料上上樣，洗脫液接近色譜柱底部時停止洗脫，挖出或切開色帶。制備色譜技術時間短節(jié)省試劑玻璃柱尼龍柱第32頁,共50頁，2024年2月25日，星期天減壓柱色譜減壓促進溶劑流動。制備色譜技術第33頁,共50頁，2024年2月25日，星期天與加壓相比，變換溶劑更加方便；吸附劑高度一般不超過5cm；分離過程中，逐漸增加洗脫劑中高極性溶劑的比例，開始階段增加幅度較小(1%,2%,3%)，隨后幅度逐步增大(5%,10%,20%等)，通常收集20-25個流分即可將所有成分洗脫。制備色譜技術第34頁,共50頁，2024年2月25日，星期天加壓液相柱色譜技術(1)快速色譜法：約0.2MPa；(2)低壓液相色譜法：<0.5MPa；(3)中壓液相色譜法：0.5～2MPa；(4)高壓液相色譜法：>2MPa；制備色譜技術第35頁,共50頁，2024年2月25日，星期天加壓液相色譜制備分離方法的建立：(1)采用薄層色譜確定分離條件。對于快速和低壓色譜，常用薄層色譜選擇分離條件。硅膠薄層色譜確定正相色譜條件，反相硅膠薄層色譜確定反相色譜條件，一般選擇Rf不大于0.3且具有較好分離效果的展開劑。制備色譜技術第36頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(2)采用分析HPLC來確定分離條件。對于中壓和高壓色譜則需要用分析HPLC條件進行選擇。優(yōu)化條件時，尋求較小的容量因子(k’<3)為原則，分離度需高于分析LC所需要的水平，滿足制備型LC采用過載模式來提高效率。制備色譜技術第37頁,共50頁，2024年2月25日，星期天進樣量的影響實驗室規(guī)模的制備，輕微過載，優(yōu)點：(1)便于回收高純度目標成分，純度>99%；(2)純品幾乎完全回收，回收率>95%；(3)分離程序簡單，不需要為了得到純品進一步分析所得到的組分。制備色譜技術過載：低濃度時，進樣量增加使得容量因子改變超過10％第38頁,共50頁，2024年2月25日，星期天濃度過載和體積過載

制備色譜技術K不變，線性結果可預測K變化，非線性結果難預測第39頁,共50頁，2024年2月25日，星期天邊緣切割與循環(huán)色譜分離－－分離不佳時制備色譜技術密閉進樣器是將流經檢測器的柱流出液通過多通閥連至泵的入口；交替柱循環(huán)裝置是連接兩根色譜柱，通過閥門將第二根色譜柱切割得到的樣品再加到第一根色譜柱上循環(huán)分離。第40頁,共50頁，2024年2月25日，星期天中心切割制備色譜技術

適當損失組分，但避免色譜峰兩端微量組分的污染。第41頁,共50頁，2024年2月25日，星期天制備加壓色譜設備要求(1)泵：流量大，壓力不需要太大；(2)進樣器：大樣品環(huán)六通閥，環(huán)管細而長而不是短而粗，樣品溶液低濃度，大體積；(3)色譜柱：裝填均勻常采用柱床壓縮技術即徑向壓縮和軸向壓縮；(4)檢測器：不需要高靈敏；制備色譜技術第42頁,共50頁，2024年2月25日，星期天快速色譜法簡單易行制備色譜技術第43頁,共50頁，2024年2月25日，星期天低壓和中壓色譜法

第七章制備