酶在食品分析中的應(yīng)用

酶在食品分析中的應(yīng)用主要內(nèi)容1酶法分析的特點(diǎn)及應(yīng)用類型

2酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）

3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

4酶生物傳感器

5酶抑制率法重點(diǎn)第2頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶法分析的定義酶法分析是以酶作為分析試劑，利用酶催化反應(yīng)的特異性和高效性的特點(diǎn)，定性、定量的檢測(cè)待測(cè)物。酶活力測(cè)定：測(cè)定樣品中酶的含量或酶活力酶法分析：定性或定量的檢測(cè)分析物第3頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶法分析的發(fā)展酶在定量分析中的應(yīng)用可以追溯到19世紀(jì)中期。當(dāng)時(shí)，曾采用麥芽提取物作為過氧化物酶源，以愈創(chuàng)木酚作為共底物或指示劑測(cè)定過氧化氫。然而，酶法分析真正的發(fā)展應(yīng)歸于它在臨床實(shí)驗(yàn)室中的廣泛應(yīng)用。第4頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶法分析的發(fā)展如早在1914年臨床上就開始采用脲酶測(cè)定尿中的尿素，但是在臨床實(shí)驗(yàn)室中酶分析的真正突破要推遲到1958年，當(dāng)時(shí)轉(zhuǎn)氨酶分析發(fā)展成為診斷肝病和心臟病的一個(gè)有效手段。到了20世紀(jì)50年代前已有60種物質(zhì)能借助于酶法分析。近年來，酶法分析發(fā)展迅速，廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)、食品、環(huán)境等生物及其它樣品的檢測(cè)。第5頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.酶法分析的特點(diǎn)及應(yīng)用類型酶的特性酶法檢測(cè)的特點(diǎn)催化效率高專一性靈敏性強(qiáng)快速特異性、準(zhǔn)確不需要物理分離，干擾少第6頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶法定量檢測(cè)動(dòng)力學(xué)法：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)速率要求：底物、pH、溫度、樣品、空白與對(duì)照測(cè)定方法：取樣測(cè)定法、連續(xù)測(cè)定法第7頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶偶聯(lián)反應(yīng)法酶偶聯(lián)法測(cè)定，即在反應(yīng)體系中加入一個(gè)或幾個(gè)工具酶，將待測(cè)酶生成的某一產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為新的可直接測(cè)定的產(chǎn)物，當(dāng)加入酶的反應(yīng)速度與待測(cè)酶反應(yīng)速度達(dá)到平衡時(shí)，可以用指示酶的反應(yīng)速度來代表待測(cè)酶的活性。在酶活性測(cè)定時(shí)，如果底物或產(chǎn)物不能直接測(cè)定或難于準(zhǔn)確測(cè)定，可采用此方法。ExEaEi

A→B→C→p式中A為底物，B、C為中間產(chǎn)物，P為可直接測(cè)定的產(chǎn)物；Ex為待測(cè)酶，Ea和Ei都為工具酶，依據(jù)工具酶作用的不同又分別稱為輔助酶和指示酶；輔助酶在酶偶聯(lián)反應(yīng)中可以一個(gè)或多個(gè)，也可以不需要；指示酶是指能監(jiān)測(cè)反應(yīng)速度的酶。臨床酶學(xué)分析中，以NAD（P）H/NAD（P）+為輔酶的脫氫酶和以H2O2為底物的過氧化物酶（POD）是常用的指示酶。

第8頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天①比色法如果酶反應(yīng)的產(chǎn)物可與特定的化學(xué)試劑反應(yīng)而生成穩(wěn)定的有色溶液，且生成顏色的深淺與產(chǎn)物的濃度在一定的范圍內(nèi)有線性關(guān)系可用此法。如蛋白酶的活力測(cè)定：蛋白酶可水解酪蛋白，產(chǎn)生的酪氨酸可與福林試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)色化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，所生成藍(lán)色化合物顏色的深淺與酪氨酸的量之間有線性關(guān)系，可用于定量測(cè)定。②量氣法主要用于有氣體產(chǎn)生的酶促反應(yīng)。如氨基酸脫羧酶、脲酶的活力測(cè)定。產(chǎn)生的二氧化碳量可用特制的儀器如瓦氏呼吸儀測(cè)定之。根據(jù)氣體變化和時(shí)間的關(guān)系，即可求得酶反應(yīng)的速度。③滴定法如果產(chǎn)物之一是自由的酸性物質(zhì)可用此法。如脂肪酶催化脂肪水解，脂肪酸的增加量代表脂肪酶的活力。第9頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天④分光光度法

利用底物和產(chǎn)物光吸收性質(zhì)的不同，可直接測(cè)定反應(yīng)混合物中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。幾乎所有的氧化還原酶都使用該法測(cè)定。如還原型輔酶Ⅰ(NADH2)和輔酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在該波長(zhǎng)下無吸收，脫氫酶類可用該法測(cè)定。該法測(cè)定迅速簡(jiǎn)便，自動(dòng)掃描分光光度計(jì)的使用對(duì)酶活力的快速準(zhǔn)確的測(cè)定提供的極大的方便。⑤放射測(cè)量法是酶活力測(cè)定中較常用的一種方法。一般用放射性同位素標(biāo)記底物，在反應(yīng)進(jìn)行到一定程度時(shí)，分離帶放射性同位素標(biāo)記的產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)定，就可測(cè)知反應(yīng)進(jìn)行的速度。常用的同位素有3H，14C，32P，35S，131I等。如脲酶，將底物尿素用14C標(biāo)記，產(chǎn)生的帶放射性的CO2氣體可用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定。第10頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑥酶偶聯(lián)分析某些酶本身沒有合適的測(cè)定方法，但可偶聯(lián)另一個(gè)酶反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。其基本方法為：應(yīng)用某一高度專一性的工具酶使被測(cè)酶反應(yīng)能繼續(xù)進(jìn)行到某一可直接連續(xù)且簡(jiǎn)便準(zhǔn)確測(cè)定階段的方法。如：被測(cè)E1反應(yīng)的產(chǎn)物B是某一脫氫酶(E2)的底物，向反應(yīng)體系中加入足量的脫氫酶和NAD+或NADPH+，使反應(yīng)由A經(jīng)B繼續(xù)進(jìn)行到C，然后測(cè)定NADH或NADPH的特征吸收光譜的變化，即可間接地測(cè)定E1的活力大小。如己糖激酶的活力測(cè)定即應(yīng)用這一方法。注意：使用該法要求指示酶必須很純，且具有高度的專一性，以免干擾反應(yīng)而給測(cè)定帶來麻煩。第11頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天終點(diǎn)法：完成一定量反應(yīng)所需要的時(shí)間。如α-淀粉酶的活力測(cè)定。因?yàn)榈鈱?duì)淀粉呈現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)，當(dāng)?shù)矸廴芤褐屑尤氲矸勖负螅獾乃{(lán)色反應(yīng)消失而呈現(xiàn)紅棕色；碘對(duì)淀粉顏色反應(yīng)消失的時(shí)間可表示淀粉酶活力的大小。碘對(duì)淀粉顏色反應(yīng)消失花的時(shí)間越短，表示酶的活力越高第12頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)酶法分析來說，其適用范圍僅限于與酶促反應(yīng)相關(guān)的物質(zhì)的檢測(cè)分析，包括酶的底物、輔酶、酶的抑制劑或激活劑的測(cè)定。酶法分析的檢測(cè)物質(zhì)范圍有限，但不影響其在臨床診斷、食品分析、環(huán)境檢測(cè)和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。近年來，酶的固定化技術(shù)和生物傳感器的快速發(fā)展和應(yīng)用，其低成本、高精度、快速檢測(cè)和自動(dòng)化分析的特點(diǎn)拓寬了酶法分析的應(yīng)用領(lǐng)域。第13頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天

酶在食品分析中的應(yīng)用類型1.去除樣品中的雜質(zhì)。如測(cè)定果糖、多糖等。2.催化待測(cè)物生成新的產(chǎn)物，而這種產(chǎn)物更容易被定量分析。如：淀粉的測(cè)定。3.測(cè)定食品中酶的活性作為食品的指標(biāo)，如過氧化物酶的測(cè)定。4.利用酶催化反應(yīng)所產(chǎn)生的一些信息。如酶聯(lián)免疫法、酶電極法等。第14頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第15頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第16頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天2酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）酶聯(lián)免疫測(cè)定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）是繼放射免疫測(cè)定技術(shù)之后發(fā)展起來的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)。ELISA自上世紀(jì)70年代出現(xiàn)開始，就因其高度的準(zhǔn)確性、特異性、適用范圍寬、檢測(cè)速度快以及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，在臨床和生物疾病診斷與控制等領(lǐng)域中倍受重視，成為檢驗(yàn)中最為廣泛應(yīng)用的方法之一。第17頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天ELISA是將酶分子與抗體分子連接成一個(gè)酶標(biāo)分子，當(dāng)它與固相免疫吸附中相應(yīng)抗原或抗體復(fù)合物相遇時(shí)形成酶-抗原-抗體結(jié)合物，加入酶底物，底物被催化成可溶性或不溶性顯色產(chǎn)物，可用肉眼或分光光度計(jì)定性或定量，根據(jù)顯色深淺，確定待測(cè)抗原或抗體的濃度與活性。第18頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天

免疫學(xué)的基本概念

抗體（antibody）和抗原（antigen）

抗體是一種免疫球蛋白。免疫球蛋白有5種，分別命名為IgG，IgA，IgM，IgD和IgE。無脊椎動(dòng)物不產(chǎn)生免疫球蛋白，魚有IgM,兩棲類有IgM和IgG，除人類有5種免疫球蛋白外，大多數(shù)哺乳動(dòng)物只有IgG，IgA，IgM和IgE四種免疫球蛋白。第19頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天

抗原是一種進(jìn)入機(jī)體后能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。它可能是生物體（如各種微生物），也可能是非生物體（如各種異類蛋白、多糖等）。

通常，抗原分子量大于10000，而且具有一定結(jié)構(gòu)（如苯環(huán)或雜環(huán)等結(jié)構(gòu)）的物質(zhì)均可成為抗原性物質(zhì)，都能有效地誘發(fā)產(chǎn)生抗體。

第20頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天

有些分子量較小的物質(zhì)，如某些藥物和激素在動(dòng)物體內(nèi)并不產(chǎn)生抗體。但將這種小分子量的物質(zhì)用化學(xué)法結(jié)合到某種載體（通常是大分子蛋白質(zhì)）上，再用這種結(jié)合物可誘發(fā)產(chǎn)生抗體。通常把這樣一些小分子量物質(zhì)稱為半抗原。第21頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天

用半抗原的結(jié)合物誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，其中有些是抗這個(gè)半抗原的抗體，可與其半抗原結(jié)合。由此可見，若待測(cè)物是具有特定結(jié)構(gòu)的大分子蛋白質(zhì)，可直接用來制備抗體；若為分子量較小的半抗原，則需將它進(jìn)行化學(xué)修飾結(jié)合到大分子載體上才能誘發(fā)產(chǎn)生抗半抗原的抗體。第22頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.1ELISA的基本原理（1）利用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接（或建立關(guān)聯(lián)）。（2）通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。它將酶促反應(yīng)的高效率和免疫反應(yīng)的高度專一性有機(jī)地結(jié)合起來，可對(duì)生物體內(nèi)各種微量有機(jī)物的含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。重點(diǎn)第23頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天ELISA試劑盒的組成完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）；（3）酶作用的底物（顯色劑）；（4）陰性和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定）；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（含吐溫20磷酸鹽緩沖液）（7）酶反應(yīng)終止液。（常用硫酸）必需第24頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶標(biāo)儀和酶標(biāo)板DNM-9602A酶標(biāo)分析儀酶標(biāo)板第25頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第26頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第27頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第28頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第29頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第30頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第31頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第32頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第33頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第34頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第35頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第36頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第37頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第38頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第39頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天ELISA影響因素試劑因素標(biāo)本因素實(shí)驗(yàn)原理或操作方法環(huán)境因素第40頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天試劑因素抗原抗體的純度標(biāo)準(zhǔn)品定值的準(zhǔn)確性抗體的親和力、滴度和特異性標(biāo)記物的比活性或免疫活性第41頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第42頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第43頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第44頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.2ELISA的基本類型隨著ELISA在生物檢測(cè)分析領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，逐漸演變出了幾種不同類型的檢測(cè)方法：（5）捕獲法測(cè)IgM抗體；（6）ABS-ELISA法；（7）PCR-酶聯(lián)免疫測(cè)定法；（8）斑點(diǎn)免疫酶結(jié)合試驗(yàn)。（1）夾心法；（2）間接法；（3）競(jìng)爭(zhēng)法；（4）雙位點(diǎn)一步法；第45頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天雙抗體夾心法此法常用于測(cè)定抗原,將已知抗體吸附于固相載體,加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。（1）雙抗體夾心法乙肝表面抗原。第46頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第47頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天間接法此法是測(cè)定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測(cè)定。（2）間接法ELISA第48頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第49頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第50頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天競(jìng)爭(zhēng)法此法可用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例,將抗原吸附于固相載體；加入待測(cè)抗原和一定量特異性抗體，使固相抗原與待測(cè)抗原二者競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的抗體與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。（3）競(jìng)爭(zhēng)法第51頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第52頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.3ELISA測(cè)定中酶的作用由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定具有極高的靈敏度。第53頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）酶標(biāo)記的抗體或抗原的制備酶標(biāo)記的抗體或抗原是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗體或抗原的免疫活性。酶標(biāo)記抗體的制備主要有戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法兩種方法。酶結(jié)合物一般需經(jīng)離子交換層析或分子篩分離純化。第54頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）常用的酶及底物酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過氧化物酶鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色黃色棕色蘭色藍(lán)綠色492460449

425

642堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光黃色

360,450

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為什么辣根過氧化物酶可應(yīng)用于ELISA？第55頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天為什么辣根過氧化物酶可應(yīng)用于ELISA？（1）成本低（2）熱穩(wěn)定性好（3）顯色反應(yīng)類型多第56頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.4ELISA技術(shù)在食品分析中的應(yīng)用近年來，ELISA因其操作程序的規(guī)范化、簡(jiǎn)單化和檢測(cè)的高靈敏性，在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、重要有機(jī)物污染、生物毒素、食品添加劑和人畜共患疾病病原體的快速檢測(cè)和分析等食品安全性檢測(cè)領(lǐng)域正逐步推廣應(yīng)用。第57頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）毒素檢測(cè)真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中的十幾種對(duì)人類危害較大，它們一般同時(shí)具有毒性強(qiáng)和污染頻率高的特點(diǎn)。其中毒性最大、致癌能力最強(qiáng)的是黃曲霉毒素。它在自然界中分布十分廣泛，黃曲霉常常和其他多種微生物在一起，生長(zhǎng)在糧食、油料作物的種子、各種食品和飼料中。細(xì)菌毒素——金黃色葡萄球菌毒素第58頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天自1977年抗黃曲霉素B1的單克隆問世至今，幾乎所有重要真菌毒素如伏馬毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮、展青霉素等的ELISA檢測(cè)方法均已建立。在對(duì)黃曲霉素B1(AFTB1)的檢測(cè)中，其檢測(cè)AFTB1的線性范圍0.25～5.Oμg/mL，靈敏度為12.5pg。另外該方法也正在被廣泛地應(yīng)用于各種藻類和貝類毒素的檢測(cè)。第59頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天黃曲霉素B1ELISA試劑盒

本試劑盒包括用于定量檢測(cè)黃曲霉素B-G的試劑和方法。檢測(cè)數(shù)量：96孔（包括標(biāo)準(zhǔn)）檢測(cè)時(shí)間：20分鐘第60頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）農(nóng)藥殘留檢測(cè)酶聯(lián)免疫測(cè)定已成為許多國(guó)際權(quán)威分析機(jī)構(gòu)如美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)分析農(nóng)藥殘留的首選方法。迄今為止，應(yīng)用酶聯(lián)免疫測(cè)定檢測(cè)食品中的殘留農(nóng)藥主要為除草劑、殺蟲劑和殺菌劑。草甘膦的ELISA檢出下限為0.07μg/mL，與色譜法測(cè)定的結(jié)果一致。第61頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天從目前來看，盡管ELISA檢測(cè)限度還不能完全達(dá)到國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家技術(shù)法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，而且有抗體制備不易和不能同時(shí)完成多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)等缺點(diǎn)，但是由于該技術(shù)具有樣本前處理簡(jiǎn)單，純化步驟少，大量樣本分析時(shí)間短，適合于做成試劑盒現(xiàn)場(chǎng)篩選等優(yōu)點(diǎn)，使其可在蔬菜產(chǎn)區(qū)、蔬菜批發(fā)市場(chǎng)和海關(guān)配備，工商人員可隨身攜帶或建立固定的農(nóng)藥殘留速測(cè)點(diǎn)，隨時(shí)把殘毒超標(biāo)的蔬菜、水果杜絕在食用之前。第62頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）細(xì)菌污染檢測(cè)食品中的有害細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一定數(shù)目，食用后會(huì)引起各種疾病。為了有效地控制其傳播，就必須有快速和可靠的檢測(cè)方法。目前有許多種方法，其中通過制備單克隆抗體分析食品中細(xì)菌的酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)研究最多，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。第63頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙門氏菌的ELISA檢測(cè)例如對(duì)沙門氏菌最低檢測(cè)量可達(dá)500CFU/g，僅需22h，比常規(guī)方法縮短了3～4d，與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無交叉反應(yīng)。此外以ELISA技術(shù)為基礎(chǔ)的全自動(dòng)沙門氏菌檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)過程的自動(dòng)化，全程耗時(shí)僅為45min。其原理是將捕捉抗體包被到凹形金屬片的內(nèi)面，可以從前增菌液中吸附被檢的沙門氏菌，對(duì)于該系統(tǒng)來說，需要做的只是加樣（生物梅里埃公司）。第64頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天李斯特氏菌的快速檢測(cè)在對(duì)李斯特氏菌的快速檢測(cè)中，利用三株針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、無害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的單抗，以?shī)A心ELISA法，在48h內(nèi)，可從人工模擬肉中檢測(cè)下限為5CFU/g樣品。第65頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）肉類品質(zhì)檢測(cè)ELISA在肉類食品品質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用主要包括加熱終溫判定分析和摻入異種肉的檢測(cè)兩個(gè)方面。腸道疾病的爆發(fā)和動(dòng)物性食品有很大關(guān)系，而肉食品加熱煮制不當(dāng)是引起該疾病爆發(fā)的一個(gè)主要原因。在加熱過程中一些成分的含量會(huì)降低，而一些產(chǎn)物的濃度會(huì)提高。第66頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天當(dāng)用蛋白質(zhì)做指示劑時(shí)，可制備抗體，這種抗體對(duì)單一蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)或變性狀態(tài)均具有專一性，這樣它就可以指示蛋白質(zhì)在加熱過程中變化。因而ELISA可作為商業(yè)上快速判定分析肉品終溫的一種方法。目前用的最多的是對(duì)乳酸脫氫酶的免疫檢測(cè)。其次是對(duì)摻入異種肉的檢測(cè)，利用多克隆抗體對(duì)血清白蛋白的酶聯(lián)免疫測(cè)定法，對(duì)鮮肉進(jìn)行摻假檢測(cè)。第67頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天幾種以單克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA反應(yīng)已得到應(yīng)用，可以檢測(cè)出1%～2%的摻假率。目前在商業(yè)上，酶聯(lián)免疫測(cè)定已可以檢測(cè)十多種動(dòng)物肉，該方法已為美國(guó)農(nóng)業(yè)部使用。同時(shí)，ELISA技術(shù)也可以利用對(duì)熱穩(wěn)定的肌肉抗原來檢測(cè)加熱處理后的肉摻假情況。目前，該技術(shù)可以檢測(cè)6種家畜熟肉制品。第68頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（5）動(dòng)物性食品中藥物殘留檢測(cè)利用ELISA技術(shù)測(cè)定動(dòng)物性食品中有害殘留成分只是近幾年的事。隨著研究的深入，由原樣品的復(fù)雜處理和抽提發(fā)展為只需要高度純化過程，加速了其在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。特別是對(duì)豬肉、禽肉和水產(chǎn)品中重要禁用獸藥的檢測(cè)。第69頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天如瘦肉精（鹽酸克倫特羅）酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定，不僅可作為一個(gè)定性篩選過程，也可以進(jìn)一步進(jìn)行定量測(cè)定。檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.5×10-9，完全達(dá)到我國(guó)農(nóng)業(yè)部目前的1×10-9監(jiān)督檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。ELISA法作為鹽酸克倫特羅殘留量的篩選方法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確快速的特點(diǎn)，適用于大量樣品的測(cè)定，并可能成為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。第70頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（6）人畜共患疾病病原體檢測(cè)在禽流感病毒檢測(cè)方面，我國(guó)已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用，建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù)，已形成試劑盒生產(chǎn)能力。此外，采用ELISA法可以有效檢測(cè)牛及羊朊病毒蛋白，該蛋白可引起牛的病理性海綿狀病毒，是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病（瘋牛病，BSE），與人群發(fā)生變異型克雅氏?。╒CJD）有關(guān)。第71頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（7）重金屬污染檢測(cè)金屬硫蛋白遍存于自然界，細(xì)菌、植物、動(dòng)物以及人類肌體中，是一類對(duì)重金屬離子有很強(qiáng)親和力，含豐富的半胱氨酸（約1/3），不含芳香族氨基酸和組氨酸的低分子量蛋白質(zhì)。金屬硫蛋白含有大量的-SH，能與Hg、Cu、Ag等重金屬離子結(jié)合掩蔽金屬的毒性，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的金屬離子有重要的解毒作用。第72頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天生物細(xì)胞，在環(huán)境受重金屬污染（Cu、Hg、Pb、Zn與金屬離子）的情況下，可被誘導(dǎo)合成出大量的金屬硫蛋白，且在一定范圍內(nèi)成正比，是一項(xiàng)對(duì)金屬污染具特異性的指標(biāo)。用純化的金屬硫蛋白對(duì)兔進(jìn)行免疫，兔抗血清純化后并標(biāo)記辣根過氧化酶，可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中重金屬污染的超微量檢測(cè)。第73頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（8）食物中其它成分檢測(cè)ELISA技術(shù)同時(shí)可以用于食品中其它成分的檢測(cè)，如:(1)檢測(cè)某些特定的轉(zhuǎn)移基因表達(dá)蛋白，以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分；（2）食品中營(yíng)養(yǎng)素的測(cè)定，最小檢出限可達(dá)0.05μg/g；（3）通過合成不同異黃酮的羥酸半抗原，分析植物中含量很低的雌激素；（4）可用于檢測(cè)食品加工過程中的酶（如磷酸丙糖異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）含量的變化等。第74頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）第75頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR檢測(cè)的原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）以特定的基因片段為模板，利用人工合成的一段寡聚核苷酸為引物，以四種脫氧核苷酸為底物，在DNA聚合酶的作用下，通過DNA模板的變性，達(dá)到基因擴(kuò)增的目的。PCR是目前轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)較為成熟的方法。第76頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天第77頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天我國(guó)已應(yīng)用PCR-酶聯(lián)免疫測(cè)定檢測(cè)技術(shù)，建立了轉(zhuǎn)基因大豆與玉米中常用外源基因的快速檢測(cè)體系，并應(yīng)用于進(jìn)出境產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)際工作中，結(jié)果表明，PCR-酶聯(lián)免疫測(cè)定法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏特異、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆、玉米及其它轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。第78頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR檢測(cè)的應(yīng)用對(duì)熱處理后的熟肉樣品，要檢測(cè)出肉制品中肉的組成比較困難，但經(jīng)PCR后檢測(cè)，牛肉、豬肉、雞肉和火雞肉的最小檢測(cè)量可以達(dá)到1%～2%，而且肉制品中的抗壞血酸添加劑不影響檢測(cè)結(jié)果。目前，PCR是區(qū)分雞肉和火雞肉的唯一方法。PCR也用于食品中腐敗菌、病原菌如腸道出血性大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、金黃色葡萄球菌等的檢測(cè)。第79頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天4酶生物傳感器酶?jìng)鞲衅髦饕妹笇?duì)生物體的催化特性，且對(duì)特定底物有反應(yīng)的特異性，把這種特異性與電化學(xué)分析的迅速性和簡(jiǎn)便性結(jié)合起來，從含有多種多樣有機(jī)物的生物試樣中，有選擇地把特定物質(zhì)迅速測(cè)定出來。第80頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶生物傳感器的簡(jiǎn)圖第81頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶?jìng)鞲衅髂芊磸?fù)進(jìn)行檢測(cè)，不需要通常進(jìn)行酶分析時(shí)需要的酶和顯示劑，實(shí)現(xiàn)無試劑分析，因此，發(fā)展較快，現(xiàn)已有多酶?jìng)鞲衅?，可用在生產(chǎn)線上監(jiān)控食品加工流程、發(fā)酵工藝過程及微生物濃度的控制，又可在包裝材料上測(cè)知食品是否經(jīng)過不當(dāng)溫度的貯存，冷凍時(shí)微生物含量及貯存壽命的預(yù)警。第82頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天生物傳感器實(shí)例國(guó)內(nèi)外得到應(yīng)用的生物傳感器主要包括：1測(cè)定水質(zhì)的BOD分析儀、在市場(chǎng)上有以日本和德國(guó)為代表產(chǎn)品供應(yīng)。2采用絲網(wǎng)印刷和微電子技術(shù)的手掌型血糖分析器，已形成規(guī)?；a(chǎn)，年銷售量約為十億美元；3固定化酶?jìng)鞲蟹治鰞x：國(guó)外以美國(guó)的YSI公司和德國(guó)BST公司為代表，都有系列分析儀產(chǎn)品，它們主要用于環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品分析，國(guó)內(nèi)到目前為止只有山東省科學(xué)院生物研究所的系列化產(chǎn)品在市場(chǎng)得到應(yīng)用。4SPR生物傳感器，在日、美、德、瑞典等國(guó)得到了開發(fā)和初步應(yīng)用。第83頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天德國(guó)研發(fā)的環(huán)境廢水BOD分析儀第84頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天手掌型葡萄糖(glucose)分析儀第85頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天SBA-50型單電極生物傳感分析儀，是SBA-30型乳酸分析儀的更新?lián)Q代產(chǎn)品第86頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天SBA-40C生物傳感分析儀第87頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天SBA-70型血糖乳酸自動(dòng)分析儀第88頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天生物傳感器在食品工業(yè)中的應(yīng)用（一）、檢測(cè)食品鮮度1.魚鮮度傳感器

魚、貝類水產(chǎn)品的鮮度是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的重要指標(biāo)。魚死后體內(nèi)ATP經(jīng)酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黃嘌呤和尿酸。因此有人提出用K值表示鮮度：肌苷+次黃嘌呤K(%)=ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+次黃嘌呤+尿酸第89頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天由于大多數(shù)魚死后5-20小時(shí)，ATP、ADP和AMP已分解殆盡，所以魚的鮮度主要取決于以下三個(gè)步驟：即IMP肌苷次黃嘌呤尿酸因此K值可簡(jiǎn)化為Ki：肌苷+次黃嘌呤Ki=

×100%

IMP+肌苷+次黃嘌呤第90頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天Ki值越小，魚越新鮮。采用催化上述三步驟的三種酶即5′-核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶固定化后制成酶膜與氧電極構(gòu)成了測(cè)定魚肉的鮮度計(jì)。電極工作原理是以次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)所消耗的氧量所對(duì)應(yīng)的氧電極的電流改變值為基礎(chǔ)。第91頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.肉鮮度傳感器肉類在腐敗過程中會(huì)產(chǎn)生各種胺類，故測(cè)定胺類也能反應(yīng)肉類的新鮮程度。用腐胺氧化酶與過氧化氫電極構(gòu)成多胺生物傳感器，測(cè)定魚肉在貯藏過程中的鮮度，響應(yīng)時(shí)間40s，測(cè)定腐胺線性范圍為0.03×10-6-3×10-6mol/L。第92頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天Kress等人開發(fā)了一種快速測(cè)定肉類鮮度的匕首型生物傳感器，其探頭可現(xiàn)場(chǎng)刺入食品表面2-4mm深處，通過測(cè)定葡萄糖濃度評(píng)價(jià)肉類食品的新鮮度。3.牛乳鮮度傳感器牛乳鮮度可以通過乳中的菌數(shù)或乳酸含量來判斷，牛乳鮮度傳感器實(shí)際上就是一個(gè)菌數(shù)測(cè)定儀或乳酸測(cè)定儀。另外也可通過測(cè)定短鏈脂肪酸含量判斷乳及乳制品的鮮度。第93頁(yè),共104頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）發(fā)酵中的應(yīng)用1、發(fā)酵中葡萄糖測(cè)定過去用操作繁瑣時(shí)間長(zhǎng)的還原糖測(cè)定方法只能近似地估計(jì)葡萄糖的變化。酶?jìng)鞲衅魈峁┝丝焖俣鴾?zhǔn)確的固定化酶的測(cè)定方法，發(fā)酵過程中可根據(jù)糖消耗確定微生物的生長(zhǎng)速率，觀察是否染菌，隨時(shí)與產(chǎn)物的產(chǎn)生一起估算轉(zhuǎn)化率，確定補(bǔ)料效果和及時(shí)判斷發(fā)酵結(jié)束的時(shí)間。發(fā)酵過程或設(shè)備異?，F(xiàn)象通過葡萄糖分析得到及時(shí)預(yù)報(bào)。第94頁(yè)