蛋白質(zhì)的分析

WesternBlotting蛋白質(zhì)的分析1實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釽esternblotting的原理及其意義，掌握Westernblotting的操作方法。應(yīng)用Westernblotting技術(shù)分析鑒定經(jīng)SDS分離后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上的重組蛋白。

2實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)樣品經(jīng)

SDS電泳后，凝膠所含的樣品蛋白質(zhì)區(qū)帶通過電泳方法轉(zhuǎn)移、固定到載體（如尼龍膜、硝酸纖維素膜、PVDF膜）上，以膜上的蛋白或多肽為抗原，與相應(yīng)的第一抗體和酶標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)，用適當(dāng)?shù)娜芤浩慈ノ唇Y(jié)合抗體后，置含底物的溶液中培育，顯出譜帶，即可檢測(cè)出樣品中的特異組分。

3操作方法〈一〉電轉(zhuǎn)移1．將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS，待溴酚藍(lán)跑出膠后停止電泳。2．載手套切2－4張定性濾紙和一張PVDF膜，它們的大小應(yīng)與凝膠的大小相同。在膜的一（左）角作一記號(hào)（或剪角），依次序浸入100％甲醇10秒，去離子水5分鐘，然后與濾紙和海綿（纖維）墊浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。3．剝膠，并將凝膠裁成合適大小，切角以做記號(hào)。4“夾心餅”的制作（1）4.次序：負(fù)極（黑孔板）－>纖維墊->1－2張濾紙->凝膠->PVDF膜->1-2張濾紙->纖維墊->正極板（白孔板）－>扣上吊扣－>插進(jìn)轉(zhuǎn)膜槽中。

5“夾心餅”的制作（2）+_PVDF膜凝膠濾紙纖維墊6電轉(zhuǎn)移按上示意圖，接上電源（凝膠一邊接負(fù)極，PVDF膜一邊接正極），恒流電泳2小時(shí)，電流為：膜面積(cm2)x2mA。關(guān)閉電源，將膜取出，置塑料盒中用麗春紅S染色約5分鐘，回收麗春紅S，然后用蒸餾水洗去背景染料顯色，室溫稍干燥后觀察蛋白帶所在位置，然后用TBST浸泡幾次，完全洗去麗春紅S染料。

7封閉與雜交6.將膜放入塑料盒中，加入20mL封閉液，置脫色搖床中緩慢搖動(dòng)，室溫1小時(shí)或4℃（層析冷柜）封閉過夜?！慈蛋械鞍着c第一抗體結(jié)合7．棄去封閉液，用TTBS稀釋試劑B（1：1000），取5～10mL加入盒中，室溫平緩搖動(dòng)溫育1小時(shí)。然后盡量回收抗體溶液，-20℃保存，可重復(fù)使用。用TBST室溫洗膜3次，每次10min－15min。

8雜交與顯色8.用TBST稀釋試劑C（1：1000），混勻后加入盒中，每張膜約5－10mL,室溫?fù)u1小時(shí)；9.盡量回收二抗，－20oC保存；將膜用TBST洗4次，每次10－15min.;將膜用TBS洗15min.,配制DAB顯跡液，將膜放入顯色，隨時(shí)觀察帶的出現(xiàn)；蒸餾水洗膜；紹晾干膜，拍照。保存膜于密閉的朔料袋中。9試劑1.

轉(zhuǎn)移緩沖液：2.9g甘氨酸（39mmol/L），5.8gTris堿（48mmol/L），0.37gSDS（0.037%），200ml甲醇（20%），定容至1,000mL；每組用量約500mL。2.

封閉液：5%脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，溶于TBST溶液中；由試劑盒提供（BlockingSolutionVW)3.

麗春紅S（Ponceaus）染液：0.5g麗春紅S溶于1mL冰乙酸中，加水至100mL；4.

TBST洗膜液：TBS緩沖液含1%Tween-20；高壓滅菌后室溫保存。10試劑5．

DAB，試劑盒提供,用前用100mMTris-HCl(pH7.5)配成5mg/mL。反應(yīng)液配方(5mL)：100mMTris-HCl,pH7.52.5mL

5mg/mLDAB0.5mL30%H2O22.5uLddH2O2mL6．TBS:100mMTris-HCl,0.9%