SNT 5361-2021 出口食品中阪崎克羅諾桿菌檢測方法 fusA基因測序法-PDF解密

ICS07.100.30CCSX04中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T5361—2021出口食品中阪崎克羅諾桿菌檢測方法fusA基因測序法DetectionofCronobactersakazakiinexportfoodfusAgenesequencingmethod2021-11-22發(fā)布2022-06-01實施中華人民共和國海關總署發(fā)布ⅠSN/T5361—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由中華人民共和國海關總署提出并歸口。本文件起草單位:中國海關科學技術研究中心。1SN/T5361—2021出口食品中阪崎克羅諾桿菌檢測方法fusA基因測序法1范圍本文件規(guī)定了出口食品中阪崎克羅諾桿菌的檢測方法。本文件適用于出口食品中阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)的檢測。(Cronobactermalonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌(Cronobacterturicensis)、穆汀斯克羅諾桿菌(Cronobactermuytjensii)、都柏林克羅諾桿菌(Cronobacterdublinensis)、尤尼沃斯克羅諾桿菌(Cronobacteruniversalis)和康帝蒙提克羅諾桿菌(Cronobactercondimenti)的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.40食品安全國家標準食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27403實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。其是所有細胞中均要表達的一類基因,其產(chǎn)物是對維持細胞基本生命活動所必需的,其基因序列高度保守并且在大多數(shù)情況下持續(xù)表達。其又稱看家基因,持家基因。3.2TaqDNA酶ThermusaquaticusDNApolymerase其是從Thermusaquaticus細菌中提取的耐熱DNA聚合酶。3.3多位點序列分型multilocussequencetyping其是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法。這種方法通過PCR擴增多個管家基因內(nèi)部片段并測定其序列以分析菌株的差異。4縮略語下列縮略語適用于本文件。BHI:腦心浸出液肉湯(brainheartinfusionbroth);DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid);dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate);EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid);2SN/T5361—2021fusA:延長因子G基因(elongationfactorG);GTP:三磷酸鳥苷(guanosinetriphosphate);MLST:多位點序列分型(multilocussequencetyping);PCR:聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)。5原理fusA基因是細菌延長因子的編碼基因。在克羅諾桿菌屬細菌中負責編碼延長因子G,該因子在翻譯延長過程中催化GTP依賴的核糖體的轉運。fusA基因是克羅諾桿菌屬MLST分型使用的七個管家基因之一,其基因的序列對克羅諾桿菌屬的分類效果好,相同的fusA基因序列基本不會同時存在于兩種克羅諾桿菌中。因此,可利用該基因片段的序列信息區(qū)分克羅諾桿菌屬的不同種。6試劑和材料除有特殊說明外,所有實驗用試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB/T6682中一級水的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。6.1ExTaqDNA聚合酶。6.2dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。6.3DNA提取試劑:DNA提取試劑盒。6.410×ExTaq緩中液。6.5MgCl2溶液(25mmol/L)。6.6TE緩沖液:10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。6.7瓊脂糖。6.850×TAE緩沖液:2mol/LTris-HCl(pH8.4),1mol/L乙酸,0.1mol/LEDTA。6.9DNA分子量標記物(100bp~2000bp)。6.10參考菌株:阪崎克羅諾桿菌ATCC29544。7儀器和設備7.1PCR擴增儀。7.2電泳儀。7.3凝膠成像系統(tǒng)。7.4離心機:離心力不小于12000g。7.5恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。7.6恒溫水浴鍋:44℃±0.5℃。7.7微量移液器和無菌吸頭:10μL、100μL、200μL、1000μL。7.8天平:感量為0.1g。7.9滅菌三角燒瓶:500mL、250mL。7.10滅菌平皿:90mm×15mm。7.11無菌離心管:1.5mL、200μL。SN/T5361—20218檢測步驟8.1樣品制備、增菌培養(yǎng)和分離樣品的制備、增菌培養(yǎng)和分離步驟參照GB4789.40的方法進行。8.2模板DNA的制備取分離菌株BHI液體培養(yǎng)物適量,加到1.5mL無菌離心管中,13000r/min離心5min,吸棄上清,加50μLTE緩沖液,混勻后沸水浴10min,13000r/min離心5min,上清液用于后續(xù)實驗。也可使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒,并按其說明制備模板DNA。8.3PCR反應體系8.3.1PCR擴增和測序引物序列擴增正向引物:5’-GAAACCGTATGGCGTCAG-3’;擴增反向引物:5’-AGAACCGAAGTGCAGACG-3’;測序正向引物:5’-GCTGGATGCGGTAATTGA-3’;測序反向引物:5’-CCCATACCAGCGATGATG-3’。8.3.2PCR反應體系見表1。表1PCR反應體系試劑貯備液濃度加樣體積/μL終濃度雙蒸水 補至50μL 10×PCR緩沖液 5.01×MgCl225mmol/L3.01.5mmol/LdNTP2.5mmol/Leach4.00.2mmol/Leach上游引物10pmol/μL2.00.4pmol/μL下游引物10pmol/μL2.00.4pmol/μLTaq酶5U/μL0.50.05U/μL模板DNA 2.0 注:反應體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應總體積進行適當調(diào)整。8.3.3反應條件96℃預變性1min;9