基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢

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基于PCR方法的HPV檢測方法介紹及其劣勢

July2011

Shanghai,China1基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024主要內(nèi)容HPV檢測面臨的挑戰(zhàn)以及為何選擇HC2用于子宮頸癌篩查基于PCR的HPV檢測方法介紹及其用于子宮頸癌篩查中的局限性（對比HC2）2基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024HPV檢測面臨的挑戰(zhàn)有超過150種的HPV型別有些型別引起癌癥13+高危型致癌HPV，單一感染或多重感染有些引起輕度病變，如疣HPV感染引起的疾病因年齡和地域不同多重感染較為普遍RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，在107例液基細胞學(xué)結(jié)果為各種子宮頸上皮內(nèi)瘤病變的樣本中，有52％存在多重感染(Lindhetal.,JClinVirol.40(4):321-4.(2007)

子宮頸癌癌癥發(fā)生的部位可能會比較隱匿難以發(fā)現(xiàn)、在子宮頸內(nèi)口（轉(zhuǎn)化區(qū)）由于遠離子宮頸外口，因此采樣時可能很難被采到采樣部位非常重要眾多的其它微生物（交叉反應(yīng)）個人衛(wèi)生、生理周期可能會對檢測有抑制3基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024HPV檢測方法用于子宮頸癌篩查特點HPV檢測用于臨床子宮頸癌篩查，目的不是簡單地檢測有無HPV感染的問題，而是發(fā)現(xiàn)那些有HPV感染并且存在發(fā)展成癌前病變或癌的高風(fēng)險婦女。子宮頸癌篩查強調(diào)的是臨床敏感度而不是分析敏感度PCR是一種很好的方法，用于分子病毒檢測，分析靈敏度很高，10個拷貝數(shù)量級的水平都能把病毒檢測出來用于子宮頸癌篩查中的HPV檢測方法要求：該檢測方法要有很好的臨床敏感度，即癌前病變或癌的發(fā)病風(fēng)險，而不是分析敏感度4基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024為何選擇HC2技術(shù)用于子宮頸癌的篩查HC2是最佳的HPV篩查工具

檢測方法簡便、可靠不易被污染物所抑制不需要前期的DNA提取過程縮減勞動成本和試驗時間在同一反應(yīng)中檢測多種型別病毒反應(yīng)簡單、易于操作與PCR不同的是，不需要專業(yè)高清潔實驗室以避免交叉污染不會因目標(biāo)DNA的數(shù)量而對結(jié)果有影響測出5000個病毒拷貝可批量、全自動處理(RCSplatform;NextGen)5基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024主要內(nèi)容HPV檢測面臨的挑戰(zhàn)以及為何選擇HC2用于子宮頸癌篩查基于PCR的HPV檢測方法介紹及其用于子宮頸癌篩查中的局限性（對比HC2）6基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024What’sTheBestAnalyticalSensitivityCutoff

ForClinicallyUsefulHPVDNATesting

HPV病毒含量與臨床病變的關(guān)系7基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024AdaptedfromSnijdersetal.JournalofPathology2003;201:1-6由此可見：HC2的分析閾值及判斷標(biāo)準(zhǔn)是經(jīng)過臨床驗證的由此可見：基于PCR的HPV檢測方法檢測到許多與臨床無關(guān)的HPV感染8基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024Snijdersetal.JournalofPathology2003;201:1-6高度分析敏感度檢測出無臨床相關(guān)性的病毒水平一過性感染恢復(fù)階段：免疫反應(yīng)早期感染、可自體清除“…使用分析敏感度過高的檢測方法會降低臨床特異性”PCR關(guān)注的是分析敏感度，但真正重要的是臨床敏感度9基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024PCR分析敏感度為<10copiesHPVDNAHC2臨床敏感度是5,000copiesHPVDNAAdaptedfromSnijdersetal.JournalofPathology2003;201:1-6分析敏感度與臨床敏感度——臨床相關(guān)性10基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024基于PCR的分析檢測在宮頸癌篩查應(yīng)用的局限１分析敏感度很高－發(fā)現(xiàn)過多無臨床意義或無風(fēng)險的HPV陽性婦女對婦女造成不必要的心理負擔(dān)和壓力很多病例是一過性感染，隨后的時間通過機體免疫系統(tǒng)清除造成過度診斷和治療造成假陽性，誤診原因檢出低病毒含量的HPV感染者擴增了沒有致病性的基因片斷標(biāo)本間的交叉污染11基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024區(qū)別：基于PCR的分析檢測與HC2臨床檢測分析敏感度臨床敏感度樣本中能檢測出的病毒最低水平也被稱作檢測極限(LOD)

統(tǒng)計學(xué)意義：檢測結(jié)果與零的區(qū)分以臨床病變?yōu)榻K點指征，檢測出高度病變的敏感度(CIN3+/SCC)

初篩時，能夠檢測出CIN2＋或?qū)m頸癌的比例分析閾值必須得到嚴格的驗證12基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024區(qū)別2分析敏感度PCR方法的分析敏感度達到10個拷貝/ml臨床敏感度HC2的分析閾值經(jīng)臨床驗證為5,000個拷貝/ml樣本中能檢測出的病毒最低水平也被稱作檢測極限(LOD)

統(tǒng)計學(xué)意義：檢測結(jié)果與零的區(qū)分以臨床病變?yōu)榻K點指征，檢測出高度病變的敏感度(CIN3+/SCC)

初篩時，能夠檢測出CIN2＋或?qū)m頸癌的比例分析閾值必須得到嚴格的驗證13基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024區(qū)別3分析敏感度PCR方法的分析敏感度達到10個拷貝/ml陽性結(jié)果：可能沒有臨床相關(guān)性臨床敏感度HC2的分析閾值經(jīng)臨床驗證為5,000個拷貝/ml經(jīng)臨床證實：高度的陰性預(yù)測值樣本中能檢測出的病毒最低水平也被稱作檢測極限(LOD)

統(tǒng)計學(xué)意義：檢測結(jié)果與零的區(qū)分以臨床病變?yōu)榻K點指征，檢測出高度病變的敏感度(CIN3+/SCC)

初篩時，能夠檢測出CIN2＋或?qū)m頸癌的比例分析閾值必須得到嚴格的驗證14基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024基于PCR的分析檢測在宮頸癌篩查應(yīng)用的局限２臨床靈敏度較低（比HC2)基于PCR方法的國外研究報道臨床靈敏度平均在82%（來自國外數(shù)據(jù)）所有國產(chǎn)的HPV檢測無論哪種方法均沒有公開的大規(guī)?；诤Y查人群的臨床靈敏度的數(shù)據(jù)報道，各家都是在跟HC2做符合率的對比至少漏診12%很多真正有風(fēng)險的病人造成假陰性，漏診原因不同的HPV亞型擴增效率不同L1基因段缺失低危型HPV的競爭內(nèi)質(zhì)控β球蛋白的競爭樣品抑制（有5％的樣品因出現(xiàn)抑制而無法擴増）15基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024“在檢測2年內(nèi)CIN3和癌癥的累積發(fā)病方面，HC2比PCR更加敏感”**Schiffmanetal,AmJClinPath2005;124:722-732Lorincz,HPVTestingbyHybridCapture.MonsonegoJ(ed):EmergingIssuesofHPVInfections:FromSciencetoPractice.Basel,Karger,2006:54-6216項已發(fā)表的研究數(shù)據(jù)表明，PCR的平均臨床敏感度為82%分析敏感度與臨床敏感度——–平均敏感度16基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024子宮頸癌篩查不容漏診大多數(shù)PCR檢測會因為目標(biāo)片段的缺失而受到影響晚期癌癥階段L1缺失

競爭抑制低危型HPV的競爭內(nèi)質(zhì)控β球蛋白的競爭樣品抑制（有5％的樣品因出現(xiàn)抑制而無法擴増）17基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024HPV病毒基因L1片段缺失惡性進展和與宿主細胞DNA整合時，可以造成病毒基因片段的大量缺失，在癌癥中經(jīng)常只能檢測出E6、E7P片段18基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024“由于L1開放編碼框架在整合過程中發(fā)生缺失，使用L1引物會導(dǎo)致2–3%的假陰性結(jié)果”Caponeetal,ClinCancerResearch2000,6:4171-4175“使用共同的L1引物，擴增后結(jié)果顯示，在56份樣本中有23例的L1片段缺失”

Karlsenetal,JCM1996,34(9):2095-2100(Invasivecervicalcarcinomapopulation)“在PCR檢測系統(tǒng)中，應(yīng)該使用多種共同引物和型別特異性引物”Karlsenetal,JCM1996,34(9):2095-2100(Invasivecervicalcarcinomapopulation)子宮頸癌篩查不容漏診19基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024L1基因段缺失的影響“我們使用2種引物對10個病人進行檢測，其中8人HPV檢測發(fā)現(xiàn)在鱗狀上皮細胞癌中HPV的陽性有差異，以L1段為引物的結(jié)果為陰性，而以特異性E6為引物的結(jié)果為陽性。Monk等人已經(jīng)描述了這同一發(fā)現(xiàn)。我們認為在HPVDNA整合的過程，L1基因段可能已經(jīng)缺失了?！盨aoPauloMedJ/RevPaulMed2002;120(1):20-2非典型性鱗狀上皮細胞濕疣鱗狀上皮浸潤癌HPV18HPV18無癥狀的CIN3無癥狀的CIN3HPV16HPV16HPV16HPV18L1PCR+L1PCR+L1PCR+L1PCR-L1PCR缺失浸潤癌20基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024子宮頸癌篩查不容漏診“L1片段的缺失并不普遍，但是任何變異或缺失都會造成PCR的檢測結(jié)果為陰性…”UngeretalJHC1998,46(4):535-540“L1片段是病毒衣殼蛋白，在HPV病毒引發(fā)的腫瘤進展過程中是不必要的，因此很可能在HPV整合過程會導(dǎo)致L1片段的缺失”

Caponeetal,ClinCancerResearch2000,6:4171-4175“~5%的癌癥和CIN3會因為HPVL1片段的缺失而無法被檢測出來”

Lorincz(MethodsforHPVDetection);EmergingIssuesonHPVInfections:FromSciencetoPractice,Monsonego200621基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024競爭性抑制是分子診斷中的一個重要問題“內(nèi)對照檢測結(jié)果為陰性，其病毒拷貝數(shù)較高時，提示高拷貝的病毒在擴增時與內(nèi)對照發(fā)生競爭性抑制” Monitoringofinhibitorsofenzymaticamplificationinpolymerasechainreactionand evaluationofefficacyofRNAextractionforthedetectionofhepatitisCvirususing theinternalcontrol.MiyachiH,etal.ClinChemLabMed.36(8):571-5(1998)“…我們確實存在較高的競爭性抑制，且無法通過重復(fù)試驗而得以糾正。實驗樣本稀釋也會引起內(nèi)對照的擴增，而且，一個原本衣原體陽性的病例轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮越Y(jié)果” HighfrequencyofcompetitiveinhibitionintheRocheCobasAMPLICORmultiplex PCRforChlamydiatrachomatisandNeisseriagonorrhoeae,.

HamiltonMS,etal.J ClinMicrobiol.40(11):4393(2002)

“靶序列的多變性和多重感染時使用共同引物檢測引起的競爭性抑制，會降低檢測方法的敏感性” Impactofcompetitiveinhibitionandsequencevariationuponthesensitivityof malariaPCR,BialasiewiczS,etal.JClinMicrobiol.45(5):1621-3(2007)

22基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024競爭性抑制在每個反應(yīng)中，兩種型別為了有限的擴增引物等發(fā)生競爭

1xType16DNA100XType11DNA即使16型HPVDNA存在，也無法被檢測出來+100xType11Type1623基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024HC2技術(shù)不存在競爭性抑制被檢測的病毒與充足的RNA探針雜交雜交體被足量的抗體捕獲和檢測DNARNAType11Type1624基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024β-globinβ-globinβ-globinβ-globinβ-globinβ-globinβ-globinHPVHPVHPVHPVHPVHPVHPVβ-globinHPVHPVβ-globin競爭性反應(yīng)的結(jié)局是造成假陰性結(jié)果““β-蛋白和HPV都是通過L1共同引物進行聯(lián)合擴增，這會降低HPV檢測的敏感性”Coutleeetal.JCM2002;40(3):902-907“在17例樣本中有15例，在進行聯(lián)合擴增時至少有1種HPV型別無法檢測到…因此應(yīng)該在PCR的檢測中避免HPV和β-蛋白發(fā)生競爭性抑制”Coutleeetal.JCM2002;40(3):902-907PCR反應(yīng)體系中的β-蛋白競爭25基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024基于PCR的分析檢測在宮頸癌篩查應(yīng)用的局限３很難標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一化，不同的方法結(jié)果不同，結(jié)果很難進行比較由于引物、反應(yīng)體系很難等條件很難統(tǒng)一，結(jié)果重復(fù)性差，結(jié)果很難向病人解釋需要標(biāo)準(zhǔn)化的實驗室，和專業(yè)的技術(shù)人員，不易于普及26基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024實驗室內(nèi)/間的可重復(fù)性缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)PCR引物的選擇聚合酶樣本純化擴增反應(yīng)周期底物實驗室操作人員27基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用中劣勢5/8/2024“…7個不同實驗室使用HC2檢測試劑…數(shù)據(jù)顯示了高度的可重復(fù)性.”

Carozzietal,AmJClinPathol2005;124(5):716-721“HC2

HPVDNA檢測沒有出現(xiàn)因污染而造成的假陽性結(jié)果，并且多個實驗室之間的可重復(fù)性高達98%.”

Bozzettietal,AnnEpid2000;10(7):466“重要的是注意到HC2顯示出實驗室之間高度的一致性...”

Castleetal,AmJClinPath2004;122:238-245“PCR的可重復(fù)性：重復(fù)分析達到96%的一致性，分析同一天配對樣本（89%的一致性），實驗室之間的一致性88%.”Kuypersetal,JCM1993;31(4):1003-1006HC2PCR“用于HPVDNA檢測在實驗室內(nèi)的重復(fù)性為86%到98%。排除HPV檢測的陰性結(jié)果，實驗室內(nèi)的一致性從78%到96%”Kornegayetal,JCM2003;41(3):1080-1086

“…診斷的重復(fù)性…總體為90.7%（任何HPV型別），特異性型別的HPV診斷重復(fù)性為76.9%.”Danieletal,JCV2000;19:187-193

實驗室內(nèi)、實驗室間的可重復(fù)性28基于PCR方法的HPV檢測方法和在宮頸癌應(yīng)用