細胞的傳代凍存復蘇

細胞傳代、凍存與復蘇1細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024細胞培養(yǎng)的基本概念

傳代：細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。

原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。

2細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿原代培養(yǎng)期傳代期衰退期3細胞的傳代凍存復蘇5/9/20244細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024有限細胞系，無限細胞系

細胞系

cellline細胞株

cellstrain初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（FiniteCellLine）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系（InfiniteCellLine）。從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。

5細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024培養(yǎng)細胞的特性

培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞6細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024

每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）7細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時8細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學合成的功能基團）9細胞的傳代凍存復蘇5/9/202410細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024潛伏期此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。11細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。12細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性13細胞的傳代凍存復蘇5/9/202414細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024培養(yǎng)細胞生長的條件1細胞的營養(yǎng)需要2細胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

滲透壓

3無污染

4無毒15細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024

實驗準備實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管16細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

17細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024

超凈臺

超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

18細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024濾器19細胞的傳代凍存復蘇5/9/202420細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。21細胞的傳代凍存復蘇5/9/202422細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024自動雙重純水蒸餾器純水儀23細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024酶標儀微孔板震蕩器24細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024培養(yǎng)板25細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024

培養(yǎng)瓶26細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024

浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干常用玻璃器皿清洗27細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用消化液：28細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染

29細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024合成培養(yǎng)基:合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。30細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

31細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分32細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死．但支持細胞生長一般需加10％血清．對于血清支持細因生長的生物學效應已得到證明，但對血清中的復雜成分至今尚未完全清楚．血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學特性是細胞和復雜血清因子的綜合反應。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞．33細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細胞株，近20多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準確性、可重復性和穩(wěn)定性，，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產(chǎn)物的程序。34細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024向無清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的。適用于某種細胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細胞株的生長。即使同源組織的不同細胞株，所需補加物也不同。

無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清35細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌36細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定37細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100卑位／毫升38細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024培養(yǎng)基的配制RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g

青、鏈霉素各100單位／毫升

加三蒸水至1000ml,過濾除菌。

調(diào)節(jié)pH值至7.2

加血清（終濃度10％）

39細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024細胞傳代方法

根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種。1.懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。40細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024貼壁生長細胞傳代方法：1.吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2.加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2-10min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4.用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。5.吸取1/10—1/40細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。6.加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。7.將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。41細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024細胞計數(shù)血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞Coulter計數(shù)儀：人工計數(shù)42細胞的傳代凍存復蘇5/9/202443細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024培養(yǎng)細胞活力測定細胞活力測定是腫瘤體外研究中應用最廣的技術(shù)手段之一。

任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。1.細胞克隆形成率實驗：

單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬勺溆脕肀硎炯毎脑鲋衬芰?。

克隆形成率比＝克隆形成數(shù)／接種細胞數(shù)缺點：操作繁瑣優(yōu)點：精確、可靠44細胞的傳代凍存復蘇5/9/20242.臺盼藍法活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占細胞中的百分比表示細胞恬力

已淘汰45細胞的傳代凍存復蘇5/9/20243.四唑鹽（MTT）比色法

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍，四唑鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。46細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024操作步驟（1）單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗目的決定培養(yǎng)時間）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時。（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。（4）酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長570納米）。記錄結(jié)果，繪制47細胞的傳代凍存復蘇5/9/202448細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024

什么時候傳代？

49細胞的傳代凍存復蘇5/9/202450細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024細胞消化的最佳程度51細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024細胞凍存和復蘇細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。52細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024

凍存和復蘇的原則：慢凍快融當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。53細胞的傳代凍存復蘇5/9/2024慢凍程序標準程序：當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min

當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min