酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù)

第六章酶抑制法和

免疫測(cè)定技術(shù)學(xué)習(xí)指南觀察思考課外閱讀復(fù)習(xí)自測(cè)退出本章演示文稿本章目錄遼農(nóng)職院工程系質(zhì)檢中心2024年5月9日1酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024目的要求：生物測(cè)定技術(shù)以其簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、樣品量少而得到迅速發(fā)展，應(yīng)用酶抑制技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、生物技術(shù)等快速測(cè)定農(nóng)藥殘留，已成為一定的市場(chǎng)需求，但此類方法仍只能達(dá)到定性和半定量的水平。通過本章的學(xué)習(xí)，目的是使學(xué)生掌握酶制技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)等常用的快速測(cè)定農(nóng)藥殘留的方法，了解與免疫法相關(guān)的一些知識(shí)。學(xué)習(xí)要點(diǎn)

1、一般了解：農(nóng)藥殘留生物檢測(cè)技術(shù)的問題和展望。

2、一般掌握：生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。

3、重點(diǎn)掌握：酶抑制技術(shù)；酶聯(lián)免疫技術(shù)；生物技術(shù)等快速測(cè)定農(nóng)藥殘留方法等。學(xué)習(xí)指南2酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024第六章酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù)本節(jié)首頁(yè)退出本章一、酶抑制分析測(cè)定法1、酶法概述2、酶法檢驗(yàn)原理3、酶原4、底物與顯色劑5、測(cè)定方法二、免疫檢測(cè)技術(shù)1、免疫反應(yīng)2、免疫分析3、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法4、農(nóng)藥抗體制備5、ELISA法的特點(diǎn)3酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章一、酶抑制分析測(cè)定法1、酶法概述4酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章真性膽堿酯酶與膽堿能神經(jīng)的生理功能極為密切。其生理功能是，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)到達(dá)膽堿能神經(jīng)末梢時(shí)，突觸小泡內(nèi)的Ach外排至突觸間隙，作用于突觸后膜的膽堿能受體，引起下一級(jí)神經(jīng)元或效應(yīng)器的激發(fā)。在正常生理?xiàng)l件下，Ach完成傳遞沖動(dòng)作用后，隨即被突觸后膜上的AchE在數(shù)毫秒內(nèi)水解，生成乙酸和膽堿。2、酶法檢驗(yàn)原理5酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章神經(jīng)性毒劑分子中含有親電子的正磷原子(Pδ+)，它與Ach分子中的正碳原子(Cδ+)同樣具有親電子性質(zhì)。但神經(jīng)性毒劑的親電子能力此Ach強(qiáng)，這是因?yàn)槎緞┓肿又?，P＝O和P-F鍵上的O、F原子相對(duì)電負(fù)性比P原子大得多(相對(duì)電負(fù)性P＝2.1，O＝3.5，F(xiàn)＝4.0，C&S＝2.5)。因此，相對(duì)電負(fù)性大的O、F原子吸收電子成為負(fù)極，使P成為低電子密度的正極，即P原子帶有較多的正電荷和更強(qiáng)的親電子能力。所以神經(jīng)性毒劑對(duì)AchE有更大的親和力和抑制力。(1)神經(jīng)性毒劑對(duì)AchE的抑制機(jī)理6酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章膽堿酯酶根據(jù)其水解基質(zhì)的專一性和速度不同分真性膽堿酯酶和假性膽堿酯酶，前者又稱乙酰膽堿酯酶(AchE)，后者包括丁酰膽堿酯酶(BuchE)和丙酰膽堿酯酶(PrchE)。假陽性：水果、蔬菜的提取物中含有對(duì)有抑制作用的雜質(zhì)，如氯代煙堿類物質(zhì)。(2)對(duì)膽堿酯酶的抑制作用①假陽性7酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章敵敵畏乙酰膽堿AchE②產(chǎn)生假陽性的作用機(jī)理8酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/20243、酶原本節(jié)首頁(yè)退出本章蜜蜂頭的腦酯酶液條件：3日齡，-20℃0.24g/ml磷酸緩沖液（pH7.5）保質(zhì)期：3個(gè)月9酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/20244、底物與顯色劑本節(jié)首頁(yè)退出本章乙酰膽堿+H2O→膽堿+乙酸pH為6.2（黃）→7.6（藍(lán)色）（1）乙酰膽堿-溴百里酚藍(lán)10酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章乙酸-β-萘酯固藍(lán)B鹽+H2O→β-萘酚+乙酸（紫紅色）（2）乙酸-β-萘酯固藍(lán)B鹽11酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章（3）乙酸羥基吲哚顯色法乙酸羥基吲哚+H2O→吲哚酚+乙酸吲哚酚+O2→靛藍(lán)（藍(lán)色）12酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章（4）乙酸靛酯顯色法乙酸靛酯+H2O→靛酚藍(lán)（藍(lán)色）+乙酸13酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024水解加酶顯色劑未水解顯色劑不顯色顯色5、測(cè)定方法（1）測(cè)定原理無農(nóng)藥有農(nóng)藥14酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/20245、測(cè)定方法加入20ml提取試劑提取

取2g樣品（非葉菜類取4g），切碎取樣振蕩1~2min抑制反應(yīng)將上清液倒入試管中，靜止3min，加入50ul酶，3ml樣品提取液，50ul顯色劑培養(yǎng)倒入比色杯測(cè)定儀器測(cè)定（2）、比色法15酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章（3）、酶片法酶片為浸漬有膽堿酯酶的或其他敏感酯類的濾紙片或類似載體物質(zhì)，其基本技術(shù)原理與比色法相同。16酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章6、技術(shù)問題（1）分析對(duì)象：有機(jī)磷、氨基甲酸酯類（2）靈敏度不高，需用GC進(jìn)一步定性和定量、重現(xiàn)性不好（3）農(nóng)藥含量影響酶抑制程度（4）影響因子：酶的濃度、溫度、pH17酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章二、免疫檢測(cè)技術(shù)Pathogen18酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/20241、免疫反應(yīng)本節(jié)首頁(yè)退出本章免疫反應(yīng)：細(xì)菌、病毒→入侵→抵御的抗體，即識(shí)別和排除進(jìn)入體內(nèi)的抗原性異物的保護(hù)性反應(yīng)?？乖和鈦砦?9酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/20242、免疫分析本節(jié)首頁(yè)退出本章免疫分析：以抗原和抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法。免疫反應(yīng)特點(diǎn)：高度選擇性。20酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章3、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法ELISA（EnzymeLinkedImmuno-SorbentAssay)原理：在測(cè)定過程中，樣品提取液中的農(nóng)藥與已知數(shù)量的酶聯(lián)劑競(jìng)爭(zhēng)有限數(shù)量的抗體吸附位點(diǎn)。（加入顯色劑）21酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024（1）、直接ELISA原理AgAg*AbSPAbAb：Ag：Ag*22酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024（2）、間接ELISA原理AgAb*SPAg：AbAgAg：AbAb*Ag：Ab：Ab*23酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章4、農(nóng)藥抗體制備Antibody（Ab）：動(dòng)物肌體某些活性細(xì)胞在某些物質(zhì)（抗原）刺激下產(chǎn)生，并能與這些物質(zhì)特異性結(jié)合的一類活性物質(zhì)。24酶抑制法和免疫測(cè)定技術(shù).5/9/2024本節(jié)首頁(yè)退出本章5、ELISA法的特點(diǎn)（1）適用于常規(guī)方法無法測(cè)定的農(nóng)藥（2）適用于環(huán)境監(jiān)控（