間充質干細胞的傳代

間充質干細胞的傳代間充質干細胞的傳代間充質干細胞的傳代一、實驗目的1、

掌握大鼠骨髓間充質干細胞原代培養(yǎng)的方法。2、

熟練掌握間充質干細胞的傳代、凍存和復蘇的操作過程。3、

掌握間充質干細胞表面抗原的鑒定方法。4、通過誘導間充質干細胞成脂、成骨分化，鑒定間充質干細胞的多向分化潛能，并掌握其誘導分化的方法。2021/1/1225/9/20241間充質干細胞的傳代一、實驗目的

1、

掌握大鼠骨髓間充質干細胞原代培養(yǎng)的方法。2、

熟練掌握間充質干細胞的傳代、凍存和復蘇的操作過程。3、

掌握間充質干細胞表面抗原的鑒定方法。4、通過誘導間充質干細胞成脂、成骨分化，鑒定間充質干細胞的多向分化潛能，并掌握其誘導分化的方法。

5/9/20242間充質干細胞的傳代二、實驗材料、試劑與器材

1材料：100-150gSD大鼠。2試劑：乙醚，75%酒精，L-DMEM低糖培養(yǎng)基，胎牛血清，小牛血清，Percoll細胞分離液，1.5MNaCl溶液，0.25%胰酶，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠CD29抗體，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠CD90抗體，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠CD71抗體，PE標記的羊抗鼠CD106抗體，F(xiàn)ITC標記的羊抗CD45抗體，β-甘油磷酸鈉，地塞米松，維生素C，Hoechst33258，油紅O，20g/L硝酸鈷溶液，20g/L硫化銨，50%甘油，多聚賴氨酸（PLL）。

3儀器：細胞培養(yǎng)箱，微量移液器，倒置相差顯微鏡，細胞培養(yǎng)皿，熒光顯微鏡，電子天平，pH計，離心機，超凈工作臺，電熱恒溫鼓風干燥箱，電熱恒溫水槽，超聲波清洗機，立式壓力蒸汽滅菌器。

5/9/20243間充質干細胞的傳代三、實驗原理間充質干細胞最早發(fā)現(xiàn)于骨髓中，其具有高度增殖和自我更新能力，但骨髓中MSCs的含量很低，約為0.01%。分離間充質干細胞的方法主要有三種：①全骨髓貼壁培養(yǎng)法；②密度梯度離心法；③根據(jù)間充質干細胞的表面標志，利用流式細胞儀進行分選。在本實驗中所用的是密度梯度離心法，即利用Percoll將大部分造血細胞和單個核細胞分離、經(jīng)過體外貼壁培養(yǎng)換液去除懸浮生長的造血干細胞、分離獲得MSC的純度達到90%左右。間充質干細胞沒有特異性表面抗原，表達CD29、CD44、CD71、CD90等基質細胞和間質細胞的特異性表面標志抗原。本實驗選擇了CD29、CD44、CD90、CD71、CD106和CD45進行檢測。5/9/20244間充質干細胞的傳代間充質干細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化能力，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自發(fā)分化，在體外特定條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞，脂肪細胞等多種中胚層來源的細胞，不僅如此，它還可跨胚層分化為神經(jīng)元細胞，胰島細胞等。

5/9/20245間充質干細胞的傳代（一）骨髓間充質干細胞的原代培養(yǎng)

1.取體重100-150g的大鼠，乙醚麻醉，頸椎脫臼處死，75%的酒精浸泡消毒5min。2.將大鼠腹部朝上，四肢用注射器針頭固定于泡沫板，呈“大”字形，用剪刀，鑷子將兩后肢皮膚剪開，換另一套剪刀、鑷子分離肌肉、肌腱，將股骨、脛骨剝離出來，放入裝有75%酒精的燒杯中，移入超凈臺。3.將脛骨、股骨取出放入培養(yǎng)皿中加入10mlPBS緩沖液，用潔凈的剪刀、鑷子進一步剝離骨頭上的肌肉、肌腱組織。4.將剝離干凈的骨頭用少量PBS沖洗后，放入另一培養(yǎng)皿，加入12mlDMEM完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中剪斷骨干兩端，用2ml注射器吸取培養(yǎng)基插入一頭斷端將骨髓從另一頭沖出，反復吹打使骨髓分散，制成均勻的細胞懸液。

5/9/20246間充質干細胞的傳代5.另取一干凈離心管A，加入10mlPercoll分離液。將吹打均勻的細胞懸液沿傾斜30o緩緩加入，切記不能沖破Percoll分離液面，用8mlDMEM完全培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿，后用同樣的方法將其加入離心管A。6.2500~3000r/min，離心30min后，可見離心管A中液體基本分三層，用吸管吸去上層紅色培養(yǎng)基層，將吸管伸至中間白色絮狀層將其緩慢吸出，移至另一干凈離心管B，切記吸取時不可用力過猛而將沉于管底的紅細胞吸上來。7.將20mlPBS加入離心管B，反復吹打混勻，1800r/min離心10min。8.棄上清，重復步驟7。9.棄上清，加入5ml完全培養(yǎng)基，吹打混勻，接種于培養(yǎng)瓶中。

5/9/20247間充質干細胞的傳代【實驗結果與分析】每天注意觀察培養(yǎng)的原代細胞的形態(tài)，并拍照記錄。

5/9/20248間充質干細胞的傳代【思考題】1、密度梯度離心法的原理是什么？2、間充質干細胞的原代培養(yǎng)過程是什么，有哪些方面是需要注意的？5/9/20249間充質干細胞的傳代(二)

間充質干細胞的傳代、凍存及復蘇

1.當細胞融合度達到90%左右時，將培養(yǎng)液吸出，加入PBS沖洗細胞兩次。2.加入0.25%的胰酶2ml，置于37℃培養(yǎng)箱中2~3min，取出在顯微鏡下觀察，當80~90%的細胞回縮成圓形，振搖后脫離瓶底時，移入超凈臺。3.傳代：加入3mlDMEM完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復吹打瓶底，將細胞懸液移入離心管中，1200r/min，離心10min。棄上清，加入10ml培養(yǎng)基吹打混勻。接種于兩個培養(yǎng)瓶中。4.凍存：加入3mlDMEM完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復吹打瓶底，將細胞懸液移入離心管中，1200r/min，離心10min。棄上清，加入1ml凍存液（FCS：DMSO：L-DMEM=2：1：7）吹打混勻，置于凍存管中，4℃放置30~40min，-20℃

放置1h，-80℃過夜，再移入液氮罐中。

5/9/202410間充質干細胞的傳代1.

復蘇：1)將細胞從液氮中取出，37℃輕微搖晃，使細胞快速融化。2)75％酒精擦拭凍存管，將細胞轉移到離心管中，加入5ml培養(yǎng)基，1000r/min離心5min。3）棄上清，加入5ml完全培養(yǎng)基混勻細胞，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。

5/9/202411間充質干細胞的傳代【實驗結果與分析】試述細胞傳代培養(yǎng)的、凍存及復蘇的過程，以及各環(huán)節(jié)的注意事項?！舅伎碱}】1、細胞傳代培養(yǎng)的目的是什么？2、細胞凍存與復蘇的原則是什么，怎么操作？凍存液的成分以及作用是什么？

5/9/202412間充質干細胞的傳代（三）BMSCs鑒定

1BMSCs表面抗原鑒定：1）22×22mm蓋玻片酸缸浸泡過夜，自來水沖洗10次，三蒸水沖洗3次，浸泡于75%酒精中備用。2）包被時取出75%酒精中的蓋玻片，在酒精燈上烘干，放入35mm2培養(yǎng)皿中，吸取0.5ml濃度為50μg/ml的多聚賴氨酸滴加在蓋玻片上，37℃放置1h，回收多余的多聚賴氨酸。經(jīng)紫外線照射30min,后在超凈工作臺內內晾干。

5/9/202413間充質干細胞的傳代3）將預先經(jīng)過滅菌處理并包被多聚賴氨酸的蓋玻片置于35mm2培養(yǎng)皿中，將第5代BMSCs用0.25%胰酶消化，按1×105/ml密度接種，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。4）待細胞70%匯合時細胞去除培養(yǎng)基，進行免疫熒光染色鑒定其表面抗原CD29、CD34、CD45、CD71、CD90、CD106的表達。用PBS清洗，加入4%多聚甲醛固定，4℃過夜。PBS洗3次后，分別滴加用PBS+NaN3(0.02%)+BSA(3%)+TritonX-100(0.2%)稀釋的單克隆抗體孵育，室溫90min。PBS洗3次。細胞核用Hoechst33258染色，室溫放置5min并沖洗。用50%甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

5/9/202414間充質干細胞的傳代【實驗結果與分析】觀察表面抗原的免疫熒光染色結果：【思考題】1、免疫熒光染色的步驟是什么，需要注意什么？2、怎樣用熒光顯微鏡拍攝熒光照片？

5/9/202415間充質干細胞的傳代A.

第五代骨髓間充質干細胞的形態(tài)學特征：長梭形（黑色箭頭）和扁平形（紅色箭頭），Bar=50μm

5/9/202416間充質干細胞的傳代B-H.第五代BMSCs的免疫熒光鑒定結果（藍色為Hoechst33258染色，顯示細胞核）5/9/202417間充質干細胞的傳代2、BMSCs的誘導分化1)成脂誘導：將骨髓間充質干細胞以4×103/cm2的接種密度培養(yǎng)在35mm培養(yǎng)皿里，待細胞融合后將含10%NCS的低糖DMEM生長培養(yǎng)液換為成脂肪分化誘導液（高糖DMEM+10%血清+10μg/ml胰島素+1μM地塞米松+100μM吲哚美辛+0.5mM3-isobutyl-1-methylxanthine）培養(yǎng)，每隔3d換誘導液一次，持續(xù)誘導培養(yǎng)6d。

然后用維持液（高糖DMEM+10%胰島素）繼續(xù)培養(yǎng)細胞3d。各組細胞用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定10min，油紅O工作液浸染10min，60%異丙醇洗去多余染液，PBS沖洗3次，蘇木精復染3-5min，PBS漂洗10min。鏡下觀察并攝影。

5/9/202418間充質干細胞的傳代2)成骨誘導：將骨髓間充質干細胞以4×103/cm2的接種密度培養(yǎng)在35mm培養(yǎng)皿里，12h后將含10%NCS的低糖DMEM生長培養(yǎng)液換為成骨誘導液培養(yǎng)，每隔3d換誘導液一次，持續(xù)誘導培養(yǎng)30d后用鈣鈷染色鑒定成骨細胞。取成骨誘導30d的BMSCs，棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，置95%乙醇固定液中固定10min涼干。置基質液中，37℃孵育4～6h（防止水分蒸發(fā)）。取出放入20g/L硝酸鈷溶液中5min，流水沖洗，加入20g/L硫化銨（新鮮配制）溶液中作用5min。流水沖洗，伊紅復染5min，沖洗、晾干鏡檢。

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