項(xiàng)目17-4 柱層析結(jié)晶法提取溶菌酶

項(xiàng)目17-4柱層析結(jié)晶法提取溶菌酶

1.

提取原理?yè)v碎后的雞蛋殼膜經(jīng)過(guò)低濃度的鹽溶液處理后，溶菌酶即被抽出來(lái)。由于溶菌酶在酸性條件下具有較好的耐熱性，而且又具有較高的等電點(diǎn)，因此可以用熱變性與等電點(diǎn)沉淀下結(jié)合的方法除去抽提液中的大部分雜蛋白；再利用溶菌酶在酸性條件下能與聚丙烯酸結(jié)合形成凝聚物，而當(dāng)有鈣離子存在時(shí)溶菌酶又能從這種凝聚物中分離出來(lái)的特性，將抽提液進(jìn)行純化和濃縮；然后利用柱層析將濃縮液進(jìn)行分離純化；最后，利用結(jié)晶和重結(jié)晶的方法制得溶菌酶晶體。

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2.

主要藥品1%氯化鈉-0.05mol/L鹽酸溶液：稱取氯化鈉5g，先以少量蒸餾水溶解，再加2mol/L鹽酸12.5ml，最后加水定容至500ml10%聚丙烯酸：按每10g聚丙烯酸加蒸餾水90ml，臨用時(shí)配制。

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3．加工技術(shù)要點(diǎn)(1)裝柱稱取市售陽(yáng)離子交換樹(shù)脂CM-Sephadex若干，加入適量蒸餾水溶脹8h左右，溶脹過(guò)程中應(yīng)輕輕攪拌幾次以便于溶脹結(jié)束后去除漂浮物及雜質(zhì)。再用新配制的相當(dāng)于樹(shù)脂體積4倍的2mol/L氫氧化鈉溶液浸泡數(shù)小時(shí)后，用蒸餾水沖洗至中性，然后裝柱（柱的大小視加工規(guī)模而定）。并用0.6%的氯化鈉溶液若干唷過(guò)平衡裝柱過(guò)程中注意切勿讓空氣進(jìn)入形成氣泡。

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3．加工技術(shù)要點(diǎn)(2)抽提稱取新鮮雞蛋殼若干，將其徹底搗碎后置于瓷盆內(nèi)，加入其1倍體積量的1%氯化鈉-0.05mol/L鹽酸溶液并間歇攪拌，以便抽提順利進(jìn)行。測(cè)試混合液的PH是否6為，如過(guò)高或過(guò)低，則應(yīng)分別用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)。向?yàn)V渣中再加入其半倍體積量的1%氯化鈉-0.05mol/L鹽酸溶液重復(fù)抽提1~2次，合并濾液。

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3．加工技術(shù)要點(diǎn)(3)除雜蛋白測(cè)定上述濾液的PH是否為4.5，如若不是，則視具體情況用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)到PH4.5左右。預(yù)先準(zhǔn)備好沸水浴，將濾液置于沸水浴中迅速升溫至75℃左右，全過(guò)程3min左右完成。在此條件下溶菌酶不易變性而其它蛋白質(zhì)則不然。用冷水冷卻后高速離心15min（如無(wú)離心設(shè)備，亦可靜置數(shù)小時(shí)后再過(guò)濾并收集起濾液）其沉淀物為熱變性雜蛋白。而溶菌酶則仍在上清液中，收集起上清液供下步使用。

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3．加工技術(shù)要點(diǎn)(4)濃縮量出上清液的體積。邊攪拌邊緩慢加入約為上清液體積1/4的濃度為10%的聚丙烯酸，則可發(fā)現(xiàn)有凝聚物出現(xiàn)。凝聚物出現(xiàn)后便很快沉淀并粘附于容器底部。靜置半小時(shí)后，傾掉上清液，緩慢加入少量0.5mol/L碳酸鈉溶液使凝聚物充分溶解，然后邊攪拌邊緩慢加入適量的氯化鈣溶液（體積約為聚丙烯酸量的1/12），片刻后過(guò)濾，將沉淀物壓干后另用，收集起濾液。

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3．加工技術(shù)要點(diǎn)(5)柱層析量出上述濾液的體積，向?yàn)V液中緩慢加入氯化鈉粉末，使氯化鈉的最終濃度達(dá)5%，并邊入邊攪拌以促使其迅速溶解，然后慢慢地將此液加入CM-Sephadex柱中，上柱完畢后用0.6%的氯化鈉洗脫液洗脫，收集起洗脫液直到溶菌酶全部從柱上洗脫為上。

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3．加工技術(shù)要點(diǎn)(6)結(jié)晶和重結(jié)晶上述洗脫液中主要成分為較高線純度的溶菌酶。用2mol/L的氫氧化鈉溶液將此洗脫液的pH調(diào)節(jié)到10。按溶液體積加入氯化鈉粉霜使成5%濃度，再加入少量的溶菌酶晶體作為晶種后，將其置于冰箱內(nèi)，在0～4℃的條件下進(jìn)行結(jié)晶，等晶體結(jié)晶完全后減壓抽濾并收集起結(jié)晶，此結(jié)晶經(jīng)放有五氧化二磷及石蠟的真空干燥器中干燥后即得溶菌酶成品，低溫下保存等待出售。職認(rèn)為純度不中，可利用重結(jié)晶的方法進(jìn)一步提純。

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4．注意事項(xiàng)第四步中生成的沉淀物主要成分為聚丙烯酸鈣，可用于回收聚丙烯酸。其具體做法是，將此沉淀物加入適量的硫酸溶液中，片刻后濾去硫酸鈣沉淀，便得聚丙烯酸溶液；為了提高酶的濃度以利結(jié)晶生成，可利用透析法將洗脫液濃縮，具體做法是，將洗脫液裝入透析袋內(nèi)

，置于裝有聚乙二醇的容器中，酶液中的