細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法P

主講老師：陳郁生物制藥技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法目錄CONTENTS01、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的原理03、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法02、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的試劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的原理PART01本法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的原理陽(yáng)性結(jié)果PART02細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的試劑鱟試劑鱟試劑是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可以與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)。除了內(nèi)毒素，鱟試劑還與某些β-葡聚糖反應(yīng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。如遇含有β-葡聚糖的樣品，可使用去G因子鱟試劑或G因子反應(yīng)抑制劑來(lái)排除鱟試劑與β-葡聚糖的反應(yīng)。鱟試劑的生物活性以其能檢出細(xì)菌內(nèi)毒素的最低有效濃度表示，即鱟試劑的靈敏度，單位為EU/ml。當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的試劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的試劑細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品

系自大腸埃希菌提取精制得到的內(nèi)毒素，用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)定，仲裁鱟試劑靈敏度。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測(cè)定法）且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾作用的滅菌注射用水。PART02細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法凝膠法限度檢測(cè)半定量檢測(cè)光度測(cè)定法

濁度法（終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法）顯色基質(zhì)法（終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法）凝膠法：最簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用最廣泛，中國(guó)藥典的“仲裁”方法對(duì)干擾相對(duì)不敏感。較光度測(cè)定法不靈敏刻度吸管、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小試管（16×100mm）、試管架、洗耳球、封口膜或金屬試管帽、時(shí)鐘、脫脂棉、吸水紙、剪刀砂輪。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、30分鐘以上）去除，塑料用具應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械（目前多為無(wú)熱原的一次性用品）。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法一、打開(kāi)凈化工作

使用前開(kāi)啟紫外線滅菌燈，開(kāi)啟30分鐘以上關(guān)閉，啟動(dòng)送風(fēng)機(jī)，通風(fēng)30分鐘以上再使用。二、細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的制備取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，輕彈瓶壁，沿切割點(diǎn)開(kāi)啟，加入1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置渦旋混合器上混合15min。取經(jīng)干烤后的無(wú)熱源玻璃試管若干，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，然后進(jìn)行稀釋?zhuān)苽涑?λ和2λ的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。每稀釋一步均應(yīng)在渦旋混合器上混合30S。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法

取供試品1支，小心開(kāi)啟瓶蓋，加細(xì)菌內(nèi)毒檢查用水使其溶解。置旋渦混合器上搖勻，使其充分溶解。取經(jīng)干烤后的無(wú)熱源玻璃試管若干，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，將供試品進(jìn)行稀釋?zhuān)苽涑蓾舛葹?C和C的供試品溶液，備用，每稀釋一步均應(yīng)在渦旋混合器上混勻。三、供試品溶液的制備四、供試品陽(yáng)性對(duì)照的制備

移取濃度為2C的供試品溶液，加入等體積的濃度為4λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在渦旋混合器上混合30S，備用。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法五、鱟試劑反應(yīng)1.鱟試劑的準(zhǔn)備取鱟試劑8支，輕彈瓶壁，置鱟試劑架上，開(kāi)啟后加入0.1ml（標(biāo)示量）細(xì)菌內(nèi)毒檢查用水復(fù)溶，其中2支陽(yáng)性對(duì)照管，2支陰性對(duì)照管，2支供試品陽(yáng)性對(duì)照管，2支供試品檢查管。2.加樣加樣前將提前配制好的溶液再次置渦旋混合器上混勻（如放置時(shí)間過(guò)久）。每支陽(yáng)性對(duì)照管加入0.1ml濃度為2λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，陰性對(duì)照管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，供試品陽(yáng)性對(duì)照管加入內(nèi)毒素濃度為2λ的供試品溶液，供試品管加入0.1ml供試品。加樣結(jié)束后將管中溶液輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法六、試管恒溫儀操作1、打開(kāi)電源儀器進(jìn)入初始化，并伴隨“嘀”的聲音。2、查看設(shè)置溫度、時(shí)間設(shè)置溫度為37.0℃，保溫時(shí)間為60min。3、開(kāi)始工作將加樣完成的鱟試劑按順序垂直放入試管恒溫儀中，按“run”或“start”鍵“*”或“：”開(kāi)始閃動(dòng)，進(jìn)入控溫階段，恒定溫度后，計(jì)時(shí)器開(kāi)始計(jì)時(shí)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法4、結(jié)果觀察將鱟試劑從試管恒溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠并且不變形，不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。5、結(jié)果判斷陽(yáng)性對(duì)照管均為陽(yáng)性，陰性對(duì)照管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照管均為陽(yáng)性，則試驗(yàn)有效。若供試品檢查管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；若供試品檢查管