高三生物多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件

高三生物多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件一、基礎(chǔ)知識（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第2頁,共121頁，2024年2月25日，星期天一、基礎(chǔ)知識1、組成元素（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第3頁,共121頁，2024年2月25日，星期天一、基礎(chǔ)知識C、H、O、N、P1、組成元素（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第4頁,共121頁，2024年2月25日，星期天一、基礎(chǔ)知識C、H、O、N、P1、組成元素2、基本單位（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第5頁,共121頁，2024年2月25日，星期天一、基礎(chǔ)知識C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第6頁,共121頁，2024年2月25日，星期天一、基礎(chǔ)知識C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)第7頁,共121頁，2024年2月25日，星期天脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式第8頁,共121頁，2024年2月25日，星期天OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖第9頁,共121頁，2024年2月25日，星期天連接第10頁,共121頁，2024年2月25日，星期天連接ATGC第11頁,共121頁，2024年2月25日，星期天連接ATGCATGC第12頁,共121頁，2024年2月25日，星期天連接ATGCATGC第13頁,共121頁，2024年2月25日，星期天連接ATGCATGC3'端（含羥基）第14頁,共121頁，2024年2月25日，星期天連接ATGCATGC5'端含磷酸基團(tuán)3'端（含羥基）第15頁,共121頁，2024年2月25日，星期天連接ATGCATGC5'端含磷酸基團(tuán)3'端（含羥基）3'端第16頁,共121頁，2024年2月25日，星期天連接ATGCATGC5'端含磷酸基團(tuán)3'端（含羥基）3'端5'端第17頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)第18頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)①DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)第19頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)①DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)②脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè)第20頁,共121頁，2024年2月25日，星期天③兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對。5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)第21頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（三）DNA的復(fù)制2、時期3、場所1、概念第22頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（三）DNA的復(fù)制2、時期3、場所1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程第23頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（三）DNA的復(fù)制2、時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程第24頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（三）DNA的復(fù)制2、時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所細(xì)胞核（主）、線粒體、葉綠體1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程第25頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、原材料6、基本條件4、模板第26頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、原材料6、基本條件4、模板DNA母鏈第27頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件4、模板DNA母鏈第28頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件酶、ATP、原料、模板4、模板DNA母鏈第29頁,共121頁，2024年2月25日，星期天7、復(fù)制過程第30頁,共121頁，2024年2月25日，星期天7、復(fù)制過程

①DNA的解旋第31頁,共121頁，2024年2月25日，星期天7、復(fù)制過程

①DNA的解旋親代DNA分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈第32頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA聚合酶的特性

DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。

第33頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

②RNA引物的合成第34頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物第35頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物

③DNA的生成第36頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物

③DNA的生成以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。第37頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

④切掉引物生成岡崎片斷第38頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷第39頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷

⑤DNA片斷的連接第40頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷

⑤DNA片斷的連接在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNA第41頁,共121頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA合成的方向從子鏈由5’端向3’端延伸第43頁,共121頁，2024年2月25日，星期天思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴(kuò)增DNA如何打開雙鏈？第44頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA復(fù)制的前提是______________；用_________________方法思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴(kuò)增DNA如何打開雙鏈？第45頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA復(fù)制的前提是______________；用_________________方法思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴(kuò)增DNA如何打開雙鏈？雙鏈的解開第46頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA復(fù)制的前提是______________；用_________________方法思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴(kuò)增DNA如何打開雙鏈？雙鏈的解開控制溫度第47頁,共121頁，2024年2月25日，星期天4.DNA分子的熱變性原理：第48頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA雙鏈4.DNA分子的熱變性原理：第49頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA雙鏈變性（加熱80-100℃）4.DNA分子的熱變性原理：第50頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）4.DNA分子的熱變性原理：第51頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）4.DNA分子的熱變性原理：第52頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：4.DNA分子的熱變性原理：第53頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：解開雙鏈4.DNA分子的熱變性原理：第54頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈4.DNA分子的熱變性原理：第55頁,共121頁，2024年2月25日，星期天DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈的結(jié)合4.DNA分子的熱變性原理：第56頁,共121頁，2024年2月25日，星期天思考：高溫使DNA解旋，但普通DNA聚合酶會失活，__________________找到耐高溫DNA聚合酶。第57頁,共121頁，2024年2月25日，星期天思考：高溫使DNA解旋，但普通DNA聚合酶會失活，__________________找到耐高溫DNA聚合酶。托馬斯.布魯克第58頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)第59頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；第60頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；第61頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；③四種脫氧核苷酸；第62頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；③四種脫氧核苷酸；④耐高溫的聚合酶；第63頁,共121頁，2024年2月25日，星期天5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；③四種脫氧核苷酸；④耐高溫的聚合酶；⑤控制溫度，但不需解旋酶。第64頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（五）

PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟第65頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（五）

PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟

PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復(fù)性和延伸第66頁,共121頁，2024年2月25日，星期天①變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。2、循環(huán)過程第67頁,共121頁，2024年2月25日，星期天靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性第68頁,共121頁，2024年2月25日，星期天②復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合第69頁,共121頁，2024年2月25日，星期天靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火第70頁,共121頁，2024年2月25日，星期天③延伸

DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈第71頁,共121頁，2024年2月25日，星期天靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸第72頁,共121頁，2024年2月25日，星期天靶序列

靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列第73頁,共121頁，2024年2月25日，星期天3、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量第74頁,共121頁，2024年2月25日，星期天3、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量第75頁,共121頁，2024年2月25日，星期天循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量第76頁,共121頁，2024年2月25日，星期天4、PCR循環(huán)的結(jié)果第77頁,共121頁，2024年2月25日，星期天4、PCR循環(huán)的結(jié)果①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸第78頁,共121頁，2024年2月25日，星期天4、PCR循環(huán)的結(jié)果②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸第79頁,共121頁，2024年2月25日，星期天95℃變性（1）PCR循環(huán)——變性第80頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（1）PCR循環(huán)——變性95℃變性第81頁,共121頁，2024年2月25日，星期天95℃變性（1）PCR循環(huán)——變性第82頁,共121頁，2024年2月25日，星期天55℃復(fù)性（2）PCR循環(huán)—復(fù)性第83頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（3）PCR循環(huán)—延伸第84頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（3）PCR循環(huán)—延伸第85頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（3）PCR循環(huán)—延伸第86頁,共121頁，2024年2月25日，星期天（3）PCR循環(huán)—延伸第87頁,共121頁，2024年2月25日，星期天第88頁,共121頁，2024年2月25日，星期天第89頁,共121頁，2024年2月25日，星期天第90頁,共121頁，2024年2月25日，星期天第91頁,共121頁，2024年2月25日，星期天4、循環(huán)特點(diǎn)：①上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板②結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無引物存于兩個子代DNA分子中③其它子代DNA分子都為雙引物分子式④處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長1×2N第92頁,共121頁，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)步驟第93頁,共121頁，2024年2月25日，星期天①準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方二、實(shí)驗(yàn)步驟第94頁,共121頁，2024年2月25日，星期天①準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分二、實(shí)驗(yàn)步驟第95頁,共121頁，2024年2月25日，星期天①準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁二、實(shí)驗(yàn)步驟第96頁,共121頁，2024年2月25日，星期天①準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁④離心10分鐘二、實(shí)驗(yàn)步驟第97頁,共121頁，2024年2月25日，星期天①準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁④離心10分鐘⑤將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序二、實(shí)驗(yàn)步驟第98頁,共121頁，2024年2月25日，星期天①準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁④離心10分鐘⑤將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序⑥電泳檢測PCR結(jié)果二、實(shí)驗(yàn)步驟第99頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。

2．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。三、操作提示第100頁,共121頁，2024年2月25日，星期天

3．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。第101頁,共121頁，2024年2月25日，星期天目的：避免外源性DNA大量擴(kuò)增造成假陽性反應(yīng)。第102頁,共121頁，2024年2月25日，星期天1、原理：DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰(圖5-11)?？梢岳肈NA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測定。四、結(jié)果分析與評價第103頁,共121頁，2024年2月25日，星期天四、結(jié)果分析與評價(了解)2、具體方法如下。1）將樣品進(jìn)行50倍稀釋：取2μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水。2）以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光

光度計(jì)(圖5-12)的讀數(shù)

調(diào)節(jié)至零。第104頁,共121頁，2024年2月25日，星期天3）加入步驟1中的DNA稀釋液100L至比色杯中，測定260nm處的光吸收值。4）根據(jù)下面的公式計(jì)算DNA含量。

DNA含量(μg/ml)=50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)第105頁,共121頁，2024年2月25日，星期天五、課題延伸第106頁,共121頁，2024年2月25日，星期天1、PCR優(yōu)點(diǎn)：五、課題延伸第107頁,共121頁，2024年2月25日，星期天原理雖然復(fù)雜，但操作卻十分簡單?？焖?、高效、靈活和易于操作。1、PCR優(yōu)點(diǎn)：五、課題延伸第108頁,共121頁，2024年2月25日，星期天原理雖然復(fù)雜，但操作卻十分簡單?？焖?、高效、靈活和易于操作。1、PCR優(yōu)點(diǎn)：2、PCR技術(shù)的意義五、課題延伸第109頁,共121頁，2024年2月25日，星期天復(fù)習(xí)：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別第110頁,共121頁，2024年2月25日，星期天復(fù)習(xí)：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；第111頁,共121頁，2024年2月25日，星期天復(fù)習(xí)：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時會變性；第112頁,共121頁，2024年2月25日，星期天復(fù)習(xí)：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時會變性；3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。第113頁,共121頁，2024年2月25日，星期天1.DNA單鏈的________末端為3'端，________末端為5'端，在DNA復(fù)制時，引物從模板鏈的______端配對結(jié)合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子鏈向下延伸。2.每次循環(huán)可以分為_________________這三個過程，對應(yīng)溫度分別為_______________________。練習(xí)第114頁,共121頁，2024年2月25日，星期天1.DNA單鏈的________末端為3'端，________末端為5'端，在DNA復(fù)制時，引物從模板鏈的______端配對結(jié)合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子鏈向下延伸。2.每次循環(huán)可以分為_________________這三個過程，對應(yīng)溫度分別為_______________________。羥基練習(xí)第115頁,共121頁，2024年2月25日，星期天1.DNA單鏈的________末端為3'端，________末端為5'端，在DNA復(fù)制時，引物從模板鏈的______端配對結(jié)合。在___________酶的作用下，引物提供____端，使子鏈向下延伸。2.每次循環(huán)可以分為_________________這三個過程，對應(yīng)溫度分別為_______________________。磷酸基團(tuán)羥基練習(xí)第116頁,共121頁，2024年2月25日，星期天1.DNA單鏈的________末端為3'端，________末端為5'端，在DNA