第三章 重組DNA技術(shù)所需的基本條件課件

第三章重組DNA技術(shù)所需的基本條件C用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞B用于基因克隆的載體A用于核酸操作的工具酶第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件A用于核酸操作的工具酶重組DNA技術(shù)所需的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的入侵細(xì)菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的類型主要特性限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列

II型

單功能 同源二聚體

2+旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列

I型

多功能 異源三聚體

2+TGAN88TGCTAACN66GTGC

III型

雙功能異源二聚體

2+

GAGCC CAGCAG切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處識(shí)別序列內(nèi)或附近距識(shí)別序列下游隨機(jī)性切割特異性切割24-26bp處第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性

識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列 大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè) 識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作

大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.50-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶MgCl22NaClDTTVolumeTT10mM0-150mM1mM20-100μl37℃1-1.5hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1μg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N66位 引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、

BglII、Sau3AI不受影響大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列 中的胞嘧啶C55位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C55位上引入甲基第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象。EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過(guò)5%（v/v）時(shí)，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA連接酶DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HClMgCl22ATPDTTVolume50-100mMpH7.510mM0.5-1mM5mM10-20μlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1μgλ-DNA（HindIII片段）所需的酶量。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件DNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多。提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl），最終濃度150-200mM第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）5‘→3‘的DNA聚合酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)：5‘→3‘

的核酸外切酶活性

3‘→5‘的核酸外切酶活性第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）

大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。有5Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性，3‘

→5‘的核酸外切酶活性，失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

Klenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3‘-OH端外切在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA聚合酶T4-DNA聚合酶

T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA聚合酶T4-DNA聚合酶

T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標(biāo)記第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）

反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）

反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

核酸酶單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）

2+第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

核酸酶雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）

大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘端外切第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

核酸酶雙鏈核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）

λ核酸外切酶特異性地從5‘端外切第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件Zn2+必需核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來(lái)自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）2+最適pH范圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶

S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶

S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

核酸酶單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶

S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）

TdT的基本特性：來(lái)自小牛胸腺

不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件TdT的基本特性：第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

核酸修飾酶堿性磷酸單酯酶(DNA和RNA分子中除去5′-磷酸殘基，即脫磷酸作用)

來(lái)自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP） 來(lái)自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

核酸修飾酶T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）

T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷。

用于探針的末端同位素標(biāo)記：第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件B用于基因克隆的載體3重組DNA技術(shù)所需的基本條件考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件載體的功能及特征載體的功能：運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件載體的功能及特征載體應(yīng)具備的條件：具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征：質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的。絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA。質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件質(zhì)粒質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系。根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件質(zhì)粒質(zhì)粒的不相容性以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件質(zhì)粒質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類：接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由bom和mob基因決定第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

質(zhì)粒

攜帶特殊的遺傳標(biāo)記

野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這 使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性物質(zhì)合成抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建

天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn) 少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往 往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。 目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu) 建的：pSC101ColE1

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因Tcrr6.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Aprr第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

質(zhì)粒質(zhì)粒的分類

人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：

高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因

低拷貝質(zhì)粒來(lái)自pSC101拷貝數(shù)小于10表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒測(cè)序質(zhì)粒整合質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒探針質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便于外源基因的整合裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件裝有報(bào)告基因便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體

第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件質(zhì)粒第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便沸水浴法質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化

氯化銫密度梯度離心法：用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過(guò)夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNA第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化堿溶法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染 色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無(wú)DNase的RNase去除殘余的RNA第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁沸水浴40秒鐘離心，用無(wú)菌牙簽挑去沉淀物乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開(kāi)發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的λ噬菌體DNAλ噬菌體的生物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體λ噬菌體由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成λ-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸λ-DNA上至少有61個(gè)基因第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件λ噬菌體生物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

噬菌體或病毒DNA

λ噬菌體生物學(xué)特性：感染周期第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

噬菌體或病毒DNA

λ噬菌體生物學(xué)特性：感染周期第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNAλ噬菌體生物學(xué)特性：溶原狀態(tài)λ噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由λ-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開(kāi)放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變?chǔ)?DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶菌狀態(tài)DNA重組技術(shù)一般需要λ噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNAλ-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將λ-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

噬菌體或病毒DNAλ-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度插入型載體第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

噬菌體或病毒DNA

λ-DNA載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度取代型載體第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNAλ-DNA載體的構(gòu)建：刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的λ-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶切位點(diǎn)第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNAλ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型λ-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是λ-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容

λ-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNAλ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記imm434imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的λ-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，λ-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNAλ-DNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記lacZlacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，能催化無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體λ-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNAλ-DNA載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型λ-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種λ-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

噬菌體或病毒DNA

λ-DNA載體的主要類型：

取代型載體：λEMBL4、λgtλc、λNM762、Charon40正選擇型載體：λEMBL1、λL47、λ1059野生型的λ噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi++），這種生長(zhǎng)抑制表型受λ-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi--表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑。插入滅活型載體：Charon2、Charon6、λgt11第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNAλ-DNA重組分子的體外包裝：λ-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了λ噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組λ-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組λ-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件密度已達(dá)1013

-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解噬菌體或病毒DNAλ-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入λ噬菌體或重組λ噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放λ-DNA乙醇或異丙醇沉淀λ-DNA第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNAλ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組λ-DNA分子的篩選較為方便重組λ-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便λ-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀2700個(gè)外殼蛋白分子M13噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成M13噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)M13DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

M13噬菌體的生物學(xué)特性：感染周期第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件M13DNA載體的構(gòu)建：第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用。M13重組分子篩選簡(jiǎn)便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大。但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

噬菌體或病毒DNA

與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病毒基因組DNA。 動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類：?jiǎn)捂淒NA病毒單鏈RNA病毒雙鏈DNA病毒雙鏈RNA病毒

RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件考斯質(zhì)粒與噬菌粒λ-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。

在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長(zhǎng)度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有λ-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體。cossite-carryingplasmid1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建1.8kb的λ-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像λ-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）通過(guò)克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件

考斯質(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）

重要的噬菌粒載體：pBluescript體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT7噬菌體啟動(dòng)子PT3和PT7強(qiáng)化外 源基因的轉(zhuǎn)錄。提取出來(lái)的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄。第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件人造染色體載體

人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。

將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件人造染色體載體細(xì)菌人造染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300kb之間。各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝。pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（genecluster）結(jié)構(gòu)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù)第三章-重組DNA技術(shù)所需的基本條件YAC載體應(yīng)含有下列元件：

人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）

酵母人造染色體的構(gòu)建：酵母染色體的端粒序列酵母染色體的復(fù)制子酵母染色體的中心粒序列酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子

大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC