電鏡生物技術方法

電鏡生物技術方法與細胞超微結構E-mail：woodzs@163.com2011.9.23電鏡在生物醫(yī)學中的應用電子顯微鏡和生物樣品制備技術的發(fā)展和應用，不僅揭示了生物細胞中各種細胞器的超微平面和立體結構，而且做到了對生物大分子，特別是核酸、蛋白質、酶、抗原和受體等在超微結構中的準確定位、定性和定量。目前，電鏡技術的應用已遠遠超出細胞學、組織學、病理學和微生物學的范疇，向細胞生物學、分子生物學、分子遺傳學、生理和藥理等學科擴展，成為生物學、基礎醫(yī)學與臨床醫(yī)學等領域的重要研究手段。

電鏡的缺點觀察范圍小，價格高；電子束輻射損傷；圖像分析困難；制樣技術限制；制樣技術決定了樣品的結構和反差，目前已有的制樣技術中最佳分辨率也僅在2~3nm，還無法與電鏡的高分辨能力相匹配。樣品制備的目的1.獲得足夠薄的樣品，以利于電子束穿過；2.脫水，減少水分子對真空系統(tǒng)的破壞；3.固定，保存細胞的超微結構電鏡生物樣品制備方法分類

TEM樣品制備法超薄切片負染電鏡細胞化學免疫電鏡冷凍技術X射線微區(qū)分析掃描電鏡制樣技術SEM樣品制備法一.超薄切片技術超薄切片技術(TheTechniquesofUhrathinSection)是透射電鏡生物樣品制備技術中最重要、最基本、最常用的技術。操作流程：取材→固定→脫水→浸透→包埋→聚合→修快→半薄切片→染色→定位→超薄切片→染色→觀察超薄切片制作流程1.取材取材是超薄切片制備的第一步，組織結構是否保存完好直接關系到實驗結果的可靠性，因此是非常關鍵的一步。首先將組織剪切成1mm3大小的組織塊，迅速投入3%戊二醛（4℃）中固定。取材過程中要求動作迅速準確，組織塊不能過大，并盡量在低溫下操作。2.固定

目的:是防止細胞自溶，穩(wěn)定細胞成分，較好的保存組織細胞的超微結構固定劑的作用:與某些蛋白質、脂質等生物大分子發(fā)生交聯(lián)，迄今尚未發(fā)現(xiàn)能夠對細胞內所有活性物質起固定作用的全能固定劑，因此目前常采用戊二醛-四氧化鋨雙固定的方法。戊二醛能夠較好的保存糖原、核糖體，對微管及內質網(wǎng)等細胞膜系統(tǒng)和細胞基質有良好的固定作用；四氧化鋨對蛋白質、脂肪、脂蛋白和核蛋白固定效果較好，對樣品有較強的電子染色作用，能增強圖像反差。其他還包括甲醛、多聚甲醛、高錳酸鉀等。常用固定劑戊二醛：能與蛋白質分子的氨基和肽鍵連接形成交聯(lián)，能夠較好的保存糖原、核糖體，對微管及內質網(wǎng)等細胞膜系統(tǒng)和細胞基質有良好的固定作用；特點是滲透快、能良好地保存結構、使用條件較隨意，因而適用范圍廣。商品戊二醛呈淺黃色，pH4.5～5.0，最好在4℃條件下避光保存。當戊二醛的顏色變至深黃，pH降至3.5以下時，說明已失效，不宜再用。為了維持樣品的生理滲透壓，使用戊二醛時常用緩沖液配制成2％～3％，但對于有特殊要求的樣品，可以在1%～5%之間選擇。建議最好在臨用之前配制新鮮的固定液，以提高效力。戊二醛用戊二醛固定時，一般以4℃為宜，固定的時間短可幾分鐘至幾十分鐘，長可達幾日，甚至數(shù)周，所以常用于樣品的前固定、臨床病理速檢固定和野外作業(yè)固定等。戊二醛除了對保持細胞的細微結構良好之外，還能保存某些酶的活性。因此經(jīng)戊二醛固定的材料(但固定劑的濃度要低)，也可以用來做組織化學方面的測定。但如果做形態(tài)組織結構方面的電鏡觀察，那么通常在用戊二醛固定之后，接著再用1—2％的鋨酸重復固定0.5一2小時。但在固定之前，一定要把殘留在細胞內的微量戊二醛洗干凈，因為戊二醛和鋨酸會起反應，形成黑色沉淀，毀壞樣品的影象。常用固定劑四氧化鋨：又稱鋨酸，對蛋白質、脂肪、脂蛋白和核蛋白固定效果較好，對樣品有較強的電子染色作用，能增強圖像反差。滲透速率較醛類要慢得多，所以常用于后固定，并且在固定之前必須把樣品切成小于lmm3的塊狀。四氧化鋨對皮膚和粘膜有刺激作用，操作時要格外小心，最好使用通風櫥，并戴防護手套。一般配制1％的四氧化鋨固定液1.組織：切成1mm3大小，3%戊二醛4℃固定2小時；2.細胞：106以上的細胞，尖底離心管，1000轉/min離心10min，將3%戊二醛沿管壁緩緩加入，防止沖散細胞團，4℃固定2小時固定良好的細胞超微結構的形態(tài)特征

細胞器

形態(tài)特征細胞質膜三層結構清晰，沒有斷裂，層間隙基本均勻細胞質基質微粒均勻密布，沒有空白區(qū)域粗面內質網(wǎng)腔呈扁平狀，上面附著核糖核蛋白體顆粒線粒體外周雙層膜和內嵴完整，無膨脹和收縮，基質致密，無空白區(qū)域細胞核雙層膜完整，顯示核膜孔，膜間隙均勻，核染色質濃密，3.脫水

目的：含水的生物樣品放入電鏡高真空時，樣品會急驟收縮并產生水蒸氣，嚴重破壞鏡筒高真空環(huán)境，造成鏡筒污染；電鏡常用的包埋介質絕大多數(shù)不溶于水。具體的脫水程序為：

50％乙醇5～10分鐘；

70％乙醇5～10分鐘；

90％乙醇5～10分鐘；

90％乙醇＋90％丙酮（1：1）5～10分鐘；

90％丙酮5～10分鐘；

100％丙酮10～15分鐘；以上步驟均在4℃進行100％丙酮10～15分鐘（在室溫進行）；4.包埋與聚合

目的：利用包埋劑逐步取代組織細胞中的脫水劑，并在高溫下聚合成適宜機械切割的包埋塊。包埋劑能對樣品內各種結構進行堅固的支持，使其能承受切割和耐受電子束的轟擊。常用包埋劑包括樹脂618、Epon812和Spurr，其中Epon812由于滲入組織較快，折光性較好，聚合塊硬度適中等特點應用較廣。高溫聚合時一般采用溫度梯度聚合，35℃，12小時；45℃，12小時；60℃，24小時。包埋板包埋塊5.超薄切片

超薄切片是為電鏡觀察提供極薄的切片樣品的專門技術，利用超薄切片機可以將包埋好的樣品切制成70nm厚度的切片，放置于附著薄膜的銅網(wǎng)上。超薄切片刀包括鉆石刀和玻璃刀兩種，前者硬度大耐用但價格昂貴，后者刀刃較脆不耐用，但價格低廉。超薄切片機鉆石刀載網(wǎng)載網(wǎng)是用來支持切片的金屬網(wǎng)，包括銅網(wǎng)、鎳網(wǎng)、銀網(wǎng)及不銹鋼網(wǎng)等，常用規(guī)格為230目的銅網(wǎng)。支持膜支持膜是一種能支持觀察樣品的薄膜，厚度約20nm。性能良好的應具備高透明度，在電鏡下無可見結構，與所支持的各種樣品不產生化學反應常用支持膜：formar、碳膜、火棉膠基底碳膜、微篩膜和單孔及大孔銅網(wǎng)制模等銅網(wǎng)6.電子染色

由于透射電鏡是根據(jù)電子束照射到樣品后，樣品各部分散射電子的多少來成象的，而生物組織是由碳、氫、氧、氮等輕元素所組成，散射電子能力較弱，未經(jīng)染色的片子電鏡下反差很弱，難以看清微細結構。目前常采用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染法。染色的目的讓被分析樣品結合上一些重金屬，以增加其反射電子的能力，使樣品成像的襯度變大，最終獲得高質量的電鏡照片。目前常采用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染法。常規(guī)超薄切片技術流程取材：組織1mm×1mm×1mm前固定：3%戊二醛固定液（1/15MPBSpH7.2-7.4）2小時4℃清洗：1/15MPBS+0.19M蔗糖緩沖液pH7.2-7.42小時或過夜4℃后固定：1%OsO4固定液（0.24MPBSpH7.2-7.4）2小時4℃系列乙醇、丙酮脫水：50、70、90、100%10—15分鐘/次4℃浸透、包埋：Epon812/環(huán)氧樹脂618/水溶性樹脂聚合：35℃、45℃各12小時；60℃24小時超薄切片：切片厚度60—70nm重金屬染色：醋酸雙氧鈾5-10分鐘；檸檬酸鉛5分鐘二．負染技術負染又稱陰性反差染色，它是利用高密度的重金屬鹽（如磷鎢酸）包圍生物細胞，在暗背景中顯示出細胞的超微結構。負染圖像正好與超薄切片正染色相反，細胞結構呈透明淺色，而背底為黑色或灰色。該法操作簡單、快速、省時、分辨力較高，廣泛應用于生物大分子觀察，病毒、細菌等快速診斷工作中。染色原理制備方法1.制備懸浮液；2.將懸液滴加到帶有支持膜的銅網(wǎng)上；3.染色：0.5-3%磷鎢酸（PTA）（水溶液或磷酸緩沖液）pH6.4—7.0染色1-2分鐘。注意事項1.pH值：略偏酸對病毒負染的效果較好。2.樣品的純度和濃度：雜質多對染色產生干擾；濃度高樣品成堆影響觀察；濃度低尋找樣品困難。3.樣品的均勻性：由于火棉膠膜是疏水膜，樣品在膜上易凝聚成團塊，無法觀察微細結構。用0.01%BSA稀釋可以加強擴散作用。三、冷凍技術電鏡生物樣品常規(guī)制樣中，各種化學固定劑對細胞成分的固定是有選擇性的，易造成某些可溶性成分和部分生物大分子的丟失和重新分布，在很大程度上限制了它在細胞化學、免疫細胞化學及X射線微區(qū)分析等研究中的應用。脫水對樣品的影響常規(guī)制樣與冷凍制樣對比采用低溫固定法使樣品中的水以固態(tài)形式存在或去除。優(yōu)點：快速冷凍固定速度比化學固定快約1000倍，可以在極短時間內固定組織，將自溶減少到最低；冷凍固定可以較好地保存組織細胞內的抗原和酶的活性，是免疫電鏡細胞化學最佳方法；冷凍固定不會引起細胞內化學成分的改變，使可溶性及游離性元素不發(fā)生丟失和移位，是進行細胞內X-射線微區(qū)分析的最佳方法；常規(guī)制樣方法經(jīng)固定劑和脫水劑處理后樣品收縮，而冷凍技術能避免細胞變形滿足形態(tài)學完美的要求。冷凍技術主要包括冷凍超薄切片、冷凍蝕刻和冷凍置換技術。1.冷凍超薄切片技術1952年Fernandez和Moran首先采用該技術方法。經(jīng)不斷改進和完善，特別是80年代以后國內引進了該技術，從而推動了我國的電鏡細胞化學、免疫電鏡細胞化學、X-射線微區(qū)分析等研究工作的進展。冷凍超薄切片技術是用快速冷凍固定取代或減少化學固定，取消了有機溶劑脫水、樹脂浸透、包埋等步驟分類1.樣品不經(jīng)過任何處理直接冷凍固定，然后進行超薄切片，適用于橡膠、塑料等彈性材料和高分子材料，以及生物材料中進行放射自顯影和X射線微區(qū)分析的樣品；2.醛固定和冷凍保護劑處理，然后進行冷凍固定和超薄切片，適用于進行形態(tài)學研究和細胞化學、免疫化學研究。組織：1×1×1mm3懸液滴固定：2.5%戊二醛固定液或戊二醛﹢多聚甲醛固定液清洗：相應的緩沖液冷凍保護3%甘油、蔗糖、二甲基亞砜、5%PVP快速冷凍固定：KF80或MM80E冷凍超薄切片80～100nm樣品溫度-100～-110℃刀溫度-80～-90℃撈片：飽和蔗糖滴清洗：蒸餾水電鏡細胞化學染色電鏡免疫細胞化學染色TEM觀察形態(tài)學電鏡細胞化學免疫電鏡細胞化學重金屬染色冷凍干燥TEM觀察微量元素分析形態(tài)學冷凍超薄切片技術2.冷凍蝕刻技術利用在冷凍條件下樣品變得又脆又硬時，用刀劈裂樣品，斷裂常發(fā)生在細胞冷凍后較脆弱的部位，多數(shù)情況下沿細胞及細胞器的膜裂開；它既可以在掃描電鏡下觀察三維立體結構，又可以在斷裂后做超薄切片在透射電鏡下觀察二維平面結構，還可以做冷凍斷裂免疫電鏡技術。操作程序：冷凍斷裂→蝕刻→復型特點該技術能得到膜內部和細胞內部的三維結構像，是研究生物膜大分子結構、細胞連接裝置和細胞骨架等結構的有力工具和手段。它還可以與免疫金標記技術相結合產生冷凍斷裂標記技術，從而能夠顯示細胞膜表面大分子物質，如受體、抗體以及其它化學基團的分布情況。該技術樣品制備周期短，還具有分辨力高、斷裂面凹凸不平，立體感強、圖象清晰、復型膜能耐受電子束轟擊和便于長期保存的優(yōu)點。冷凍斷裂冷凍蝕刻在真空中使樣品表面的冰升華，暴露出斷裂面上細胞的超微結構。最佳蝕刻深度30nm，深度不夠，超微結構沒有充分暴露，觀察時圖像模糊；深度過大，超微結構與基礎高低相差懸殊，因支持力不足容易倒塌。真空，-100℃冷凍復型采用電子透明的薄膜將樣品表面結構“鑄印”下來，復制的這層薄膜就相當于表面結構的一個“模子”，稱為復型。特點：制樣簡便，不損傷樣品，圖像立體感強。常采用45°角噴鉑，90°角噴碳制備方法取材：1mm×1mm×3mm固定：1-3%戊二醛固定液2小時4℃清洗：1/15MPBS(pH7.2-7.4)冷凍保護：30%甘油-生理鹽水12小時4℃冷凍固定：樣品放入LN2中冷凍斷裂：高真空1×10–5Torr，樣品升溫到-100—-110℃蝕刻：繼續(xù)升溫到–90—-100℃，樣品表面冰升華碳-鉑復型膜：噴鉑45°角1次噴碳90°角3-5次腐蝕：次氯酸鈉溶液腐蝕樣品清洗和撈膜：蒸餾水清洗兩次復型膜并撈膜到400目銅網(wǎng)上心肌細胞膜上的鈣離子通道脂滴與內質網(wǎng)3.冷凍置換技術在低溫條件下，使生物樣品中結成冰的水分逐步被有機溶劑取代以達到脫水的目的。它既可以保存細胞生活狀態(tài)時的良好超微結構，又可以滿足免疫電鏡細胞化學和細胞X-射線微區(qū)分析的要求。冷凍置換后的樣品可以常規(guī)包埋，也可經(jīng)臨界點干燥處理，噴鍍后作掃描電鏡觀察。置換液：丙酮、OSO4

、戊二醛、甲醇等有機溶劑置換溫度和時間：-90℃48小時-30℃3小時0℃升溫速率：5℃/小時四.電鏡細胞化學技術通過酶的特異細胞化學反應顯示酶在細胞內的定位的電鏡細胞化學稱電鏡酶細胞化學。利用各種化學和物理方法，使細胞內各種成分在原位形成電子密度大的、可見的最終產物，即金屬沉淀物，然后借助電子顯微鏡進行觀察分析。電鏡細胞化學技術可以顯示的酶多屬水解酶、氧化還原酶和轉移酶。目前，在細胞超微結構上能夠定位的酶約有80多種?；痉椒ㄈ〔摹M織切成1mm×1mm×2mm固定——2%戊二醛（二甲砷酸鈉緩沖液）pH7.2-7.4/戊二醛+多聚甲醛漂洗組織——0.01M二甲砷酸鈉緩沖液pH7.44℃2小時或過夜預切片——振動切片、冷凍切片、恒溫切片切片厚度20—40um預孵——切片浸入無底物的孵育液中20℃18-24小時孵育——切片放入孵育液中，在恒溫水浴箱中孵育。孵育時間和溫度，根據(jù)不同反應來確定。漂洗——孵育液的緩沖液洗2—3次，每次5分鐘，再用0.01M二甲砷酸鈉緩沖液洗2—3次，4℃。后固定——1%OsO44℃1小時脫水、包埋、切片和染色——均按常規(guī)超薄切片法制備樣品。冷凍超薄切片和冷凍置換法也可以進行電鏡細胞化學。五.免疫電鏡技術

Singer在1959年首先建立鐵蛋白標記技術，開創(chuàng)了免疫電鏡技術。1968年Nakane首先將免疫酶標記抗體技術應用于電子顯微鏡。該技術利用抗原抗體特異性結合的原理，在超微水平精確定位、定性和半定量。1971年Faulk等將膠體金標記抗體技術應用到電鏡中，開始了膠體金標記免疫電鏡技術。該技術的優(yōu)點是：膠體金顆粒致密，易于辨認，定位比酶記標反應物更精確，同時還可以做定量分析；根據(jù)金顆粒各種大小不同直徑（3-150nm），可以在同一切片上分別標記不同的抗體做雙標記或多標記。Antigen1stantibody2ndantibodylabel2ndantibodylabel

免疫電鏡膠體金標記法可以分為包埋前法和包埋后法。包埋前法是標記細胞表面抗原，樣品先與一抗、二抗結合，然后再按常規(guī)超薄切片術進行生物樣品的脫水、包埋和切片；包埋后法的操作程序與其正相反，主要標記細胞內各種細胞器上的抗原。膠體金標記免疫電鏡技術還可以用到冷凍超薄切片、冷凍置換、冷凍蝕刻和掃描電鏡樣品制備中。六.X射線微區(qū)分析該技術屬于分析電鏡技術。它的特點是在電鏡觀察樣品超微結構的同時，還可以分析微小區(qū)域內的化學元素。它的原理是電鏡內高速細電子束轟擊樣品表面的微小區(qū)域，使該區(qū)域所含元素發(fā)射一定波長的X射線，通過檢測發(fā)射的X射線波長和強度，便可了解該微小區(qū)域內所含元素的種類及含量。樣品制備方法有常規(guī)透射、掃描電鏡樣品制備法；冷凍制樣法包括冷凍超薄切片、冷凍置換及冷凍干燥法。優(yōu)點在電鏡下進行形態(tài)觀察的同時，能對一定結構內的元素進行測定，從而獲知超微結構變化與其組成元素變化的關系。可在不破壞樣品的結構和保持各種元素原有分布的情況下進行分析。分析技術較為靈敏，可分辨小于1μm區(qū)域內質量約10克元素，分析面積可小至100-200nm。七.掃描電鏡生物樣品制備

1935年第一臺掃描電子顯微鏡誕生。掃描電鏡的原理是：在真空下電子經(jīng)電子光學系統(tǒng)形成極細的電子束,照射并聚焦于樣品表面上產生二次電子信號，二次電子的多少，隨入射樣品表面的凹凸狀態(tài)而變化，經(jīng)二次電子檢測器收集二次電子信號，變成顯像管的圖象信號。由于SEM景深長，其圖像層次豐富，立體感強，可觀察生物樣品表面及其斷面的三維立體結構。

冷凍→割斷↑↓取材→清洗→固定→脫水→干燥→粘膠→鍍膜→SEM觀察↓組織導電脫水管道鑄型鍍膜SEM生物樣品制備基本方法組織懸液