生物（人教版選修3）課件1.1DNA重組技術(shù)的基本工具

專(zhuān)題一基因工程1．1

DNA重組技術(shù)的基本工具1．認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開(kāi)理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。2．簡(jiǎn)述DNA重組技術(shù)所需三種基本工具的作用。3．簡(jiǎn)述基因工程中載體需要具備的條件。一、基因工程的概念基因工程的別名

技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程剪切→

→

→表達(dá)結(jié)果人類(lèi)需要的新的

和________DNA重組基因DNA分子水平拼接導(dǎo)入生物類(lèi)型生物產(chǎn)品1．從DNA結(jié)構(gòu)及配對(duì)方式的角度分析，為什么不同生物的DNA能夠重組？提示：(1)基本結(jié)構(gòu)相同。(2)空間結(jié)構(gòu)相同。(3)堿基配對(duì)方式相同。二、DNA重組技術(shù)的基本工具1．限制性核酸內(nèi)切酶(也稱(chēng)“限制酶”)(1)來(lái)源：主要來(lái)自于

。(2)種類(lèi)：約

種。(3)特點(diǎn)：具有專(zhuān)一性。表現(xiàn)在兩個(gè)方面：①識(shí)別雙鏈DNA的某種

序列。②切割特定核苷酸序列中的特定位點(diǎn)。(4)作用：斷裂

的兩個(gè)核苷酸之間的

。(5)結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或

。原核生物4000特定核苷酸特定部位磷酸二酯鍵平末端2．DNA連接酶——“分子縫合針”(2)作用：形成

。(3)結(jié)果：形成重組DNA分子。磷酸二酯鍵3．基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”(1)作用：攜帶

片段進(jìn)入受體細(xì)胞。(2)種類(lèi)：

、

的衍生物、動(dòng)植物病毒等。(3)特點(diǎn)：①能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行

或整合到

上，隨染色體DNA進(jìn)行

。②有

限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段(基因)插入。③具有特殊的標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。外源基因質(zhì)粒λ噬菌體自我復(fù)制染色體DNA一個(gè)至多個(gè)2．為什么在使用限制酶時(shí)，每種酶的切割位點(diǎn)最好只有一個(gè)？提示：若用于切割載體的限制酶有多個(gè)切割位點(diǎn)，則切割后質(zhì)?？赡軙?huì)丟失某些片段，若丟失的片段含有復(fù)制原點(diǎn)，則重組DNA分子進(jìn)入受體后便不能進(jìn)行自主復(fù)制。一、幾種工具酶的作用比較1．限制性核酸內(nèi)切酶與DNA連接酶的比較(1)區(qū)別：作用應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂用于提取目的基因和切割載體DNA連接酶在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵用于基因表達(dá)載體的構(gòu)建(2)兩者的關(guān)系可表示為：2．限制性核酸內(nèi)切酶與解旋酶的比較(1)相同點(diǎn)：都是作用于DNA分子中的化學(xué)鍵。(2)不同點(diǎn)：作用部位不同，前者作用于磷酸二酯鍵，后者作用于氫鍵。3．DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)催化兩個(gè)脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵不同點(diǎn)模板不需要模板需要DNA的一條鏈為模板作用對(duì)象游離的DNA片段單個(gè)的脫氧核苷酸作用結(jié)果形成完整的DNA分子形成DNA的一條鏈用途基因工程DNA復(fù)制4.四種酶的作用部位圖解(1)作用于a(磷酸二酯鍵)的酶有：限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶。(2)作用于b(氫鍵)的酶有解旋酶?！咎貏e提醒】(1)限制性核酸內(nèi)切酶是一類(lèi)酶而不是一種酶。(2)限制性核酸內(nèi)切酶作用的化學(xué)鍵為磷酸二酯鍵，而不是氫鍵。(3)DNA連接酶無(wú)識(shí)別的特異性，凡兩個(gè)黏性末端(或平末端)能互補(bǔ)配對(duì)，DNA連接酶就能催化其“縫合”，重新形成DNA分子。(4)氫鍵的形成不需要DNA連接酶。

下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：限制酶BamHⅠHind

ⅢEcoRⅠSma

Ⅰ識(shí)別序列及切割位點(diǎn)↓

GGATCCCCTAGG

↑↓

AAGCTTTTCGAA

↑↓

GAATTCCTTAAG

↑↓CCCGGGGGGCCC↑(1)一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有______個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。(2)若對(duì)圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越______。(3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Sma

Ⅰ切割，原因是___________________________________。(4)與只使用EcoRI相比較，使用BamHⅠ和Hind

Ⅲ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止________________________________________________。(5)為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入______酶。(6)現(xiàn)使用BamHⅠ和Hind

Ⅲ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA，并經(jīng)拼接獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行再次酶切，假設(shè)所用的酶均可將識(shí)別位點(diǎn)完全切開(kāi)，請(qǐng)根據(jù)圖1、2中標(biāo)示的酶切位點(diǎn)及表中所列的識(shí)別序列，對(duì)以下酶切結(jié)果作出判斷：①采用BamHⅠ和Hind

Ⅲ酶切，得到______種DNA片段。②采用EcoRⅠ和Hind

Ⅲ酶切，得到______種DNA片段。解析：(1)該質(zhì)粒為環(huán)狀DNA，經(jīng)SmaⅠ切割前，不含有游離的磷酸基團(tuán)，經(jīng)SmaⅠ切割后形成平末端，含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。(2)SmaⅠ識(shí)別的是CCCGGG序列，在C與G之間切割，SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，也就是C－G堿基對(duì)越多，C與G之間的氫鍵(3個(gè))比A與T之間的氫鍵(2個(gè))數(shù)量多，其含量越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越高。(3)據(jù)圖1可知，SmaⅠ切割位點(diǎn)在抗生素抗性基因(標(biāo)記基因)中，據(jù)圖2可知，SmaⅠ切割位點(diǎn)在目的基因中，因此使用SmaⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因。(4)用同一種限制酶處理質(zhì)粒和外源DNA，再用DNA連接酶連接時(shí)，往往會(huì)有三種連接形式：目的基因—質(zhì)粒、目的基因—目的基因(環(huán)化)、質(zhì)粒—質(zhì)粒(環(huán)化)，后兩種是我們不需要的，因而要進(jìn)行篩選。用兩種限制酶處理質(zhì)粒和外源DNA，因形成的末端不同可避免上述情況的發(fā)生。(5)連接質(zhì)粒與目的基因的工具酶是DNA連接酶。(6)分析由BamHⅠ和Hind

Ⅲ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA，并經(jīng)拼接獲得的重組質(zhì)粒，這兩種酶的識(shí)別序列仍然完整存在，如再用BamHⅠ和Hind

Ⅲ兩種限制酶進(jìn)行酶切時(shí)，可再度被切開(kāi)，形成2種DNA片段；而EcoRⅠ的識(shí)別序列在原質(zhì)粒中存在并沒(méi)有破壞，同時(shí)切下的目的基因中還存在1個(gè)EcoRⅠ的識(shí)別序列，因此在重組質(zhì)粒中存在2個(gè)EcoRⅠ的識(shí)別序列，如用EcoRⅠ和Hind

Ⅲ酶切，可得到3種DNA片段。答案：(1)0、2

(2)高(3)SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因(4)質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化(5)DNA連接(6)①2

②3【歸納拓展】(1)限制酶切割形成黏性末端的幾種類(lèi)型：①不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同。②同一個(gè)DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。③不同限制酶切割不同DNA分子形成相同黏性末端，如互補(bǔ)則可以相互重新配對(duì)。(2)切割質(zhì)粒時(shí)，標(biāo)記基因不能全部被破壞。1．下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是(

)A．①②③④

B．①②④③C．①④②③ D．①④③②解析：本題考查不同工具酶的作用及作用特點(diǎn)。圖示中①表示該酶切割DNA分子雙鏈產(chǎn)生黏性末端的過(guò)程，用到的酶是限制性核酸內(nèi)切酶，②是黏性末端連接的過(guò)程，用到的酶是DNA連接酶，③是DNA分子解旋的過(guò)程，要用解旋酶，④是DNA復(fù)制時(shí)子鏈的形成過(guò)程，需要DNA聚合酶。答案：C二、基因工程中常用的載體——質(zhì)粒1．種類(lèi)(1)常用載體：質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。(2)其他載體：λ噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等。3．作用(1)用它作為運(yùn)輸工具，將目的基因送入受體細(xì)胞中去。(2)利用它在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制?！咎貏e提醒】一般來(lái)說(shuō)，天然載體往往不能滿(mǎn)足上述要求，因此要根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)載體進(jìn)行人工改造，現(xiàn)在所使用的質(zhì)粒幾乎都是經(jīng)過(guò)改造的。

質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，它存在于許多細(xì)菌體內(nèi)。質(zhì)粒上有標(biāo)記基因如圖所示，通過(guò)標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)入成功。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況也不同，下表是外源基因插入位置(插入點(diǎn)有a、b、c)，請(qǐng)根據(jù)表中提供的細(xì)菌生長(zhǎng)情況，推測(cè)①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)，正確的一組是A．①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況①能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)②能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)③不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)解析：對(duì)①細(xì)菌來(lái)說(shuō)，能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，也能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明抗氨芐青霉素基因和抗四環(huán)素基因都沒(méi)有被破壞，插入點(diǎn)是c；對(duì)②細(xì)菌來(lái)說(shuō)，能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明其抗氨芐青霉素基因正常，不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明其抗四環(huán)素基因被破壞，插入點(diǎn)應(yīng)為b；對(duì)③細(xì)菌來(lái)說(shuō)，不能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明其抗氨芐青霉素基因被插入而破壞，故插入點(diǎn)為a。答案：A【名師點(diǎn)睛】基因工程所用載體與細(xì)胞膜上載體的比較(1)化學(xué)本質(zhì)不同：作為基因運(yùn)輸工具的載體其化學(xué)本質(zhì)是DNA或動(dòng)植物病毒或λ噬菌體的衍生物，而細(xì)胞膜上的載體的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。(2)作用不同：基因工程所用載體是將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中；細(xì)胞膜上的載體是離子或某些小分子進(jìn)出細(xì)胞的運(yùn)輸工具。2．作為基因的運(yùn)輸工具——載體，必須具備的條件及理由是(

)A．能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來(lái)并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因B．具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)C．具有某些標(biāo)記基因，以便為目的基因的表達(dá)提供條件D．能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，以便于進(jìn)行篩選解析：作為載體要攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并使之表達(dá)；必須能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存并大量復(fù)制，以便通過(guò)復(fù)制提供大量目的基因；同時(shí)要具有標(biāo)記基因，是為了通過(guò)標(biāo)記基因是否表達(dá)來(lái)判斷目的基因是否進(jìn)入了受體細(xì)胞，便于篩選。載體要具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，為了便于與外源基因連接。答案：A一、尋根問(wèn)底1．根據(jù)你所掌握的知識(shí)，你能推測(cè)這類(lèi)酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？(教材P4)提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原體的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。2．DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？(教材P6)提示：不是一回事。(1)DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；